基于高通量測序和純培養(yǎng)技術(shù)解析海南東寨港紅樹植物老鼠簕根際放線菌多樣性及其潛在的功能

摘""要：根際是土壤-植物根系-微生物進(jìn)行物質(zhì)交換的活躍地帶。根際放線菌是根系放線菌的重要組成部分，是生物活性物質(zhì)的主要來源之一。本研究從海南東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)采集了5份紅樹植物老鼠簕根際土壤樣品，采用高通量測序和傳統(tǒng)純培養(yǎng)相結(jié)合的策略探究樣品中根際放線菌的多樣性和產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的潛力。利用Illumina"Novaseq"6000測序平臺對老鼠簕根際樣品細(xì)菌的16S"rRNA基因的V3～V4區(qū)域進(jìn)行測序與分析，結(jié)果顯示：（1）老鼠簕根際細(xì)菌共注釋到32個門（包括25個有效鑒定的門），其中優(yōu)勢門是變形菌門；α多樣性分析表明老鼠簕根際細(xì)菌群落多樣性非常豐富；（2）對放線菌門的微生物群落進(jìn)行分析，注釋到33個有效鑒定的屬、4個暫定的屬和28個未培養(yǎng)的新放線菌屬，KEGG功能預(yù)測分析顯示老鼠簕根際放線菌主要參與次級代謝產(chǎn)物的生物合成。同時，利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法分離放線菌，經(jīng)形態(tài)特征分群和排重，通過PCR擴增、測序并比對16S"rRNA基因序列后進(jìn)行放線菌多樣性分析，利用瓊脂擴散法篩選抑菌活性，通過基于PCR的基因篩選技術(shù)檢測代表菌株可能存在的PKS-I、PKS-II和NRPS抗生素生物合成基因，結(jié)果顯示：（1）共得到4個屬的33株放線菌代表菌株，其中鏈霉菌屬為優(yōu)勢菌屬，有2個屬未被高通量測序分析結(jié)果注釋到；（2）代表菌株的NRPS和PKS-II基因陽性率很高（90%以上），24.24%根際放線菌具有抗1種及以上指示菌的活性。本研究利用高通量測序和純培養(yǎng)方法得出東寨港紅樹植物老鼠簕的根際放線菌多樣性非常豐富，并具有較好的合成次生代謝產(chǎn)物的潛力，因此，該研究結(jié)果可為具有生物活性化合物的篩選提供豐富的菌種資源，同時也為后續(xù)新藥的開發(fā)提供重要參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：老鼠簕；根際；放線菌多樣性；高通量測序；純培養(yǎng)中圖分類號：Q939.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Analysis"of"Rhizospheric"Actinomycetes"Diversity"and"Potential"Functions"of"Mangrove"Acanthus"ilicifolius"in"Dongzhaigang"of"Hainan"Province"Based"on"High-throughput"Sequencing"and"Pure"Culture

LIU"Shunqing1，2，"HE"Xiaowen1，"WU"Jinyan1，"YI"Guohui1，"CHEN"Qianqian1，2，"XIE"Xinyi1，2，"SUI"Jinlei1*

1."Public"Research"Center，"Hainan"Medical"University，"Haikou，"Hainan"571199，"China;"2."School"of"Basic"Medicine"and"Life"Science，"Hainan"Medical"University，"Haikou，"Hainan"571199，"China

Abstract："Rhizosphere"is"a"dynamic"interface"where"soil，"plant"roots"and"microorganisms"exchange"substances."Rhizospheric"actinomycetes"are"an"important"component"of"root"actinomycetes"and"one"of"the"main"sources"of"bioactive"substances."In"this"study，"five"different"rhizospheric"soil"samples"of"a"mangrove"plant，"Acanthus"ilicifolius，"were"collected"from"the"Dongzhaigang"Mangrove"Nature"Reserve"of"Hainan"province."A"combination"of"high-throughput"sequencing"and"traditional"pure"culture"strategies"were"used"to"explore"the"diversity"of"the"rhizospheric"actinomycetes"of"A."ilicifolius"and"the"potential"to"produce"bioactive"substances"in"the"samples."The"V3"to"V4"regions"of"16S"rRNA"gene"in"the"rhizospheric"samples"of"A."ilicifolius"were"sequenced"and"analyzed"by"Illumina"Novaseq"6000"sequencing"platform."A"total"of"32"phyla"（including"25"effectively"identified"phyla）"were"annotated，"of"which"Proteobacteria"is"the"dominant"phyla."α-diversity"analysis"showed"that"the"rhizospheric"bacterial"community"of"A."ilicifolius"was"very"abundant."The"microbial"communities"of"actinomycetes"were"analyzed，"and"33"validated"genera，"four"tentative"genera"and"28"uncultured"new"genera"were"noted."KEGG"functional"prediction"analysis"in"different"levels"showed"that"rhizospheric"actinomycetes"were"mainly"involved"in"the"biosynthesis"of"secondary"metabolites"including"various"antibiotics."Meanwhile，"actinomycetes"were"isolated"by"the"traditional"pure"culture"method."After"isolation，"purification，"morphological"characteristics"grouping"and"rearrangement，"the"diversity"of"actinomycetes"of"mangrove"A."ilicifolius"was"analyzed"by"PCR"amplification，"sequencing"and"comparison"of"16S"rRNA"gene"sequences."The"antimicrobial"activity"was"screened"by"the"agar"diffusion"method."PCR-based"gene"screening"technology"was"used"to"detect"the"possible"antibiotic"biosynthesis"genes"of"the"representative"strains"of"PKS-I，"PKS-II"and"NRPS."A"total"of"33"representative"strains"of"rhizospheric"actinomycetes"were"obtained"from"four"genera，"of"which"Streptomyces"was"the"dominant"genus，"and"2"genera"could"not"be"detected"by"high-throughput"sequencing"method."The"positive"rates"of"NRPS"and"PKS-II"genes"of"the"representative"strains"were"very"high"（more"than"90%）."24.24%"of"rhizospheric"actinomycetes"had"the"activity"against"at"least"one"or"more"indicator"microorgnisms."In"this"study，"high-throughput"sequencing"and"traditional"pure"culture"methods"were"used"to"show"that"rhizospheric"actinomycetes"of"a"mangrove"plant"A."ilicifolius"from"Dongzhaigang"had"a"very"rich"actinomycetic"diversity."The"rhizospheric"actinomyces"of"A."ilicifolius"has"good"potential"to"synthesize"secondary"metabolites，"which"could"provide"rich"microbial"resources"for"the"screening"of"bioactive"compounds，"and"also"provide"an"important"basis"for"the"development"of"subsequent"new"drugs.

