劍麻斑馬紋病抗病新品種

摘""要：斑馬紋病是劍麻的主要病害之一，嚴(yán)重影響了劍麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，目前關(guān)于斑馬紋病的致病機(jī)制尚不清楚。為了培育出劍麻斑馬紋病抗病新品種，本研究分別以劍麻斑馬紋病抗病品種粵西114和感病品種H.11648為父母本進(jìn)行回交，獲得回交后代熱麻1號(hào)劍麻。利用常規(guī)方法對(duì)熱麻1號(hào)劍麻葉形、葉色、葉緣刺有無、葉緣刺類型、葉頂刺類型、葉長(zhǎng)、葉寬、葉基厚度、頂刺長(zhǎng)、頂刺基部寬、株高、花序形狀、花軸高、花梗數(shù)、花、果實(shí)、種子、年展葉數(shù)、周期展葉數(shù)、生命周期、纖維率等進(jìn)行分析，采用壁低滲火焰干燥法、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合菌斑接種法對(duì)熱麻1號(hào)劍麻倍性、基因組大小以及對(duì)煙草疫霉的抗性等進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：熱麻1號(hào)劍麻葉片劍形、肉質(zhì)、剛硬、葉片灰綠，葉面平整有蠟粉，葉頂有1.2～2.0"cm銳刺，葉緣無刺，葉片繞莖呈螺旋狀排列上升；葉長(zhǎng)約130"cm，葉寬約16"cm，葉基厚度約3.5"cm。株高1.8～2.5"m，圓錐形花序，花軸高3～7"m，花梗數(shù)20～32個(gè)，完全花、花黃色、花瓣6枚；蒴果、長(zhǎng)圓形、成熟時(shí)黑褐色，種子半月形，黑色、紙質(zhì)；周期展葉360～400片；纖維率約3.5%，纖維長(zhǎng)約100"cm；生命周期6～9"a；熱麻1號(hào)劍麻為四倍體（2X=4n），染色體數(shù)目為104～118，2C"DNA含量為11.69"pg，對(duì)煙草疫霉高度抗病或免疫，有望成為劍麻斑馬紋病發(fā)病區(qū)的先鋒品種。

關(guān)鍵詞：熱麻1號(hào)劍麻；斑馬紋病；抗性中圖分類號(hào)：S563.8""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

A"New"Variety"Rema"No."1"of"Anti—zero"Disease

ZHANG"Yanmei，"LI"Junfeng，"LU"Junying，"ZHAO"Yanlong，"LU"Zhiwei，"YANG"Ziping，"KE"Zhi，"ZHOU"Wenzhao*

South"Subtropical"Crops"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Tropical"Crops"Nutrition"of"Hainan"Province"/"Zhanjiang"City"Key"Laboratory"for"Tropical"Crops"Genetic"Improvement，"Zhanjiang，"Guangdong"524091，"China

Abstract："The"sisal"zebra"disease，"caused"by"fungal"pathogen"Phytophthora"nicotianae"Breda，"is"one"of"the"main"diseases"in"sisal，"which"seriously"affects"the"development"of"sisal"industry."The"pathogenic"mechanism"is"not"clear"up"to"now."In"order"to"obtain"new"anti-zero"disease"sisal"variety，"Yuexi"114"and"H.11648"were"used"as"the"parents"to"breed"new"offsprings."Rema"No.1"is"one"of"the"backcross"progenies"of"Yuexi"114"and"H.11648."Morphological"traits"including"leaf"shape，"leaf"color，"have/none"marginal"spine，"apical"spine"type，"leaf"length，"leaf"width，"thickness"of"leaf"base，"length"of"apical"spine，"and"spine"basal"width，"plant"height，"inflorescence"shape"and"flower"stalk"height，"number"of"pedical，"flower，"fruit"and"seed"characters，"number"of"leaf，"fiber"ratio"were"examined."Ploidy"level，"genome"size"and"resistance"to"P."nicotianae"Breda"was"determined"by"an"analysis"of"wall"removal"and"low"permeability"flame"drying"method，"flow"cytometry，"and"inoculating"P."nicotianae"Breda"in"field"and"lab"respectively."Rema"No.1"is"characterized"by"the"presence"of"gray"green，"fleshier"and"rigid，"sword-leaf"with"wax"powder"on"the"leaf"surface，"1.2?2.0"cm"apical"spine，"none"marginal"spine."Leaf"length，"leaf"width"and"leaf"base"is"about"130"cm，"16"cm，"and"3.5"cm，"respectively."The"leaves"rise"in"a"spiral"arrangement"around"the"stem."Rema"No.1"is"also"characterized"by"plant"height"1.8?2.5"m，"flower"stalk"3?7"m，"paniculate"inflorescence，"with"20?32"pedicals，"complete"flower，"yellow"flower"with"6"petals，"oblong"capsule，"dark"brown"to"almost"black"upon"maturity，"lunate"black"seeds，"marginate."leaves"360?400，"leaf"fiber"ratio"3.5%，"fiber"length"100"cm."The"life"span"is"6?9"years."Rema"No1"is"tetraploid（2X=4n），"chromosome"number"is"between"104?118，"the"genome"size"of"Rema"No."1"is"2C=11.69"pg."Rema"No.1"is"high"resistant"to"Phytophthora"nicotianae"Breda，"and"would"be"the"main"cultures"in"high"incidence"area"of"zero"leaf"disease"in"sisal"planting"region.

