微RNA在冠狀動脈微栓塞后心肌損傷的研究進展

【摘要】冠狀動脈微栓塞（CME）多發(fā)生于急性冠脈綜合征患者，因手術(shù)相關(guān)的動脈粥樣硬化斑塊破裂引發(fā)，可導(dǎo)致心律失常、冠狀動脈儲備減少以及心臟收縮功能障礙。CME后常規(guī)擴張冠狀動脈、抗血小板和直接抽吸血栓的臨床療效不理想。研究發(fā)現(xiàn)，微RNA（miRNA）特異結(jié)合炎癥反應(yīng)、凋亡、自噬相關(guān)信使RNA的3?-UTR，最終影響CME預(yù)后。深入研究miRNA在CME發(fā)生和發(fā)展中的作用，不僅可以進一步了解CME后不良預(yù)后機制，并有助于為其藥物治療尋找新的靶點。

【關(guān)鍵詞】冠狀動脈微栓塞；微RNA；炎癥反應(yīng)；凋亡；自噬

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.06.000

MicroRNA-mediated Regulation of Cardiomyocyte Injury Following Coronary Microembolisation

LI Lange^1，2，ZHENG Yaxuan^1，2，LYU"Tingting¹，LI Kun¹，KONG Lingyun¹，ZHOU Boda¹，LIU Fang¹，ZHANG Ping¹，XUE Yajun¹

（1.Department of Cardiovascular Medicine，Beijing Tsinghua Changgung Hospital，School of Clinical Medicine，Tsinghua University，Beijing 102218，China；2.School of Medicine，Tsinghua University，Beijing 100083，China）

【Abstract】Coronary microembolization（CME） occurs in patients with acute coronary syndrome"and is primarily caused by atherosclerotic plaque rupture associated with surgery. CME can lead to arrhythmias，reduced coronary blood flow reserve，and cardiac systolic dysfunction. The clinical efficacies of conventional coronary artery dilation，antiplatelet agents，and direct thrombus aspiration after CME are not satisfactory. Studies have found that microRNA（miRNA） specifically bind to the 3?-UTR of inflammatory response，apoptosis，and autophagy-related messenger RNA，and ultimately affect the prognosis of CME. In-depth study of the role of miRNA in the occurrence and development of CME can not only further understand the mechanism of poor prognosis after CME，but also help to find new targets for its drug treatment.

【Keywords】Coronary microembolization; MicroRNA;Inflammatory;"Apoptosis;"Autophagy

冠狀動脈微栓塞（coronary microembolization，CME）多發(fā)生于經(jīng)皮冠狀動脈介入治療期間，栓子脫落引起遠端微循環(huán)栓塞和心肌微梗死。根據(jù)不同的評估方法、參數(shù)及評估時間，CME在經(jīng)皮冠狀動脈介入圍手術(shù)期的發(fā)生率為5%～70%^[1]。CME引起的“無再流”或“慢再流”現(xiàn)象是急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者不良預(yù)后的獨立預(yù)測因子，且臨床常規(guī)治療手段效果有限。隨著分子生物學(xué)實驗技術(shù)的進展，有研究^[2]證實CME不僅通過物理阻塞、血管收縮誘導(dǎo)心肌損傷，微RNA（microRNA，miRNA）與CME預(yù)后進展密切相關(guān)。綜述從炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及細胞自噬三個方面闡述miRNA對CME后心肌細胞損傷的調(diào)節(jié)，為探索改善CME后心功能障礙提供新的研究方向。