Keywords："Acanthus"ilicifolius;"rhizosphere;"actinomycetic"diversity;"high-throughput"sequencing;"pure"culture

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.022

紅樹林（Mangrove）是生長在熱帶和亞熱帶海岸潮間帶，由紅樹植物為主體的常綠喬木或灌木組成的濕地木本植物群落，在凈化海水、防風(fēng)消浪、固碳儲碳、維護(hù)生物多樣性等方面發(fā)揮著重要作用[1]。紅樹植物是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中唯一的木本植物。紅樹林生境的強還原性和酸度、高鹽度和豐富的營養(yǎng)含量[1-2]，造就了豐富而獨特的微生物資源。

根際是直接靠近根系的一個狹窄的土壤區(qū)，是受植物根系影響最強烈的土壤區(qū)域，微生物活動最活躍，微生物多樣性最豐富[3]。根際最初通過被根系分泌物吸引而富集特定微生物，然而，這些分泌物對非根際土壤微生物的影響很小，這使得根際微生物的豐度和種類與非根際土壤有一定的差異[4]。根際微生物感知和解釋自身、其他微生物、植物而產(chǎn)生信號，并能夠通過釋放信號分子影響其植物宿主[5]。紅樹林植物根際微生物通過參與與宿主生命活動有關(guān)的過程，影響紅樹植物的生長與代謝，在紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。根際微生物，特別是放線菌是新抗生素的最有希望的來源，對制藥工業(yè)和生物技術(shù)的發(fā)展都有重要的意義[3，"6]。放線菌是通常從根際分離出來的重要細(xì)菌群，是新型生物活性物質(zhì)的主要來源之一。已知由它們產(chǎn)生的抗生素在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)科學(xué)中具有廣泛應(yīng)用[7]。

海南東寨港紅樹林是我國成片面積最大、種類最齊全、保存最完整的紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)[8]。紅樹植物老鼠簕（Acanthus"ilicifolius"Linn.）是一種灌木，生長在熱帶和亞熱帶地區(qū)的紅樹林和潮汐區(qū)[9]。其獨特的生長環(huán)境造就了多種結(jié)構(gòu)特異的次生代謝物，表現(xiàn)出多種生物活性，具有潛在的藥用價值。在印度和中國，這種植物的葉子、根和整株植物都被用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，是紅樹林中一種重要的藥用植物[9-10]。目前，系統(tǒng)全面地探究東寨港紅樹林紅樹植物老鼠簕的生物多樣性的研究還較少，本研究選取老鼠簕（A."ilicifolius）的根際土壤為材料，利用免培養(yǎng)測序和純培養(yǎng)分離探究老鼠簕根際放線菌的多樣性，檢測放線菌的抗菌活性和3類活性物質(zhì)化合物合成基因簇，為開發(fā)新藥提供重要的菌種資源。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""土壤樣品""供試土壤樣品為老鼠簕的根際土壤樣品，于2021年5月3日采自海南省海口市東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)（19°95′N，110°55′E）。根際土的采樣方法為5點法（即將同一地點5株老鼠簕的根際土的混樣作為一個樣品，設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)）。將植株直接連根拔起，連帶周圍松散的土一起裝入無菌自封袋，放入裝有冰和冰袋的泡沫箱中低溫保存，4"h內(nèi)帶回實驗室。抖掉周圍松散的土，用無菌磷酸緩沖液（PBS）沖洗剩下的附著在根周圍的土壤（約1"mm厚），離心，收集根際土（rhizosphere"soil）。將得到的根際土分成2份，1份直接于–80"℃保存，1份置于無菌平皿中室溫風(fēng)干，用于放線菌的分離。

