誘導(dǎo)心肌細(xì)胞再生研究進(jìn)展

【摘要】成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞在出生后迅速退出細(xì)胞周期，當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血或其他因素而損傷，殘留存活的心肌細(xì)胞增殖能力十分有限，取而代之的是不具有收縮能力的纖維組織，從而引發(fā)不良心臟重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭。為了改善心力衰竭患者的預(yù)后，開(kāi)發(fā)根本有效的治療策略至關(guān)重要。目前研究已通過(guò)多種方法和模型來(lái)實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的再生，現(xiàn)綜述實(shí)現(xiàn)心臟再生方法的研究現(xiàn)狀，旨在闡明各種操縱心臟再生和促進(jìn)心臟損傷后心臟修復(fù)的策略，并討論未來(lái)臨床應(yīng)用的前景和挑戰(zhàn)。

【關(guān)鍵詞】心臟再生；多能干細(xì)胞；再生醫(yī)學(xué)；重編程

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.08.000

Progress of"Inducing Cardiomyocyte Regeneration

ZHANG Li，XIONG Feng

（Department of Cardiology of The Third People’s Hospital Chengdu，The Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong Vniversity，Chengdu 610031，Sichuan，China）

【Abstract】Adult mammalian cardiomyocytes rapidly withdraw from the cell cycle after birth，When cardiomyocytes are injured by ischemia or other factors，the proliferation ability of surviving cardiomyocytes is very limited，"and they are replaced by fibrous tissue without contractile ability，which causes adverse cardiac remodeling and ultimately leads to heart failure. In order to improve the prognosis of heart failure patients，it is crucial to develop fundamentally effective treatment strategies. At present，many methods and models have been used to realize the regeneration of cardiomyocytes.This review summarizes the research status of the methods of heart regeneration，aims to clarify various strategies for manipulating heart regeneration and promoting heart repair after heart injury，and discusses the prospects and challenges of clinical application in the future.

【Keywords】Cardiac regeneration；Pluripotent stem cell；Regenerative medicine；Reprogramming

近年來(lái)，盡管心血管疾病在診斷和早期預(yù)防方面取得顯著進(jìn)展，但缺血性心臟病的患病率仍在增加，成為全球死亡的主要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2030年，每年將有超過(guò)2 300萬(wàn)人死于心血管疾病^[1]。當(dāng)心肌細(xì)胞（cardiomyocyte，CM）因缺血或其他因素而損傷，殘留存活的CM增殖能力十分有限，損傷后心肌的廣泛重構(gòu)會(huì)限制心肌的收縮能力，最終引發(fā)心力衰竭。藥物治療、左心室輔助裝置以及心臟移植等方法提高了心力衰竭患者的生存率，但目前除心臟移植外，其他治療方法都僅是對(duì)癥治療，以減緩病情進(jìn)展，而患者的長(zhǎng)期預(yù)后仍然較差。因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療方法，以新生CM替代死亡的CM，是對(duì)受損心臟最好的修復(fù)，于是心臟再生的概念被提出。

CM在胎兒時(shí)期分裂旺盛，而在出生后迅速退出細(xì)胞周期，成為具有成人心臟特征的高度結(jié)構(gòu)的有絲分裂后細(xì)胞。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為成人CM增殖能力有限，每年CM的更新率僅0.5%～1%^[2]。與成人心臟不同，斑馬魚(yú)、蠑螈和新生哺乳動(dòng)物的心臟在受傷后表現(xiàn)出強(qiáng)大的再生能力。這些研究重建了包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物心臟再生的信心。

目前，已有大量研究通過(guò)多種模型和策略實(shí)現(xiàn)CM的再生，主要包括：（1）刺激心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CF）轉(zhuǎn)化為CM；（2）干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CM；（3）誘導(dǎo)現(xiàn)有存活CM進(jìn)行再增殖。見(jiàn)圖1?，F(xiàn)就心臟再生方法最新研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并討論未來(lái)臨床應(yīng)用的前景和挑戰(zhàn)。