1""miRNA及在CME后表達概述

miRNA是一類大小為21～23"nt的單鏈非編碼RNA，它們主要通過與目標(biāo)基因3?-UTR完全或部分堿基配對，影響信使RNA（messenger RNA，mRNA）的翻譯過程負向調(diào)控基因表達^[3]。動物miRNA形成過程高度保守：（1）RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primary miRNA，pri-miRNA）。（2）RNA聚合酶Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Drosha切割pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)生成pre-miRNA。（3）輸出蛋白5轉(zhuǎn)運細胞核內(nèi)pre-miRNA進入細胞質(zhì)。（4）pre-miRNA被RNA聚合酶Ⅲ型的核酸內(nèi)切酶Dicer切割形成雙鏈miRNA。雙鏈miRNA在輔助蛋白作用下被載入Argonaute（Ago）蛋白中，降解其中一條單鏈，成熟miRNA與Ago形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA induced silencing complex，RISC）降解目標(biāo)mRNA。每個miRNA可有多個靶基因，一個基因也可以受到多個miRNA調(diào)控，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。具有同一miRNA結(jié)合位點的mRNA可以競爭性結(jié)合miRNA反應(yīng)元件（miRNA response element，MRE）進而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄表達，這種競爭相同MRE的mRNA被稱為競爭性內(nèi)源RNA（completing endogenous RNA，ceRNA）。ceRNA沉默時，miRNA通過結(jié)合目標(biāo)RNA的RISC降解靶mRNA。相反ceRNA上調(diào)時，通過結(jié)合miRNA的MRE使靶mRNA水平升高。ceRNA還包括具有相同MRE的其他轉(zhuǎn)錄物，如長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、假基因轉(zhuǎn)錄本以及環(huán)狀RNA等^[4]。Li等^[5]認(rèn)為，內(nèi)源性miRNA可在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在。正常情況下，特定的miRNA在心肌內(nèi)高度表達，心肌梗死后，miRNA由心肌損壞釋放表達下降，而外周循環(huán)miRNA水平升高。miRNA失調(diào)在心臟收縮功能障礙、心肌梗死、心肌肥厚、遺傳性心肌病等多種心血管疾病具有重要的作用^[6]。尤其是對于ACS患者。循環(huán)miRNA通過外泌體、凋亡體、miRNA結(jié)合蛋白或脂蛋白保護免受RNA酶降解^[7]。這些研究結(jié)果提示，miRNA可以作為ACS診斷及治療的潛在靶點。

miRNA被作為參與心血管系統(tǒng)生理、病理發(fā)生發(fā)展的重要因素受到廣泛研究。近來有研究證實miRNA在CME后心肌損傷也發(fā)揮重要作用。自2017年，Su等^[8]在以豬CME模型的心肌組織中發(fā)現(xiàn)有11種miRNA差異性表達明顯，其中ssc-miR-136和ssc-miR-142-3p表達降低，ssc-miR-874、ssc-miR-370、ssc-miR-425-3p等9種表達增加。隨著進一步深入研究，有更多表達改變的miRNA在CME模型中發(fā)現(xiàn)，這些miRNA的靶基因主要與細胞凋亡、炎癥、自噬及纖維化相關(guān)，在CME中發(fā)揮著重要作用。此外，Xue等^[9]認(rèn)為內(nèi)皮祖細胞可通過miRNA治療CME，miR-132抑制劑通過改善心肌重構(gòu)診療心力衰竭，已經(jīng)進入Ⅰ期臨床^[10]，這提示，miRNA還可作為CME的潛在治療靶點。

2 "miRNA對CME心肌損傷的調(diào)節(jié)機制研究

2.1 "miRNA在CME后炎癥反應(yīng)中的作用

炎癥反應(yīng)是CME后心肌損傷的重要機制。CME引起微梗死的典型形態(tài)學(xué)改變?yōu)閴乃溃０橛醒装Y細胞浸潤，甚至焦亡。栓塞顆粒直徑?jīng)Q定血管阻塞部位，進而決定梗死范圍。收縮功能障礙的程度常與急性缺血不匹配，這與心肌炎癥引起心肌收縮功能障礙相關(guān)。CME后梗死灶周圍巨噬細胞和中性粒細胞浸潤釋放腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素（interleukin，IL）等炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)損害相鄰存活心肌細胞的收縮功能，最終，肌原纖維氧化。炎癥信號通路以TNF為中心，還涉及一氧化氮及鞘氨醇，在CME后心肌損傷的進展中具有重要作用。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）被傳感器激活后與適配器凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC），效應(yīng)器半胱天冬酶（caspase）聚合形成經(jīng)典NLRP3炎癥小體。NLRP3傳感蛋白包括三個結(jié)構(gòu)域：氨基末端Pyrin結(jié)構(gòu)域（pyrin domain，PYD），與ASC結(jié)合；中心中央核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域（a central nucleotide binding and oligomerization domain，NACHT），具有ATP激活活性及聚合功能；羧基末端富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域，抑制NACHT功能。一般狀態(tài)下，炎癥小體在LRR結(jié)構(gòu)域的作用下受到抑制。炎癥刺激或創(chuàng)傷刺激下，NLRP3炎癥小體中的活性caspase切割I(lǐng)L生成活性IL-1β和IL-18，引起炎癥。同時切割gasdermin-D（GSDMD）的N端，插入細胞膜，引起細胞焦亡。