1.1.2""菌株""供試菌株為從老鼠簕根際土分離和鑒定的根際放線菌。指示菌有金黃色葡萄球菌（Staphylococcus"aureus"ATCC"6538，"SA）、大腸桿菌（Escherichia"coli"ATCC"25922，"EC）和白色念珠菌（Candida"albicans"ATCC"10231，"CA），均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3""主要試劑""PowerSoil?"DNA分離試劑盒（美國MoBio公司）；放線菌分離瓊脂（AI，美國Difco公司）；改良的高氏I號培養(yǎng)基（MG，青島海博生物科技有限公司）；酵母麥芽浸汁培養(yǎng)基（ISP2，青島海博生物科技有限公司）；葡萄糖天門冬素培養(yǎng)基（GA，青島海博生物科技有限公司）；腐殖酸培養(yǎng)基（HV，青島海博生物科技有限公司）；燕麥培養(yǎng)基（ISP3，青島海博生物科技有限公司）；制霉菌素（阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：N141226-5MU；≥4400"USP"units/mg）；萘啶酮酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，貨號：S25789-5"g，含量≥98%）；PCR所用的10×Buffer、Taq"DNA聚合酶、dNTPs等（TaKaRa公司）。

1.1.4""儀器與設(shè)備""PCR擴增儀（德國Biometra公司，型號：analytikjena）；生化培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠，型號：DHP-240）；光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯光學(xué)技術(shù)公司，型號：CX41）；組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：JXFSTPRP-24）；Centrifuge"5430臺式離心機（德國艾本德，型號：Centrifuge"5430）；多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：Synergy"HTX）；生物安全柜（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司，型號：HR30-IIA2）。

1.2""方法

1.2.1""高通量測序分析""（1）樣品DNA提取和高通量測序。采用MoBio"PowerSoil?"DNA分離試劑盒提取根際土基因組總DNA，具體方法參照MoBio"PowerSoil?"DNA分離試劑盒說明書。擴增"16S"rRNA基因V3～V4區(qū)的引物是338F（5′-ACT"CCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACT"ACHVGGGTWTCTAAT-3′）[11]，擴增后的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（2）數(shù)據(jù)分析。樣品純化檢測后由北京百邁客生物科技有限公司采用Illumina"Novaseq"6000測序平臺的雙末端測序（Paired-End）法進(jìn)行高通量測序。為方便測序及數(shù)據(jù)分析，AIS1～AIS5代表老鼠簕根際樣品的第1到第5個生物學(xué)重復(fù)。測序數(shù)據(jù)下機后，首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要流程為：使用Illumina"Novaseq"6000系統(tǒng)從經(jīng)過驗證的文庫中獲得有效的擴增子序列。使用FLASH（Version"1.2.11）軟件拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)。生成高質(zhì)量的擴增子序列方法如下：首先，使用Trimmomatic（version"0.33）軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾（參數(shù)設(shè)置：50"bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基），然后使用Cutadapt（version"1.9.1）軟件進(jìn)行引物序列的識別與去除（參數(shù)設(shè)置：允許最大錯配率20%，最小覆蓋度80%），接著用USEARCH（version"10.0）軟件對雙末端"reads"進(jìn)行拼接（參數(shù)設(shè)置：最小overlap長度為10"bp，overlap區(qū)允許的最小相似性90%，最大錯配堿基數(shù)為5"bp）并用UCHIME（version"8.1）軟件去除嵌合體（參數(shù)設(shè)置：2條parents分別有一段序列與query序列相似度在80%以上，則判斷該query為嵌合體），最終得到高質(zhì)量的序列用于后續(xù)分析。使用USEARCH（version"10.0）軟件將相似性高于97%的序列聚類為一個分類單元，即OTU（operational"taxonomic"unit）。與SILVA參考序列（Release"132，"http：//www."arb-silva."de）[12]比較，采用樸素貝葉斯分類器對特征序列進(jìn)行注釋分析。另外，與將葉綠體和線粒體標(biāo)記的參考序列匹配的序列從數(shù)據(jù)集中刪除。

生物信息學(xué)分析使用百邁客云平臺BMKCloud（www.biocloud.net）進(jìn)行。利用QIIME2（https：//qiime2.org/）對樣品中不同物種的豐度進(jìn)行評估，利用R程序包繪制基于不同分類水平頻率分布的直方圖。隨后，通過QIIME軟件獲得樣品的α多樣性指數(shù)，采用Student’s"t檢驗對各紅樹林物種的細(xì)菌多樣性和豐度進(jìn)行分析。采用ACE和Chao1指數(shù)估算細(xì)菌豐度，采用Simpson和Shannon指數(shù)估算細(xì)菌多樣性。利用云平臺BMKCloud過濾（保留）放線菌門（Actinobacteria）進(jìn)行放線菌多樣性分析，分析放線菌門、屬水平的多樣性情況。為了分析不同樣本中放線菌類群在功能上的差異，使用PICRUSt2軟件預(yù)測它們在系統(tǒng)發(fā)育中的功能潛力[13]。PICRUSt2軟件將待預(yù)測的特征序列與IMG（integrated"microbial"genomes）微生物基因組數(shù)據(jù)庫已有的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，推測樣本中的功能基因組成。首先需要對生成的特征豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（不同的種屬菌包含的16S拷貝數(shù)不相同）；然后，通過每個特征（Feature）對應(yīng)的ID，即可獲得特征（Feature）對應(yīng)的KEGG家族信息，從而計算該KEGG的豐度并從KEGG數(shù)據(jù)庫的信息中獲得通路、特征（Feature）豐度來計算各功能類別的豐度情況。