1 "刺激CF轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞

非心肌細(xì)胞是成體心臟的重要組成部分，其中CF是心肌間質(zhì)的主要細(xì)胞類型。CF除了維持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，還對(duì)各種機(jī)械、電、化學(xué)刺激和細(xì)胞因子做出反應(yīng)，在心肌受損后CF表現(xiàn)出很強(qiáng)的遷移、增殖和分泌特性，這使其成為實(shí)現(xiàn)心臟再生的潛在靶點(diǎn)。

直接重編程又稱轉(zhuǎn)分化，是將一種類型的成熟細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為另一種類型的成熟細(xì)胞，無(wú)需經(jīng)過(guò)典型的干細(xì)胞階段。通過(guò)抑制CF特征性基因表達(dá)并激活心臟遺傳程序，可使CF逐漸失去原有的特性并表現(xiàn)心肌細(xì)胞的特征^[3]。在體外實(shí)驗(yàn)中，多種轉(zhuǎn)錄因子組合已被證實(shí)能誘導(dǎo)CF轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞。幾項(xiàng)獨(dú)立研究將含有轉(zhuǎn)錄因子組合GMT（Gata4、Mef2c和Tbx5）的病毒載體溶液注射到小鼠心肌梗死（myocardial infarction，MI）區(qū)域或邊緣，發(fā)現(xiàn)小鼠心肌內(nèi)CF可直接重新編程為誘導(dǎo)心肌細(xì)胞（induced cardiomyocyte，iCM）^[4-5]。Tani等^[6]研究發(fā)現(xiàn)在GMT組合中添加關(guān)鍵基因Hand2（簡(jiǎn)稱MGTH），可提高體內(nèi)重編程效率，改善心臟功能并逆轉(zhuǎn)纖維化。與GMT相比，MGTH能更早、更有效地誘導(dǎo)出成熟的iCM。Lalit等^[7]研究發(fā)現(xiàn)Mesp1、Tbx5、Gata4、Nkx2.5和Baf60c五種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合可將CF重編程為誘導(dǎo)心臟祖細(xì)胞群，具有分化為心臟三系細(xì)胞和自我更新能力，顯著提高重編程的效率。見(jiàn)圖2。

為了證實(shí)增殖的iCM源自CF，研究使用帶有CF譜系追蹤基因的小鼠來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠心肌內(nèi)增殖的iCM均源自CF，并且約50%的iCM與內(nèi)源性CM相似，具有良好的肌節(jié)結(jié)構(gòu)和線粒體。成熟的iCM在細(xì)胞收縮、電生理特性以及與內(nèi)源性CM的功能偶聯(lián)方面與成人心室CM相似^[6]。體內(nèi)誘導(dǎo)的iCM在形態(tài)和功能上更接近成熟的CM，更能改善心臟收縮功能，這表明體內(nèi)微環(huán)境可能促進(jìn)了心臟重編程的質(zhì)量。

此外，調(diào)節(jié)某些關(guān)鍵的非編碼RNA和表觀遺傳修飾可提高非心肌細(xì)胞的重編效率。研究發(fā)現(xiàn)GMT聯(lián)合miR-133能夠促進(jìn)CF的基因表達(dá)，并提高重編程效率^[8]。表觀遺傳因素可通過(guò)組蛋白甲基化、乙酰化和泛素化來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，如：減少Bmi1表達(dá)會(huì)改變心肌基因的組蛋白修飾，從而提高重編程效率^[9]。

盡管在嚙齒動(dòng)物中誘導(dǎo)CF重編程為心肌細(xì)胞的研究取得一定進(jìn)展，但這些方法在人類心臟疾病中的應(yīng)用仍有許多問(wèn)題待解決：（1）小鼠和人類細(xì)胞環(huán)境的差異，如染色質(zhì)、蛋白質(zhì)組成和代謝等；（2）體內(nèi)重編程的效率問(wèn)題；（3）轉(zhuǎn)化后iCM的安全性和穩(wěn)定性；（4）iCM功能成熟性問(wèn)題，如iCM與正常CM的電耦合是否會(huì)引起心律失常等。