近期miRNA通過調(diào)節(jié)炎癥信號通路改善CME后心肌損傷的研究取得一些進展（如圖1）。在多項以大鼠CME為模型的研究表明，Cai等^[11]進一步通過分離大鼠心肌細胞中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)焦亡，通過熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠原染色等方法觀察到CME組及LPS組小鼠心肌組織miR-136-5P下調(diào)，而TNF、IL-6、肌鈣蛋白I上調(diào)，而過表達miR-136-5P減輕心肌細胞炎癥及焦亡。并通過免疫熒光報告基因檢測技術(shù)證實miR-136-5p通過靶向ataxin-1樣（ataxin-1-like，ATXN1L）蛋白，抑制ATXN1L/capicua轉(zhuǎn)錄抑制因子（capicua transcriptional repressor，CIC）軸上調(diào)PYDC1，競爭性抑制NLRP3與ASC結(jié)合而抑制炎癥及焦亡，從而減輕CME引起的心臟損傷^[11]。Chen等^[12]發(fā)現(xiàn)CME后miR-200a-3p下降，其通過抑制硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）/NLRP3軸抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激改善CME后誘導(dǎo)的心肌損傷。Xu等^[13]發(fā)現(xiàn)過表達miR-142-3p可以靶向ATXN1L減輕CME后心肌損傷，而ATXN1L與組蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）結(jié)合促進組蛋白3（histon3，H3）脫乙?；M而抑制核仁蛋白（nucleolar protein 3"，NOL3）表達，促進caspase-1/IL-1β/IL-18信號誘導(dǎo)心肌損傷。Kong等^[14]發(fā)現(xiàn)CME后miR-26a-5p下調(diào)，其結(jié)合高遷移率蛋白A1（high mobility group AT-hook 1，HMGA1）mRNA，調(diào)節(jié)HMGA1/NF-κB/TNF-α通路改善CME后心肌炎癥及損傷。Gao等^[15]發(fā)現(xiàn)川芎嗪預(yù)處理的CME大鼠可抑制miR-34a-5p表達，進而通過Sirt1/eNOS和Sirt1/NF-κB途徑抑制炎癥反應(yīng)，減輕冠狀動脈微血管障礙。Zhou等^[16-17]發(fā)現(xiàn)CME后miR-181a-5p、miR-186-5p上調(diào)，通過靶向X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked Inhibitor of Apoptosis，XIAP）促進焦亡，加重心肌損傷。而lncRNA TUG1通過競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制競爭性與miR-186-5p結(jié)合，減輕CME后心肌炎癥及損傷^[17]。Dai等^[18]發(fā)現(xiàn)CME后miR-30e-3p下調(diào)，其通過抑制HDAC2/SMAD7通路抑制炎癥反應(yīng)。在以豬CME模型中的研究中，Su等^[19]發(fā)現(xiàn)miR-142-3p通過靶向白細胞介素-1受體相關(guān)激酶-1（interleukin-1 receptorassociated kinase 1，IRAK-1）抑制IRAK-1/NF-κB信號通路，減輕CME后心肌炎癥反應(yīng)及心肌損傷。而超聲微泡介導(dǎo)的miR-21轉(zhuǎn)染可通過靶向結(jié)合程序性細胞死亡4（programmed cell death 4，PDCD4）mRNA，抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α通路，減輕CME后炎癥及心肌損傷^[20]。

2.2 "miRNA在CME導(dǎo)致凋亡中的作用

經(jīng)典凋亡是一種主動的程序性死亡過程，鏡下有細胞核固縮、染色質(zhì)濃染、凋亡小體形成等表現(xiàn)。心肌細胞凋亡是CME后不良預(yù)后的原因之一，受到凋亡信號通路調(diào)節(jié)。線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路可從不同階段啟動凋亡，最終激活caspase完成凋亡。Bcl-2家族中促凋亡因子及抗凋亡因子的平衡是調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵。抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等通過與BH3-only、Bak蛋白結(jié)合，抑制促凋亡因子活性。當(dāng)受刺激時，促凋亡因子Bak在線粒體膜上聚集，與抑凋亡因子分離，與其他Bak、Bax結(jié)合形成孔蛋白復(fù)合體，使線粒體膜通透性增加而釋放細胞色素C。細胞質(zhì)中細胞色素C與凋亡相關(guān)因子1結(jié)合，募集胞質(zhì)中的caspase誘導(dǎo)細胞凋亡。

