香蕉枯萎鐮刀菌4號(hào)生理小種FoSP1基因功能的初步分析

摘""要：香蕉枯萎病是我國(guó)香蕉生產(chǎn)中危害最大，且難以防治的一種真菌病害。由于香蕉枯萎病的影響，我國(guó)近年來(lái)香蕉種植面積逐年減少，給我國(guó)亞熱帶、熱帶香蕉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病害是由于香蕉的維管束受到病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium"oxysporum"f."sp."cubense，"Foc）入侵而發(fā)生，其繁殖速度快，引起香蕉葉片黃化和植株萎蔫。通過(guò)比較Foc1號(hào)生理小種（Foc1）N2菌株和4號(hào)生理小種（Foc4）B2菌株的基因組及轉(zhuǎn)錄組序列，篩選出位于基因組特異區(qū)間并且表達(dá)量較高的分泌蛋白FoSP1。結(jié)果表明：FoSP1基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?87"bp，編碼129個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于第20～21位氨基酸殘基之間，且該蛋白無(wú)任何已知的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)，因此推斷出FoSP1是一個(gè)新的分泌蛋白。為了研究該蛋白在Foc4菌株中的生物學(xué)作用，本研究利用split-marker的方法敲除了B2菌株的FoSP1基因，并對(duì)獲得的正確敲除突變體進(jìn)行表型分析和致病性測(cè)定。結(jié)果表明：相比野生型B2菌株，F(xiàn)oSP1基因敲除突變體菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，對(duì)NaCl、山梨醇和H2O2等外源脅迫均表現(xiàn)不敏感，但敲除突變體的產(chǎn)孢量和分生孢子萌發(fā)率顯著降低，且對(duì)巴西蕉苗的致病力明顯減弱。由此推測(cè)分泌蛋白FoSP1不參與Foc4菌株B2的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但在其產(chǎn)孢及致病的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。此結(jié)果為進(jìn)一步研究Foc4基因組特異區(qū)間分泌蛋白的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：尖孢鐮刀菌古巴?；?；FoSP1；分泌蛋白；基因敲除；致病性

中圖分類號(hào)：Q945.8""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Preliminary"Analysis"of"FoSP1"Gene"Function"of"Fusarium"oxysporum"f."sp."Cubense"Race4

ZHAO"Jiujuan1，2，"LI"Min1，"HU"Meijiao1，"YANG"Jinyu1，3，"HE"Ying1，4，"LIU"Zhiqiang2，"SUN"Jinhua1*

1."Environment"and"Plant"Protection"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."School"of"Life"and"Health"Sciences，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"3."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"4."Center"for"Research"and"Development"of"Fine"Chemicals，"Guizhou"University，"Guiyang，"Guizhou"550025，"China