2 "干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞

干細(xì)胞生物學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)展迅速，在特定誘導(dǎo)條件下，干細(xì)胞可定向分化成有收縮功能的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，對(duì)心臟再生治療具有巨大潛力。目前用于心臟再生研究的干細(xì)胞主要分為內(nèi)源性干細(xì)胞[包括內(nèi)源性心臟祖細(xì)胞（cardiac progenitor cell，CPC）]和外源性干細(xì)胞[包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞]。

2.1 "內(nèi)源性CPC

CPC是一類存在于CM內(nèi)具有集落生長(zhǎng)、自我更新和多種分化潛能的前體多能細(xì)胞。目前已從心臟中分離出多種CPC，根據(jù)其性質(zhì)和表面標(biāo)志特征可分為：側(cè)群細(xì)胞、c-kit⁺細(xì)胞、Sca-1⁺細(xì)胞、心肌球源性細(xì)胞（cardiosphere-derived cell，CDC）等。本文重點(diǎn)介紹c-kit⁺細(xì)胞和CDC兩類細(xì)胞。

c-kit⁺細(xì)胞已被廣泛認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性心臟再生的重要細(xì)胞來(lái)源，其表面的c-kit受體可與細(xì)胞因子結(jié)合，激活信號(hào)通路作用于細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄途徑，促進(jìn)基因表達(dá)，從而促進(jìn)心內(nèi)干細(xì)胞分化為CM^[10]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相繼證實(shí)c-kit⁺細(xì)胞能降低MI后的梗死面積，改善心臟功能^[11]。在臨床前期研究基礎(chǔ)上，Bolli等^[12]將自體c-kit⁺細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射到缺血性心肌病患者體內(nèi)，結(jié)果顯示注射治療后能有效改善左心室收縮功能。

然而c-kit⁺細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞的能力一直存在爭(zhēng)議，van"Berlo等^[13]提出CPC對(duì)MI后新心肌細(xì)胞的形成無(wú)明顯作用，該研究直接標(biāo)記心臟的內(nèi)源性c-kit⁺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)即使在損傷后，c-kit⁺細(xì)胞僅以0.03%的比例分化為心肌細(xì)胞，其對(duì)心臟損傷的修復(fù)主要通過(guò)旁分泌作用產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，參與受損心臟的血管形成和發(fā)揮抗凋亡作用保護(hù)心臟。

CDC是從心臟組織中分離出的一種能夠在體外形成類似心肌組織的三維球體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。在大鼠和豬臨床前心力衰竭模型中通過(guò)移植體外培養(yǎng)并純化的CDC可減少梗死面積和改善心臟功能^[14]。2009年Makkar等啟動(dòng)關(guān)于CDC的臨床試驗(yàn)（CADUCEUS），使用自體CDC治療6個(gè)月后心臟磁共振成像提示患者CM存活數(shù)量增加，瘢痕面積減少且左心室局部收縮力增加，但患者的左室射血分?jǐn)?shù)無(wú)明顯提高^[15]。隨后，在更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)ALLSTAR^[16]中使用同種異體CDC治療后，患者左室射血分?jǐn)?shù)和N末端腦鈉肽前體均較治療前改善。

目前，CPC心臟再生治療的療效存疑，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為CPC細(xì)胞直接分化為CM的能力非常有限，其對(duì)心臟再生的益處多歸因于旁分泌和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)^[17]。此外，細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和移植需要數(shù)周時(shí)間，因此該方法也無(wú)法應(yīng)對(duì)急性MI的治療。

2.2 "ESC及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

ESC和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞統(tǒng)稱為多能干細(xì)胞，多能干細(xì)胞具有無(wú)限分化為CM的潛能，其分化的CM在心肌特異性基因及蛋白的表達(dá)、細(xì)胞電生理特性等方面與正常CM相似。起初觀點(diǎn)認(rèn)為心臟內(nèi)環(huán)境可提供關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子或發(fā)揮細(xì)胞相互作用，以誘導(dǎo)ESC向CM特異性分化。但研究發(fā)現(xiàn)直接將ESC注射到小鼠心肌中會(huì)形成大的畸胎瘤。于是研究人員通過(guò)體外誘導(dǎo)ESC分化成熟，形成人胚胎干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞（human embryonic stem cell-cardiomyocyte，hESC-CM），這些細(xì)胞具有成熟CM形態(tài)^[18]。在臨床前研究中hESC-CM已被移植到多種動(dòng)物模型中^[19-20]，移植的hESC-CM可在受損的心臟中存活、增殖并與原始心肌細(xì)胞之間形成電耦合。但由于ESC來(lái)源于著床前囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)而受到倫理方面的質(zhì)疑，并且免疫排斥問(wèn)題也使其在臨床應(yīng)用中受到限制。