1.2.2""純培養(yǎng)分析""（1）根際放線菌的分離、純化和保藏。采用5種選擇性分離培養(yǎng)基[放線菌分離瓊脂（AI）、改良的高氏I號培養(yǎng)基（MG）、酵母麥芽浸汁培養(yǎng)基（ISP2）、葡萄糖天門冬素培養(yǎng)基（GA）和腐殖酸培養(yǎng)基（HV）]進(jìn)行老鼠簕根際放線菌的分離。在分離培養(yǎng)基中加入抑制劑（制霉菌素50"mg/L，萘啶酸鈉25"mg/L和重鉻酸鉀25"mg/L）抑制生長較快的雜菌（細(xì)菌和真菌）的生長。選用ISP2和燕麥培養(yǎng)基（ISP3）作為菌株純化培養(yǎng)基，選用ISP2作為活化和保藏培養(yǎng)基。另外，選用課題組前期優(yōu)化的葡萄糖淀粉酵母培養(yǎng)基（GSP）（配方：葡萄糖10"g、可溶性淀粉20"g，蛋白胨10"g、酵母粉10"g、KH2PO4"1"g、MgSO4.7H2O"0.5"g、CaCO3"1"g，pH"7.0～7.5）作為菌株發(fā)酵培養(yǎng)基。

放線菌的分離采用2種分離方法：（a）涂布稀釋法：稱取風(fēng)干的土壤樣品5"g溶于1/4濃度的林格溶液，旋渦振蕩混勻，55"℃水浴加熱20"min，再進(jìn)行梯度稀釋，吸取100"μL的10-2和10-3懸浮液涂布在分離平板上。在28"℃生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3周至3個月；（b）印章法：稱取1"g土壤，用無菌研缽研磨均勻后，置于無菌培養(yǎng)皿中（濕土先在超凈工作臺干燥2"h），用無菌的橡膠塞均勻蘸取土樣后，反復(fù)壓在分離瓊脂表面，產(chǎn)生一系列稀釋效果。在28"℃生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3周至3個月。

待分離平板長出疑似放線菌菌落后，挑選單菌落轉(zhuǎn)接入ISP2和ISP3平板中，采取四區(qū)劃線法純化菌株，28"℃培養(yǎng)7"d。根據(jù)菌落在ISP2和ISP3的形態(tài)特征以及顯微鏡下觀察基內(nèi)菌絲與氣生菌絲的形態(tài)特征等，進(jìn)行分群、形態(tài)鑒定和去重復(fù)后挑選代表菌株并進(jìn)行保藏。

（2）DNA的提取、擴增和測序。將得到的代表菌株接種在ISP2液體培養(yǎng)基中，在28"℃搖床中180"r/min培養(yǎng)36～48"h。取1"mL的培養(yǎng)物加入至1.5"mL離心管中，以13"000"r/min離心1"min，然后棄上清。將沉淀重懸于500"μL的無菌水中，加入4顆無菌小鋼珠，在組織研磨儀中以50"Hz研磨1"min。10"000"r/min離心2"min后，取上清用作模板DNA。

16S"rRNA基因的擴增使用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。反應(yīng)體系：2.5"μmol/L"dNTPs"4"μL，10×Buffer"2.5"μL，10"μmol/L正、反向引物各0.5"μL，5"U/μL"Taq"DNA聚合酶1.5"μL，模板DNA"2"μL，加入ddH2O補足至25"μL。反應(yīng)程序：95"℃"5"min；94"℃"1"min，55"℃"1"min，72"℃"90"s，30個循環(huán)；72"℃"10"min。PCR產(chǎn)物用E.Z.N.A.凝膠純化試劑盒（Omega"Bio-tek，USA）純化后連接到pMD-19T載體上，送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

將測序結(jié)果在EzBioCloud（https：//www."ezbiocloud.net/identify）網(wǎng)站上進(jìn)行相似性比對，下載相似性最高的模式菌株。利用MEGA"11軟件采用鄰接法（自展值1000）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹的構(gòu)建[14-16]。

（3）化合物合成基因的檢測。聚酮合酶（PKS）基因和非核糖體肽合成酶（NRPS）基因是常用來篩選微生物合成次級代謝產(chǎn)物的基因，廣泛用于評價細(xì)菌、真菌、藍(lán)細(xì)菌等合成相應(yīng)次級代謝產(chǎn)物的潛在能力[17]。本研究擬對PKS-I、PKS-II和NRPS3類抗生素合成基因進(jìn)行擴增，引物序列及目的條帶大小見表1。PCR擴增條件參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)條帶大小判斷代表菌株是否攜帶相應(yīng)基因。