近年來，有少量研究提示miRNA通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號通路誘導(dǎo)CME后心肌損傷。Su等^[21]在體外分離的大鼠心肌細胞的研究中，通過qPCR、蛋白質(zhì)印跡、流式細胞技術(shù)等方式發(fā)現(xiàn)，心肌細胞暴露在缺血缺氧后，miR-30e-3p下降，而凋亡水平及caspase增加，而過表達miR-30e-3p時早反應(yīng)生長因子（early growth response factor 1 ，Egr-1）、caspase、凋亡水平下降，這表明miR-30e-3p通過靶向Egr-1降低凋亡改善心肌損傷。Mo等^[22]在人類誘導(dǎo)的多能干細胞來源的心肌細胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CM）的模型中發(fā)現(xiàn)，hiPSC-CM缺氧24"h后miR-30e-5p表達下降，凋亡增加。并通過蟲熒光素酶報告基因測試證實miR-30e-5p直接靶向Bim改善凋亡。Qin等^[23]發(fā)現(xiàn)在大鼠CME模型中miR-29b-3p下降，其上調(diào)后抑制Bax、caspase-3和caspase-9的表達，增加Bcl-2的表達，并通過雙熒光素基因測定技術(shù)證實這一過程通過miR-29b-3p靶向Bcl-2修飾因子（Bcl-2 modifying factor，BMF）實現(xiàn)。損傷信號持續(xù)存在時，BMF分泌增加，通過與抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)其降解，誘發(fā)凋亡^[23]。CME后miR-486-5p的表達下降。通過蛋白質(zhì)印跡法、TUNEL染色發(fā)現(xiàn)過表達miR-486-5p可降低PTEN表達，凋亡心肌細胞數(shù)量減少。證實miR-486-5p通過靶向PTEN激活PI3K/AKT通路抑制凋亡^[24]。

2.3""miRNA在CME誘發(fā)自噬中的作用

自噬是一種細胞內(nèi)的自我降解過程，通過降解細胞內(nèi)老化或受損的細胞器或蛋白質(zhì)生成氨基酸供細胞重復(fù)利用^[25]。根據(jù)所需降解物質(zhì)進入溶酶體的方式可以分為巨自噬、微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬^[26]。巨自噬通過雙分子膜包裹細胞質(zhì)形成“自噬體”，進一步與溶酶體融合進行降解^[27]。微自噬是溶酶體膜直接凹陷形成囊泡，將部分細胞質(zhì)成分包裹進入溶酶體^[27]。分子伴侶介導(dǎo)的自噬直接通過分子伴侶蛋白Hsc70識別溶酶體并引導(dǎo)靶蛋白進入溶酶體進行降解^[27]。在哺乳動物心肌細胞中最常見的是巨自噬，這一過程可分為三個階段：自噬小體的形成、自噬小體膜的延伸、自噬小體和溶酶體膜的融合。即細胞質(zhì)中的線粒體等細胞器脫落部分雙分子膜，逐漸包裹部分細胞質(zhì)、細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成吞噬囊泡組裝位點。自噬相關(guān)基因（autophagy-related"gene，Atg）蛋白介導(dǎo)吞噬體膜延伸形成自噬小體，繼而與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體。自噬溶酶體降解所包含若干內(nèi)容物生成氨基酸及腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）等物質(zhì)供細胞重新利用。正常情況下，心肌細胞處于基礎(chǔ)自噬水平。但當(dāng)外部因素作用于細胞時，自噬水平產(chǎn)生波動，如腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）/ATP升高、氨基酸缺乏等因素均可提高細胞自噬水平。自噬參與心肌細胞能量代謝、心臟發(fā)育、心肌蛋白質(zhì)和細胞器分解代謝等生理過程^[28]。Fernández等^[29]以小鼠為模型的實驗研究表明，Beclin1（F121A）突變破壞了Beclin1-Bcl2結(jié)合，增加了基礎(chǔ)自噬并進一步抑制心臟纖維化。這表明，不足自噬可能是心肌細胞損傷及心功能下降原因之一。CME作為一種刺激因素，能夠降低心肌細胞的自噬水平。在大鼠CME模型中^[30]，通過電鏡觀察及免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)CME后6～12"h，自噬空泡數(shù)量明顯下降，抗LC3-Ⅱ條帶明顯減弱，同時伴有心肌損傷標(biāo)志物升高及射血分?jǐn)?shù)下降，這證實，CME后自噬通量及心功能下降，且前后存在因果關(guān)系。CME后自噬水平降低引起心臟抵抗缺血損傷能力以及心臟重構(gòu)能力下降，對CME后不良預(yù)后具有重大意義。