Keywords："Rema"No.1;"zero"disease;"resistance

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.009

劍麻是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物之一，其纖維質(zhì)地堅(jiān)韌、富于彈性、拉力強(qiáng)、抗撕裂、耐磨、防腐以及耐低溫等，廣泛應(yīng)用于國(guó)防、漁業(yè)、交通運(yùn)輸以及冶金等領(lǐng)域[1-2]，隨著材料科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，通過添加劍麻纖維改進(jìn)新型復(fù)合材料及其衍生材料的性能[3]，擴(kuò)大復(fù)合材料在軍事以及多種民用制造業(yè)中的應(yīng)用，對(duì)推動(dòng)我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展起到了非常重要的作用。同時(shí)劍麻在食品科學(xué)[4-6]、醫(yī)學(xué)[7]、生物質(zhì)能源[8]以及作物遺傳改良[9]等方面應(yīng)用廣泛，因此，加快劍麻種質(zhì)創(chuàng)新，對(duì)推動(dòng)我國(guó)經(jīng)濟(jì)長(zhǎng)期穩(wěn)定發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

斑馬紋病是劍麻的主要病害之一，主要由煙草疫霉（Phytophthora"nicotianae"Breda）引起，因斑馬紋病導(dǎo)致大面積麻園被毀，纖維產(chǎn)量下降，嚴(yán)重影響了國(guó)內(nèi)外劍麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10-11]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該病進(jìn)行了大量研究，目前已形成了一套完整的病原菌分離、鑒定和防治技術(shù)[12]。同時(shí)，在劍麻種質(zhì)資源抗性鑒定、抗斑馬紋病生理生化機(jī)制、功能基因挖掘以及轉(zhuǎn)基因等方面也開展了研究[13-17]，取得了一定進(jìn)展，但抗病機(jī)制和致病機(jī)理仍不清楚。由于長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境和生物多樣性破壞嚴(yán)重，因此，培育出抗斑馬紋病新品種，仍然是育種學(xué)家們一直以來的首要目標(biāo)。20世紀(jì)80年代初，育種學(xué)家們以主栽品種H.11648為母本，普通劍麻為父本，通過有性雜交培育出來F1代雜交品種粵西114，粵西114的特點(diǎn)是抗斑馬紋病，對(duì)莖腐病也有一定抗性，但該品種葉基厚、葉緣有刺、生命周期短，在后續(xù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)斑馬紋病抗性不穩(wěn)定[18]。為了穩(wěn)定和提高粵西114的優(yōu)良性狀，本研究利用粵西114與H.11648回交，獲得雜交F2代，通過對(duì)雜交F2代葉緣刺有無、葉長(zhǎng)、葉寬、株高、葉基厚度、年產(chǎn)葉數(shù)、周期產(chǎn)葉數(shù)、纖維率、抗病性、抗寒性等多個(gè)性狀綜合評(píng)價(jià)，初步篩選出葉緣無刺、長(zhǎng)勢(shì)良好、抗性比親本粵西114和H.11648強(qiáng)的優(yōu)良單株、然后在廣東、廣西等劍麻主產(chǎn)區(qū)開展品比試驗(yàn)和區(qū)域性試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選出了綜合長(zhǎng)勢(shì)良好，葉緣無刺、對(duì)斑馬紋病高度抗病的劍麻新品種——熱麻1號(hào)劍麻。該品種2015年獲得廣東省品種登記權(quán)。由于熱麻1號(hào)劍麻生命周期比主栽品種H.11648短，周期產(chǎn)業(yè)數(shù)比主栽品種H.11648少，熱麻1號(hào)劍麻目前常用于劍麻斑馬紋病病區(qū)補(bǔ)植品種和優(yōu)良雜交親本，還未廣泛推廣應(yīng)用。