（4）代表菌株的發(fā)酵和抑菌活性初篩。將33株新活化的老鼠簕根際放線菌菌株，轉(zhuǎn)接到GSP液體培養(yǎng)基中進(jìn)行小量發(fā)酵，28"℃，220"r/min振蕩培養(yǎng)7"d，將發(fā)酵液6000"r/min離心15"min，離心后的上清用于抗菌活性初篩，以未接種菌株的培養(yǎng)基作為陰性對照。采用瓊脂擴散法篩選抗菌活性。吸取0.2"mL病原指示菌懸液涂布固體培養(yǎng)基表面，待液體吸收后，用打孔器打出直徑8"mm的小孔加入發(fā)酵液上清，每株菌設(shè)置3次重復(fù)，并觀測陰性對照組有無抑菌圈形成。將細(xì)菌指示菌（SA和EC）于37"℃培養(yǎng)16～18"h，真菌指示菌（CA）于37"℃培養(yǎng)20～24"h，分別測量抑菌圈直徑。

2""結(jié)果與分析

2.1""高通量測序分析內(nèi)生細(xì)菌和放線菌多樣性

2.1.1""測序數(shù)據(jù)基本情況分析""對紅樹林物種老鼠簕根際土壤進(jìn)行16S"rRNA擴增子測序。如圖1所示，老鼠簕根際土壤樣品5個生物學(xué)重復(fù)的稀釋曲線最終都?xì)w于平緩，說明測序趨于飽和，能夠比較真實地反映老鼠簕根際土壤樣品的微生物群落。

本研究共從5個樣本中獲得400"615個PE"reads。如表2所示，經(jīng)過質(zhì)量過濾和數(shù)據(jù)合并，共獲得263"704條高質(zhì)量序列，以97%的序列一致性閾值并刪除低豐度OTU，共檢測到2273個OTUs。同時，老鼠簕根際土壤樣品的5個樣品（生物學(xué)重復(fù)）測序覆蓋率均超過99%，理論上測序數(shù)據(jù)已能覆蓋樣品中的全部序列。

α多樣性用ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)來評估樣品內(nèi)微生物群落豐富度（community"richness），反映的是一個群落中物種數(shù)目的多少。ACE指數(shù)和"Chao1指數(shù)用來估計物種總量，Chao1指數(shù)越大，代表物種總量越多。從表2可以看出，老鼠簕根際土壤樣品的5個生物學(xué)重復(fù)ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)比較大，且不同樣品間差別不大，可知不同生物學(xué)重復(fù)的微生物群落豐富，總量比較相近。Simpson"指數(shù)和Shannon指數(shù)被用來反映樣品中微生物群落多樣性（community"diversity），是物種豐富度和物種均勻度的綜合指標(biāo)，其值越大，說明群落物種豐富度越大或均勻度越高[18]。老鼠簕根際土壤樣品的5個生物學(xué)重復(fù)的Simpson和Shannon指數(shù)較大，且相近，說明5個樣品中物種的豐富較大和均勻性較高，因此總的生物多樣性較大。綜上分析可知，老鼠簕根際土壤樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性非常豐富。

2.1.2""微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析""在門分類水平上的群落共包括細(xì)菌域的32個門，其中包括有效鑒定的25個門：酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Calditrichaeota、Chlamydiae、綠屈撓菌門（Chloroflexi）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、達(dá)達(dá)菌門（Dadabacteria）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、腸桿菌門（Entotheonellaeota）、Epsilonbacteraeota、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、Kiritimatiellaeota、匿桿菌門（Latescibacteria）、硝化刺菌門（Nitrospinae）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、Patescibacteria、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、己科河菌門（Rokubacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）、疣微菌門"（Verrucomicrobia）、河床菌門（Zixibacteria），暫定的6個門（BRC1、FCPU426、GAL15、TA06、WPS-2、WS2）和1個未培養(yǎng)的門（uncultured_bacterium_k_Bacteria）。

老鼠簕根際土壤5個樣品中，細(xì)菌群落均以變形菌門（Proteobacteria）為主，這個門的相對豐度在不同樣本中均超過50%。另外，綠屈撓菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門也占有較大比例，均是優(yōu)勢菌群。這些優(yōu)勢菌群在不同樣品中的占比存在些許差異，但群落結(jié)構(gòu)組成一致。

將放線菌門的細(xì)菌群落進(jìn)行分析，在屬分類水平上共獲得33個已注釋的放線菌屬（熱酸菌屬Acidothermus、馬杜拉放線菌屬Actinomadura、Actinophytocola、Aeromicrobium、Agromyces、擬無枝酸菌屬Amycolatopsis、Angustibacter、雙棲桿菌屬Bifidobacterium、Blastococcus、Brevibacterium、扣林氏菌屬Collinsella、Conexibacter、克洛斯氏菌屬Crossiella、Dactylosporangium、Demequina、Frankia、Gaiella、Iamia、Ilumatobacter、Isoptericola、Jatrophihabitans、Luedemannella、Lysinimicrobium、大理石雕菌屬Marmoricola、微桿菌屬Microbacterium、Micromonospora、Mycobacterium、類諾卡氏屬Nocardioides、假諾卡氏菌屬Pseudonocardia、羅氏菌屬Rothia、中華單胞菌屬Sinomonas、Solirubrobacter、Streptomyces），4個暫定的放線菌屬（Coriobacteriaceae_UCG-002、Corynebacterium_1、Sva0996_marine_group和bacterium_YC-ZSS-LKJ159）和28個未培養(yǎng)的放線菌屬。其中放線菌屬Ilumatobacter是第一優(yōu)勢屬。