隨后，Takahashi等^[21]將體細(xì)胞重新編程為類ESC并成功地培育出人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC），hiPSC在自我更新和分化為多種細(xì)胞類型的能力上與ESC幾乎相同。許多研究^[22]報(bào)道在MI動(dòng)物臨床前研究中，移植人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell-cardiomyocyte，hiPSC-CM）能夠緩解心臟重構(gòu)過(guò)程并改善心臟功能。但也有大型動(dòng)物研究^[23]顯示，將hiPSC-CM注射到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物或豬模型后，出現(xiàn)危及生命的室性心律失常。

近年來(lái)，心臟貼片是一種新興的外科技術(shù)，將生物活性貼片材料縫合到心外膜上，生物材料既可直接與心外膜接觸，為細(xì)胞附著或聚集提供物理支持，還能釋放生物活性因子，可提高h(yuǎn)iPSC的分化效率或促進(jìn)功能成熟^[24]。Lou等^[25]研究在MI小鼠模型中，使用纖維蛋白貼片遞送hiPSC衍生三系細(xì)胞，觀察到植入貼片后能明顯改善小鼠心臟功能，并進(jìn)一步證明在貼片中加入hiPSC衍生的CF能促進(jìn)hiPSC-CM成熟。Miyagawa等^[26]首次開(kāi)展了一項(xiàng)使用含有hiPSC-CM貼片治療缺血性心肌病的臨床試驗(yàn)，6個(gè)月后隨訪報(bào)道移植后貼片耐受性和安全性良好，并且移植后患者左心室壁運(yùn)動(dòng)得到改善。

hiPSC應(yīng)用于臨床治療仍然面臨一些挑戰(zhàn)。（1）細(xì)胞的異質(zhì)性：hiPSC的分化產(chǎn)生不同亞型CM和非CM的混合物，可能會(huì)誘發(fā)移植相關(guān)的異常組織形成，如何定向誘導(dǎo)分化非常重要。（2）細(xì)胞存活率及不成熟表型：hiPSC-CM顯示出不成熟的特征，肌節(jié)結(jié)構(gòu)和收縮性仍不夠成熟。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出增強(qiáng)hiPSC-CM體外成熟的方法，但依舊無(wú)法確定hiPSC-CM心臟移植的最佳階段。（3）心律失常風(fēng)險(xiǎn)：需要進(jìn)一步的研究來(lái)解決與移植相關(guān)的心律失常風(fēng)險(xiǎn)。（4）免疫排斥。

3 "誘導(dǎo)心肌細(xì)胞再生

誘導(dǎo)心肌細(xì)胞再生是誘導(dǎo)成年期心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期并增殖，從而對(duì)損傷心肌進(jìn)行修復(fù)的方法。該方法可避免干細(xì)胞移植過(guò)程中的許多風(fēng)險(xiǎn)，這為損傷后心臟再生治療提供了新方向。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在細(xì)胞周期的各階段通過(guò)相互作用來(lái)推進(jìn)或阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，包括各類細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）、轉(zhuǎn)錄因子和DNA修復(fù)酶等。已有研究通過(guò)操控一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控因子成功誘導(dǎo)成年CM重新進(jìn)入細(xì)胞周期，發(fā)生有絲分裂、增殖再生。Mohamed等^[27]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)四種細(xì)胞周期因子的組合為：CDK1、CDK4、細(xì)胞周期蛋白B1和細(xì)胞周期蛋白D1（共稱為4F），能有效誘導(dǎo)CM的胞質(zhì)分裂。Abouleisa等^[28]克隆出編碼4F的多順?lè)醋硬《?，并由心肌肌鈣蛋白T2（troponin t type 2，TNNT2）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（稱為TNNT2-4F-NIL），結(jié)果顯示心肌內(nèi)注射TNNT2-4F-NIL可改善大鼠和豬缺血再灌注后的心肌收縮功能并減少瘢痕面積。