1""材料與方法

1.1""材料

H.11648、粵西114和熱麻1號(hào)劍麻保存在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所劍麻種質(zhì)圃。Zea"mays"cv."CE777玉米種子由Dole?el友情提供。

1.2""方法

1.2.1""親本選擇及雜交""以斑馬紋病抗病品種粵西114為母本，以主栽品種H.11648為父本進(jìn)行人工雜交，待果實(shí)成熟后取出種子并播種育苗，植株生長(zhǎng)到30"cm左右，根據(jù)植株的表型特征如葉緣有/無刺、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)、株型、葉基厚度等，結(jié)合育種目標(biāo)初步篩選出候選材料，作為進(jìn)一步鑒定的優(yōu)株。

1.2.2""形態(tài)學(xué)特征觀測(cè)""隨機(jī)選取10株成齡劍麻，每株3片葉片，對(duì)熱麻1號(hào)劍麻株型、葉片伸展模式、葉形、葉色、葉緣刺有無、葉緣刺類型、葉頂刺類型、葉片有無蠟粉、葉長(zhǎng)、葉寬、葉基厚度、頂刺長(zhǎng)、頂刺基部寬、株高、花軸高、花梗數(shù)、花、果實(shí)、種子等性狀進(jìn)行觀測(cè)，其中質(zhì)量性狀用肉眼觀測(cè)，數(shù)量性狀用卷尺進(jìn)行測(cè)定。葉長(zhǎng)為葉基部到頂刺的距離（包括頂刺），葉寬為葉片最寬處的寬度，株高為植株基部到葉片頂端的高度，株高、花軸高、花梗數(shù)、花色、花序形狀等在植株開花后測(cè)量，果實(shí)以及種子等數(shù)據(jù)在果實(shí)成熟時(shí)收集。所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.2.3""纖維特性測(cè)定""待葉片成熟后，收割葉片，稱量鮮葉重量，然后加工收獲纖維，待纖維晾干后稱取干纖維重量，計(jì)算纖維率，同時(shí)用拉力測(cè)量?jī)x測(cè)量纖維拉力大小。纖維率=干纖維重/鮮葉重′100%。

1.2.4""斑馬紋病抗性鑒定""大田抗病性測(cè)定：以熱麻1號(hào)劍麻為試驗(yàn)對(duì)象，以H.11648和粵西114為對(duì)照，在雨季來臨前種植于斑馬紋病重病發(fā)病區(qū)，雨季過后調(diào)查斑馬紋病發(fā)病情況，具體參考趙艷龍等[12]的方法進(jìn)行。室內(nèi)抗病性鑒定：采用盆栽和離體葉片2種接種方式，取斑馬紋病病菌接種于提前準(zhǔn)備好的H.11648、粵西114和熱麻1號(hào)劍麻葉片上，用棉花保濕，分別在接種24、48、72"h和7"d測(cè)定病班大小，具體參照張燕梅等[2]的方法進(jìn)行。

1.2.5""根尖染色體檢測(cè)""分別取熱麻1號(hào)劍麻、H.11648和粵西114根尖約1"cm，先用0.002"mol/L濃度的8-羥基喹啉預(yù)固定2"h，然后用卡諾固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3：1）固定過夜，用5%纖維素酶和果膠酶（纖維素酶∶果膠酶=1：1）37"℃孵育1"h后快速涂片并火焰干燥，最后用5%"Giemsa染色10～15"min，在顯微鏡（ZEISS"Axiolmager"M2）下觀察染色體數(shù)目，并拍照保存。

1.2.6""基因組大小測(cè)定""取熱麻1號(hào)、H.11648和粵西114組培苗葉片，以玉米（Zea"mays"cv."CE777）為標(biāo)準(zhǔn)樣品（standard"plant），用流式細(xì)

胞儀（Partec）測(cè)定基因組大小，具體參照PALOMINO等[19]的流式細(xì)胞儀方法測(cè)定，待測(cè)樣品2C"DNA含量（pg）=待測(cè)樣品峰圖位置對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度/標(biāo)準(zhǔn)樣品峰圖位置對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值′標(biāo)準(zhǔn)樣品2C"DNA含量。

1.3""數(shù)據(jù)處理

病斑大小用直尺測(cè)量并用Excel軟件分析數(shù)據(jù)和作圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""表型特征及纖維特性