自噬的活性高度依賴細胞能量及營養(yǎng)狀態(tài)，受到Atg蛋白的緊密調(diào)節(jié)，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。miRNA在多個器官組織中對調(diào)控細胞自噬具有關(guān)鍵作用（如圖2）。在自噬誘導(dǎo)階段，哺乳動物細胞內(nèi)Atg蛋白構(gòu)成的ULK1復(fù)合物及PI3K復(fù)合物在自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，分別調(diào)控自噬起始及成核過程^[25]。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5‘-monophosphate activated protein kinase，AMPK）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）作為調(diào)控自噬誘導(dǎo)階段的重要激酶，可分別通過感知細胞內(nèi)AMP/ATP比值、氨基酸水平調(diào)節(jié)自噬通量。多種上游信號通路通過影響自噬的“門控開關(guān)”mTOR活性調(diào)節(jié)自噬水平。其中，PI3K/AKT通路是自噬調(diào)節(jié)中的主要信號途徑。miRNA通過調(diào)節(jié)自噬不同階段蛋白的表達實現(xiàn)對自噬的調(diào)控：如miR-30a可直接靶向結(jié)合自噬起始及成核階段Atg蛋白Beclin1、PI3K；PTEN可被miR-19a、miR-19b、miR-26a、miR-486-5p等靶向降解，導(dǎo)致PI3K/AKT通路組成性激活誘導(dǎo)自噬^{[24，31-33]}。PDK-1的表達可以被miR-378靶向調(diào)節(jié)，從而抑制AKT激活，促進自噬^[34]，同時miR-378通過靶向半胱天冬酶增加凋亡閾值促進細胞存活^[34-35]。AKT通過調(diào)節(jié)mTOR和FOXO轉(zhuǎn)錄因子對自噬產(chǎn)生重大影響。miR-378調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，進一步影響mTOR/ULK1通路促進自噬的啟動，同時通過FOXO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄增強并維持自噬^[34]。FOXO受到miR-486-5p、miR-149的靶向調(diào)節(jié)^[36-37]，在自噬調(diào)控中具有多方面的作用。Atg9是一種跨膜自噬蛋白，在吞噬囊泡組裝位點及細胞器膜之間雙向運動轉(zhuǎn)運膜脂質(zhì)促進自噬體膜延伸，Yang等^[38]研究發(fā)現(xiàn)Atg9直接被miR-34a抑制影響自噬膜延伸。Atg12-Atg5-Atg16L作為E3樣酶促進Atg8（LC3-Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）結(jié)合生成LC3-PE（LC3-Ⅱ），促進吞噬囊泡閉合成熟。miR-181a可直接下調(diào)Atg5的表達^[39]，抑制自噬體成熟。目前，已有動物實驗研究^[30]證明了自噬在CME后對心功能的影響，并且在以大鼠CME模型的實驗中闡明了miR-30e通過靶向結(jié)合LC3B、Becline蛋白在CME后誘導(dǎo)心功能改變。據(jù)此可見，miRNA通過對Atg的靶向調(diào)控參與CME后心肌損傷。

3 "小結(jié)

綜上所述，在CME后炎癥及凋亡水平增加，自噬水平及心功能下降。miRNA能調(diào)控炎癥、凋亡、Atg蛋白及其上游信號通路，進而影響心肌細胞存活數(shù)量及存活心肌細胞的收縮功能，參與CME后不良預(yù)后的發(fā)生發(fā)展。miRNA受到ceRNA調(diào)節(jié)，形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而一個miRNA可同時靶向多個mRNA。對miRNA在CME發(fā)展過程中的調(diào)控機制的研究有助于為治療CME尋找到新的藥物，探索能夠同時調(diào)節(jié)凋亡、炎癥、自噬水平的miRNA對減輕CME后心肌損傷的具有重要意義。

4 "未來研究及展望

心肌細胞在CME后，其缺血缺氧信號會翻譯為生化信號。有關(guān)CME后不良預(yù)后發(fā)生的分子機制還有待進一步深入探討，為其更加完善理論基礎(chǔ)并提供診療思路。CME作為一種外源性刺激使心肌自噬水平的持續(xù)下降，在CME后的心肌損傷及不良心臟預(yù)后發(fā)揮重要作用，這一過程受到miRNA調(diào)節(jié)。mTOR作為細胞自噬門控分子備受關(guān)注，其受miR-144-3P調(diào)節(jié)，miR-144-3P水平在ACS患者血清中明顯升高^[40]。因此miR-144-3P是否在CME后發(fā)生變化及對診斷和治療CME的意義值得進一步探究。

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收稿日期：2023-08-21