在排前20的優(yōu)勢放線菌屬的分布如圖2所示，已注釋的放線菌屬只有7個，分別是Ilumatobacter、Gaiella、大理石雕菌屬、Demequina、Mycobacterium、Microbacterium和熱酸菌屬，未培養(yǎng)的放線菌屬占比較大。

2.1.3""老鼠簕根際放線菌群落的功能預(yù)測分析""利用PICRUSt2軟件對放線菌菌群進(jìn)行了基因功能預(yù)測。通過對KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共獲得6類一級生物代謝通路功能，其中代謝功能的相對豐度最高，占80%以上（圖3）。在分布于6個代謝途徑的細(xì)菌群落中，注釋到的二級代謝功能中，氨基酸代謝、能量代謝、脂類代謝、異生素生物降解和代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝等與次生代謝產(chǎn)物的生物合成相關(guān)的功能均占較高的比重（圖3）。對KEGG三級功能層豐度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物的生物合成和抗生素的生物合成功能是僅次于代謝通路的豐度最高的功能活動（圖3）。以上結(jié)果可以得出，老鼠簕根際放線菌中與化合物合成相關(guān)的功能基因的豐度最高，意味著參與化合物的生物合成的菌群占比最高，這為充分挖掘老鼠簕根際放線菌資源進(jìn)而發(fā)現(xiàn)微生物來源的先導(dǎo)化合物提供了實驗依據(jù)。

2.2""純培養(yǎng)放線菌多樣性分析

2.2.1""純培養(yǎng)分離的根際放線菌多樣性""采用5種選擇性分離培養(yǎng)基從老鼠簕根際土壤中分離、鑒定出3個目4個屬的33株根際放線菌代表菌株（原始菌株41株）。如表3所示，它們分別屬于鏈霉菌目（Streptomycetales）、分支桿菌目（Mycobacteriales）、鏈孢囊菌目（Strepto sporangiales）3個目和鏈霉菌屬、紅球菌屬、馬杜拉放線菌屬和北里孢菌屬4個屬，其中鏈霉菌屬是豐度最高的屬，有29株。

純培養(yǎng)分離到的根際放線菌的情況如表3所示，不同預(yù)處理方法得到的放線菌數(shù)量不同，干土濕熱稀釋涂布法得到的放線菌數(shù)量大于濕土濕熱稀釋涂布法，干土印章法得到的放線菌數(shù)量大于濕土印章法，因此，干土分離得到的放線菌數(shù)量明顯大于濕土得到的放線菌數(shù)量。5種分離培養(yǎng)基中，ISP2和GA培養(yǎng)基得到的放線菌較多，而MG和HV培養(yǎng)基得到的放線菌較少。不同分離培養(yǎng)基得到的放線菌的種類和數(shù)量的差異與不同放線菌對培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和比例有一定的偏好性有關(guān)。AI分離培養(yǎng)基得到的放線菌的多樣性最為豐富，這可能與AI中含有較多稀有放線菌偏好的氮源（酪蛋白酸鈉和天門冬氨酸）、碳源及良好的緩沖體系有關(guān)。ISP2和GA培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，盡管分離得到的放線菌較多，但主要是土壤放線菌的優(yōu)勢菌群鏈霉菌。相對寡營養(yǎng)的MG和HV培養(yǎng)基適用于分離部分放線菌，最終得到的放線菌數(shù)量較少，當(dāng)然，這也與預(yù)處理后土壤中的放線菌的種類有一定關(guān)系。

2.2.2""代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析""將33株代表菌株在EzBioCloud網(wǎng)站上進(jìn)行相似性比對，下載最相近的模式菌株，然后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。有4株菌與已知的相似性最高的模式菌株有100%的相似性，有25株介于99.0%～99.9%之間，還有4株在99.0%以下，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹上這些菌株均與最相近的模式菌株聚在一起（圖4）。

目前國際上的通用規(guī)則是16S"rRNA基因序列相似性小于98.7%的菌株即為新種[19]。從老鼠簕根際土壤分離的代表菌株中，062120與Streptomyces"rameus"LMG"20326T（AJ781379）的相似性為"98.55%，可初步判斷為新種。同時，064303與Streptomyces"prasinosporus"NRRL"B-12431T（DQ026655）的相似性為98.77%，062409與Streptomyces"jiujiangensis"JXJ"0074T（KF938657）的相似性為98.92%，063201與Streptomyces"sasae"JR-39T（HQ267987）的相似性為98.91%，這些菌株與最相近模式菌株的相似性均比較低，都可能是潛在的新種，說明老鼠簕根際土壤中的放線菌不僅多樣性豐富，而且可能還含有較多新的放線菌資源。

2.2.3""免培養(yǎng)測序與純培養(yǎng)分離獲得放線菌多樣性比較""通過高通量擴增子測序與純培養(yǎng)分離方法從老鼠簕根際土壤樣品中共獲得35個有效鑒定的放線菌屬，說明老鼠簕根際放線菌多樣性非常豐富，同時發(fā)現(xiàn)2種方法獲得的菌屬存在較大差別。

高通量測序從老鼠簕根際土壤樣品中共檢測出33個有效鑒定放線菌屬，而純培養(yǎng)分離到的放線菌只有4個屬，可見大部分的放線菌仍然不能通過純培養(yǎng)獲得。而純培養(yǎng)獲得的紅球菌屬和北里孢菌屬用高通量測序技術(shù)卻未能檢測出。