熱麻1號(hào)劍麻植株高大，約1.9"m，葉片向上螺旋排列，灰綠色，肉質(zhì)剛直，葉劍形，表面平整，有少量蠟粉，葉緣無刺，葉尖有1.6～2.0"cm黑褐色堅(jiān)硬的銳刺，葉長(zhǎng)120～135"cm，葉寬15～"17"cm，葉基厚度約3.5"cm，年展葉45～55片，周期展葉數(shù)360～400片。圓錐花序，花軸高5.1～"5.5"m，花梗數(shù)20～32個(gè)，完全花，花黃色，花被淺淡黃色，下部聯(lián)合形成萼筒，上部分裂成6片花瓣，雌蕊1枚，柱頭3裂，子房下位，自交結(jié)實(shí)。蒴果，長(zhǎng)圓形，果實(shí)大小約5"cm′6"cm，早期為綠色，成熟后為黑褐色。每個(gè)果實(shí)里約300枚種子，種子半月形，成熟后為黑色，紙質(zhì)扁平，有光澤。生命周期為6～9"a，葉片纖維含量為3.5%，纖維細(xì)而均勻，長(zhǎng)度為110"cm，纖維拉力為66.2"kg、束纖維強(qiáng)力為649"N（圖1）。

2.2""倍性和基因組大小測(cè)定

根尖染色體觀測(cè)表明，熱麻1號(hào)劍麻染色體數(shù)目為104～118，長(zhǎng)染色體和中等長(zhǎng)度的染色體共計(jì)20條，其余染色體為棒狀或點(diǎn)狀，為四倍體。H.11648染色體數(shù)目為48～60條，長(zhǎng)染色體和中等長(zhǎng)度的染色體共10條，為二倍體?；浳?14染色體數(shù)目為101～112條，其中長(zhǎng)染色體和中等長(zhǎng)度的染色體共20條，為四倍體（圖2）。流式細(xì)胞儀分析顯示，熱麻1號(hào)劍麻、H.11648和粵西114分別在熒光強(qiáng)度402、244和403處出現(xiàn)了峰圖，分別為四倍體、二倍體和四倍體，基因組大小2C分別為11.69、7.07、11.74"pg（圖3）。

2.3"nbsp;斑馬紋病抗性檢測(cè)

大田抗病試驗(yàn)表明，H.11648、粵西114和熱麻1號(hào)劍麻抗病指數(shù)分別為78.1、63.2和22.4，

對(duì)斑馬紋病菌表現(xiàn)為高度感病，中度感病和高度抗病[12]。盆栽試驗(yàn)和離體葉片接種后發(fā)現(xiàn)，H.11648病斑最大，2019—2021年連續(xù)3"a接種煙草疫霉，每年接種1周后觀測(cè)發(fā)現(xiàn)病斑大小均超過15"cm，粵西114次之，2019年約10"cm，2021年約15"cm，2020年約2"cm，抗性極不穩(wěn)定，熱麻1號(hào)劍麻除傷口處有與傷口相同大小的約0.6"cm褐斑外，隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，病斑沒有進(jìn)一步擴(kuò)展，檢測(cè)結(jié)果與大田試驗(yàn)一致，且2019、2020和2021年接種結(jié)果均不變，即熱麻1號(hào)劍麻對(duì)煙草疫霉的抗性遠(yuǎn)超過親本H.11648和粵西114，對(duì)斑馬紋病菌表現(xiàn)為高度抗病（圖4）。

3""討論

培育抗病高產(chǎn)劍麻新品種一直是劍麻育種的首要目標(biāo)，采取的方式方法也多種多樣，比如人工雜交、化學(xué)誘變、細(xì)胞融合、單倍體育種、基因工程以及基因編輯等，其中人工雜交是較為常用的方法之一，在此過程中，親本的選擇尤為重要。H.11648是目前劍麻產(chǎn)業(yè)中唯一的主栽品種，平均年長(zhǎng)葉60～70片，周期長(zhǎng)葉560～650片，纖維率5%以上，生長(zhǎng)周期10"a以上，綜合性狀優(yōu)

良，常常作為重要的親本材料廣泛應(yīng)用于劍麻育種，但H.11648易感斑馬紋病?；浳?14是H.11648與普通劍麻的雜交F1代，通過長(zhǎng)期試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，該品種對(duì)斑馬紋病菌表現(xiàn)為較強(qiáng)的抗病性，但抗性不穩(wěn)定，因此，利用粵西114和H.11648為親本進(jìn)行雜交，有望獲得抗病高產(chǎn)的新品種。熱麻1號(hào)劍麻是粵西114和H.11648回交子代，對(duì)斑馬紋病菌高度抗病甚至免疫，并且抗性穩(wěn)定，此外，熱麻1號(hào)劍麻耐旱耐寒，速生粗長(zhǎng)，本研究室前期在云南元謀干熱河谷區(qū)的品種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱麻1號(hào)劍麻在云南干熱河谷區(qū)生長(zhǎng)較其他品種要好，因此，可以廣泛應(yīng)用于云南干熱河谷區(qū)生態(tài)恢復(fù)。由于熱麻1號(hào)劍麻生產(chǎn)周期短，纖維含量比H.11648低，目前常作為抗性雜交親本使用，暫時(shí)還未推廣應(yīng)用。隨著育種工作的不斷推進(jìn)，目前已從熱麻1號(hào)劍麻的自交子代和雜交后代中相繼篩選出部分優(yōu)良單株，進(jìn)一步的品種區(qū)域試驗(yàn)正在進(jìn)行，有望獲得產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)的劍麻優(yōu)良品種，因此，有一定的應(yīng)用前景。