轉(zhuǎn)錄因子也被證明可調(diào)控出生后CM的細(xì)胞周期停滯。E2F4轉(zhuǎn)錄因子能激活與DNA復(fù)制相關(guān)基因，同時(shí)還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E的表達(dá)，是G2/M期所必需的轉(zhuǎn)錄因子^[29]。Meis轉(zhuǎn)錄因子家族能激活細(xì)胞周期抑制基因，阻滯細(xì)胞周期。免疫熒光分析^[30]顯示Meis1敲除小鼠在出生后第14天，CM持續(xù)進(jìn)行有絲分裂和細(xì)胞分裂。

此外，多項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了心肌細(xì)胞代謝在心肌細(xì)胞發(fā)育和增殖過(guò)程中的重要性。代謝底物除了作為能量來(lái)源外，還成為基因表達(dá)和表觀遺傳模式的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，這均會(huì)影響心臟再生。Li等^[31]通過(guò)特異性敲除肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制心肌細(xì)胞線粒體對(duì)脂肪酸的攝取，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝誘導(dǎo)成年期心臟再生。

目前誘導(dǎo)成體心肌細(xì)胞再生的各種策略尚未應(yīng)用于臨床研究中，因?yàn)檎{(diào)控基因表達(dá)具有復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的過(guò)程中，可能會(huì)在其他組織中出現(xiàn)不受控制的增殖和腫瘤的發(fā)生，如何特異性改變心肌細(xì)胞的基因表達(dá)成為誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)源性再生的關(guān)鍵點(diǎn)。

4 "其他方向

近年來(lái)，在此前研究基礎(chǔ)上衍生出一些新的方向來(lái)實(shí)現(xiàn)CM的再生和修復(fù)。Versican是一種CF來(lái)源的多功能蛋白聚糖，主要存在于心臟細(xì)胞外基質(zhì)中，研究發(fā)現(xiàn)Versican是CM增殖的潛在調(diào)控因子，在心臟CF中特異性敲除Versican會(huì)降低CM的增殖能力，并損害新生小鼠心臟的再生能力，相反，在MI后注射Versican可促進(jìn)CM的增殖，減少纖維化。此外Versican還能增強(qiáng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞的增殖^[32]。研究者進(jìn)一步探索了Versican促進(jìn)CM增殖的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Versican可通過(guò)激活整合素β1以及下游的信號(hào)分子（ERK1/2和Akt），從而促進(jìn)CM增殖和心臟修復(fù)。

此外，線粒體未折疊蛋白反應(yīng)是線粒體到細(xì)胞核的主要信號(hào)通路，它能維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)組織間的信號(hào)傳遞，并調(diào)節(jié)機(jī)體衰老。一項(xiàng)在小鼠模型中的研究^[33]發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素干預(yù)可抑制線粒體翻譯并誘導(dǎo)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞周期和分裂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。隨后，在Gao等^[34]的研究中再次證實(shí)了多西環(huán)素可使MI后小鼠梗死面積減小，并驗(yàn)證了多西環(huán)素通過(guò)激活A(yù)TF4信號(hào)通路進(jìn)而抑制線粒體翻譯，來(lái)促進(jìn)CM增殖并實(shí)現(xiàn)心臟再生。

5 "總結(jié)

目前臨床對(duì)治療心力衰竭的再生療法有著巨大的需求。過(guò)去嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯繛樾呐K再生治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并重新定義了對(duì)心肌細(xì)胞生物學(xué)的理解。在未來(lái)，隨著誘導(dǎo)心臟再生的可行策略向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，提高對(duì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖、分化和成熟的分子機(jī)制的理解以及非心肌細(xì)胞在支持心臟功能中的作用，對(duì)于實(shí)現(xiàn)靶向的心臟再生有重要影響。

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收稿日期：2024-04-03