2.3""抑菌活性初篩及化合物合成基因檢測

對33株代表菌株進(jìn)行聚酮合成酶基因（PKS"I和PKS"II）和非核糖體多肽合成酶基因（NRPS）篩選，由圖5可知，大多數(shù)代表菌株的PKS"II和NRPS基因均呈陽性（PKS"II基因陽性率97.97%，NRPS基因陽性率90.91%），而聚酮合成酶PKS"I基因的陽性率很低（0.09%）。所有的代表菌株都至少有1個功能基因呈陽性。本研究結(jié)果說明老鼠簕根際土壤放線菌在合成聚酮類和非核糖體肽類化合物方面具有較好的潛能。

所有代表菌株的抑菌活性篩選結(jié)果（圖6）表明：24.24%根際放線菌具有抗1種及以上指示菌的活性，其中鏈霉菌062202對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有很強抑菌活性，其抑菌圈分別是22"mm和18"mm。另外，鏈霉菌062305對白色念珠菌具有較強抑菌活性，馬杜拉放線菌062115對金黃色葡萄球菌具有較強抑菌活性。本研究中3類化合物合成基因與抑菌活性之間無直接聯(lián)系，有待于進(jìn)一步研究。

3""討論"

海南省東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)因其獨特的氣候條件和地理環(huán)境，造就了豐富的植物和微生物多樣性。傳統(tǒng)的紅樹植物相關(guān)的研究主要集中在紅樹植物提取物的藥物開發(fā)、內(nèi)生菌的分離與活性篩選，近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，通過結(jié)合高通量測序技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對紅樹植物根系相關(guān)微生物的研究越來越多[4，"20-22]。然而，對熱帶紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中紅樹植物老鼠簕根際的細(xì)菌群落，特別是微生物天然產(chǎn)物的主要生產(chǎn)者——放線菌群落組成的全面了解仍然缺乏。

關(guān)于老鼠簕根際土壤放線菌多樣性，國內(nèi)已有一些相關(guān)報道。王蓉等[23]曾對文昌頭苑、深圳福田和文昌清瀾的老鼠簕根際放線菌、細(xì)菌和真菌進(jìn)行了整體評價分析，但未對老鼠簕根際土壤放線菌的多樣性和主要類群展開分析。唐依莉[24]在非培養(yǎng)和培養(yǎng)水平上對海南文昌和廣西北海老鼠簕的根際土壤放線菌的多樣性進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的分析，在海南文昌和廣西北海的樣品中分別得到38個和39個已注釋的放線菌屬。而本研究中共得到33個已注釋的放線菌屬。雖然得到的放線菌種群數(shù)量接近，但具體的菌屬卻差別較大。在本研究（海南東寨港）得到的已注釋的放線菌屬中，有8個在海南文昌和廣西北海的樣品中均檢測到（Ilumatobacter、Actinomadura、Frankia、Micromonospora，"Mycobacterium、Nocardioides、Pseudonocardia、Streptomyces），有11個在海南文昌的樣品中被檢測到，有15個在廣西北海的樣品中被檢測到，但是仍有18個放線菌屬均未在海南文昌和廣西北海的樣品中出現(xiàn)。同樣，在海南文昌的樣品中得到的已注釋的放線菌屬中，有27個未在本研究中出現(xiàn)，在廣西北海的樣品中得到的已注釋的放線菌屬中，有24個未在本研究出現(xiàn)。在本研究的5份老鼠簕根際土壤樣品中豐度最高的放線菌屬均為Ilumatobacter，而在海南文昌的5份樣品中，豐度最高的放線菌屬分別是Actinoallomurus、Streptomyces、Micromonospora、Actinoallomurus、Micromonospora，在廣西北海的4份樣品中豐度最高的放線菌屬分別是Mycobacterium、Ilumatobacter、Micromonospora、Ilumatobacter。因此，可以得知本研究5份樣品中豐度最高的放線菌屬和廣西北海的2份樣品中的相同，而和海南文昌的5份樣品完全不同。綜上，本研究與海南文昌和廣西北海2個地點老鼠簕根際放線菌的多樣性存在較大差異，綜合分析其主要原因有2個：（1）土壤本身的差異。在海南文昌和廣西北海的研究中是以未附著在根上的土壤為根際土壤，這些研究與當(dāng)時國內(nèi)公認(rèn)的根際土壤的定義吻合[25]，但與目前國際公認(rèn)的根際土壤的定義存在差異。隨著土壤-植物根系-微生物相互關(guān)系研究的不斷深入，國際上將根系相關(guān)隔室進(jìn)行了更為精準(zhǔn)的定義，其中根際土壤指的是直接附著在根周圍且無法抖掉的土，而未直接附著在根周圍且能抖掉的土則被定義為非根際土壤[4，"26]。因此，當(dāng)時的根際土壤，現(xiàn)在已經(jīng)劃歸到非根際土壤的范疇。本研究以目前國際公認(rèn)的根際土壤的采集標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取樣，因此，嚴(yán)格來講，是首次采用符合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的根際土壤進(jìn)行的老鼠簕根際放線菌多樣性分析。（2）選取的測序引物的差異。不同引物的偏好性也可能會造成得到的菌群出現(xiàn)差異。另一方面，在培養(yǎng)水平上，本研究得到的鏈霉菌屬在海南文昌和廣西北海的樣品中均分離得到，本研究得到的馬杜拉放線菌屬在海南文昌的樣品中分離得到，但未在廣西北海的樣品中發(fā)現(xiàn)，而紅球菌屬和北里孢菌均未在海南文昌和廣西北海的樣品中發(fā)現(xiàn)；同樣，在海南文昌樣品中得到的小單孢菌屬，Actinoallomurus、Polymorphospora、Sphaerisporangium、Micr obispora、Actinomycetospora、Actinopolymorpha、Cellulo simicrobium，在廣西北海樣品中得到的Plantactinospora、Microbispora、Actinaurispora、Actinoplanes、Actinomycetospora、Glycomyces、Jishengella均并未在本研究中分離到。在本研究得到的放線菌中豐度最高的是鏈霉菌屬，而在海南文昌和廣西北海的樣品中得到最多的是小單孢菌屬，其次是鏈霉菌屬。造成培養(yǎng)水平上存在較大差異的原因也是多方面的，主要有以下幾點：（1）和上述非培養(yǎng)水平上一樣，土壤本身存在差異；（2）選擇的分離培養(yǎng)基不同，海南文昌和廣西北海選用的是OA5、OA7、OA9、1/10"ATCC172、RH、SM2這6種分離培養(yǎng)基，而本研究選擇的是AI、MG、ISP2、GA、HV這5種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的差異會直接影響分離到的放線菌的菌群分布情況；（3）本研究選用的抗生素類型與海南文昌和廣西北海的研究類似，為了重復(fù)篩選問題，參考相關(guān)文獻(xiàn)[27]，適當(dāng)提高了抗生素的濃度，這也是本研究得到的放線菌的數(shù)量相對較少的原因，同時也是本研究能篩選到較多潛在的新放線菌的重要原因。