根尖分生組織細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，常用于染色體觀察，并且相對(duì)于流式細(xì)胞儀倍性分析而言，染色體觀察能更直觀地觀察到染色體數(shù)目，形態(tài)特征等。本研究結(jié)果顯示粵西114染色體數(shù)目為102～114條，根據(jù)中長(zhǎng)染色體數(shù)目，結(jié)合流式細(xì)胞儀分析結(jié)果判定為四倍體，染色體形態(tài)正常，未檢測(cè)到三倍體和絲狀小染色體，這與LV等[20]研究結(jié)果有一定差異，可能與劍麻復(fù)雜的倍性，以及自然條件下容易變異有關(guān)[21-24]。建議擴(kuò)大觀測(cè)樣本數(shù)量，防止實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。此外，粵西114的母本H.11648為二倍體，父本普通劍麻為五倍體，有望獲得三倍體和四倍體的子代粵西114。四倍體的粵西114和二倍體的H.11648回交獲得四倍體熱麻1號(hào)劍麻，一方面說明劍麻遺傳的復(fù)雜性，同時(shí)也證實(shí)了劍麻多倍體和非整倍體廣泛存在，變異頻繁而且比例還很高的觀點(diǎn)[21-22]，因此，建議在雜交親本選擇時(shí)，盡量不選或少選多倍體。

流式細(xì)胞術(shù)作為一種高效快速的倍性鑒定和DNA含量分析方法，在劍麻種質(zhì)資源鑒定與評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛[23-24]。該方法能快速直觀地檢測(cè)出目標(biāo)樣本的倍性，而且靈敏度高，尤其對(duì)于大樣本，省時(shí)省力。由于流式細(xì)胞術(shù)無法直觀展示染色體的核型特征，染色體是否丟失或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等信息，建議在進(jìn)行分析時(shí)，將流式檢測(cè)技術(shù)與常規(guī)的染色體制片技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步分析染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及倍性。

前人研究表明劍麻染色體基數(shù)為30，其中5條長(zhǎng)染色體，25條相對(duì)小染色體，隨著倍性增加，染色體條數(shù)成比例增加[20]。熱麻1號(hào)劍麻和粵西114染色體數(shù)目存在較大出入，一方面可能是實(shí)驗(yàn)操作過程中小染色體降解或丟失，也可能是不正常減數(shù)分裂，如丟失、交換等，或非整倍體存在等多種因素所致，同時(shí)這也會(huì)導(dǎo)致在加倍過程中基因組變小[25]。ROBERT等[21]以洋蔥（Allium"cepa"cv."Ailsa"Craig）為參考基因組，對(duì)H.11648等龍舌蘭屬劍麻7個(gè)品種進(jìn)行基因組大小分析，結(jié)果顯示H.11648基因組4C"DNA為15.23"pg，本研究以玉米（Zea"mays"cv."CE777）為參考基因組，顯示H.11648基因組2C"DNA為7.07"pg，另外，從理論而言，熱麻1號(hào)劍麻和粵西114為四倍體，2C"DNA為H.11648的2倍，約14.14"pg，實(shí)際分析結(jié)果分別為11.69"pg和11.74"pg，出入較大，可能與參考基因組的選擇有關(guān)。MORENO-"SALAZAR[26]、PALOMINO[27]和ROBERT等[21]分別在對(duì)Agave"angustifolia"Haw進(jìn)行基因組大小分析時(shí)，以玉米（Zea"mays"cv."CE777）為參考基因組，2C"DNA為8.499"pg[26]和8.477"pg[27]，以洋蔥（Allium"cepa"cv."Ailsa"Craig）為參考基因組，2C"DNA為7.45"pg[20]。DOLE?EL等[24]認(rèn)為，為了降低試驗(yàn)結(jié)果誤差，應(yīng)選取與研究對(duì)象基因組大小相近的物種作為參考基因組。

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