本研究通過高通量測序和純培養(yǎng)的方法進(jìn)行研究，共獲得35個有效鑒定的放線菌屬，且2種方法得到的放線菌的群落表現(xiàn)出明顯的多樣性差異。此外，通過對功能基因的預(yù)測、純培養(yǎng)菌株的16S"rRNA基因序列比對、化合物合成基因的檢測和抗菌活性檢測，顯示老鼠簕根際中蘊藏著較多的潛在放線菌新種和具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的放線菌菌株。總體來說，本研究結(jié)果得出東寨港紅樹林紅樹植物根際放線菌具有豐富的多樣性和藥物開發(fā)潛能，是重要的微生物資源。

本研究先利用高通量測序從門水平上對老鼠簕根際土壤的細(xì)菌群落進(jìn)行了整體的分析。變形菌門是老鼠簕根際土壤中的第一優(yōu)勢菌門。具有高度多樣性的變形菌廣泛存在于海洋環(huán)境中，參與重要的養(yǎng)分循環(huán)過程[28]。本研究的重點對象放線菌門也是優(yōu)勢菌門之一。眾所周知，放線菌是臨床上先導(dǎo)化合物的主要生產(chǎn)者[29]，是生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的杰出參與者。

根系相關(guān)微生物多樣性受地理位置、宿主植物、生境、土壤類型等多方面的影響。本研究選擇熱帶地區(qū)紅樹植物老鼠簕根際土壤為研究對象，通過高通量測序和傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對其中的放線菌的多樣性進(jìn)行了比較和分析。從結(jié)果可以看出，2種方法得到的放線菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差別，高通量測序注釋得到的放線菌在物種多樣性上遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)，并且發(fā)現(xiàn)了大量的未知放線菌類群，此方法能更大程度地反映根際土中的微生物組成情況，并能預(yù)測微生物群落的一些功能，為后續(xù)純培養(yǎng)獲得更多目標(biāo)物種提供依據(jù)。但是，高通量測序并未覆蓋到所有的純培養(yǎng)放線菌，表明高通量測序方法也有一定的局限性，先前的研究也證實了這一點[24]。此外，2種方法得到的優(yōu)勢菌屬差別也較大，純培養(yǎng)得到的最大優(yōu)勢屬是鏈霉菌屬，而高通量測序得到的最大優(yōu)勢屬則是Ilumatobacter。2種方法得到的結(jié)果存在差異，主要有以下2個因素：（1）選取的16S"rRNA基因V3～V4區(qū)序列不足以分辨所有放線菌群落導(dǎo)致放線菌無法被檢測出；（2）在純培養(yǎng)的過程中，為了除去生長較快的細(xì)菌、真菌，采用的預(yù)處理方式（風(fēng)干土壤、濕熱等）和選擇性分離方法（添加抗生素、不同的培養(yǎng)基成分等）均會對獲得的放線菌種群產(chǎn)生影響。因此，為了獲得更全面的根際放線菌的多樣性，需要將高通量測序和純培養(yǎng)方法結(jié)合起來進(jìn)行分析，2種方法是相互補充的關(guān)系。本研究為系統(tǒng)地發(fā)掘根際放線菌資源，深入探索新的生物活性微生物天然產(chǎn)物提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

致謝：樣品采集得到海南東寨港國家級自然保護(hù)區(qū)管理局工作人員的大力協(xié)助。

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