Abstract："Banana"Fusarium"wilt"is"a"fungal"disease"which"is"the"most"harmful"and"difficult"to"control"in"banana"production"in"China."Due"to"the"influence"of"banana"Fusarium"wilt，"the"banana"planting"area"in"China"has"been"decreasing"year"by"year"in"recent"years，"which"has"brought"huge"economic"losses"to"the"subtropical"and"tropical"banana"industries"in"China."The"disease"occurred"because"the"vascular"bundle"of"banana"was"invaded"by"Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense"（Foc），"and"its"propagation"speed"was"fast，"which"caused"the"yellowing"of"banana"leaves"and"plant"wilting."By"comparing"the"genome"and"transcriptome"sequences"of"Foc"race"1"（Foc1，"N2）"and"race"4"（Foc4，"B2），"a"secreted"protein"FoSP1"located"in"the"lineage-specific"region"with"high"expression"was"screened"out."The"results"showed"that"the"open"reading"frame"of"FoSP1"gene"was"387"bp，"encoding"129"amino"acids，"and"its"signal"peptide"cleavage"site"was"located"between"the"20th"and"21st"amino"acid"residues，"and"the"protein"had"no"known"domain"and"functional"site，"so"it"was"inferred"that"FoSP1"was"a"new"secreted"protein."In"order"to"study"the"biological"function"of"the"protein"in"Foc4"strain，"the"split-marker"method"was"used"to"knock"out"the"FoSP1"gene"of"B2"strain，"and"the"phenotype"analysis"and"pathogenicity"determination"of"the"correctly"knocked-out"mutant"were"carried"out."The"results"showed"that"compared"with"wild-type"B2"strain，"there"was"no"significant"difference"in"the"vegetative"growth"of"FoSP1"gene"knockout"mutants，"and"they"were"insensitive"to"exogenous"stresses"such"as"NaCl，"D-sorbitol"and"H2O2，"but"the"conidial"yield"and"germination"rate"of"knockout"mutants"were"significantly"reduced，"and"their"pathogenicity"to"Brazilian"banana"was"significantly"weakened."It"is"inferred"that"the"secreted"protein"FoSP1"does"not"participate"in"the"vegetative"growth"of"B2"strain"，"but"plays"an"important"role"in"the"process"of"sporulation"and"pathogenicity."This"result"lays"a"foundation"for"further"study"on"the"pathogenic"mechanism"of"secreted"proteins"in"the"genome"lineage-specific"region"of"Foc4.

Keywords："Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense;"FoSP1;"secreted"protein;"gene"knockout;"pathogenicity

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.004

作為香蕉的主產(chǎn)國(guó)之一，我國(guó)有著悠久的香蕉種植史。目前，香蕉是我國(guó)熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。香蕉枯萎病是我國(guó)香蕉生產(chǎn)中危害最大，且難以防治的一種真菌病害，由于香蕉枯萎病的影響，我國(guó)近年來(lái)香蕉種植面積逐年減少，給我國(guó)亞熱帶、熱帶香蕉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病害是由于香蕉的維管束受到病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium"oxysporum"f."sp."cubense，"Foc）入侵而發(fā)生。作為一種土傳病害，該病原菌可從根系侵入，定殖維管束從而引起香蕉葉片黃化和植株萎蔫。其繁殖速度快，能隨帶病蕉苗傳播擴(kuò)散，致病力極強(qiáng)，并且能夠在土壤中存活幾十年[2]。尖孢鐮刀菌古巴?；陀?個(gè)生理小種，其中，4號(hào)生理小種（Foc4）能夠侵染幾乎所有品種的香蕉，對(duì)香蕉的危害性與毀滅性最大[3-4]。

分泌蛋白是一類在生物體內(nèi)合成和加工成熟的多肽，經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜分泌到胞外，參與對(duì)周圍環(huán)境的感知和生物間的相互作用[5]。分泌蛋白一般具有4個(gè)基本特征，最主要特征是它的氨基酸序列具有Ｎ端信號(hào)肽序列，其次是分泌蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不具有將蛋白輸送到線粒體以及其他胞內(nèi)細(xì)胞器的預(yù)測(cè)定位信號(hào)序列，并且沒(méi)有糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，"GPI）錨定位點(diǎn)[6]。植物病原真菌的一些分泌蛋白在其致病過(guò)程中起著重要的作用。郭立佳等[7]發(fā)現(xiàn)假定分泌蛋白SP10參與Foc4對(duì)香蕉致病性的調(diào)控；DOEHLEMANN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，敲除玉米黑穗病菌分泌蛋白基因pep1的敲除突變體菌株無(wú)法正常侵入宿主細(xì)胞；SAITOH等[9]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌侵染水稻時(shí)，分泌蛋白MC69對(duì)病原菌侵染菌絲的形成是必需的。

在前期的研究中，本研究團(tuán)隊(duì)基于三代Pacbio"CCS測(cè)序技術(shù)組裝完成了Foc1（菌株編號(hào)：N2）和Foc4（菌株編號(hào)：B2）T2T完整基因組（結(jié)果待發(fā)表）。通過(guò)比較二者染色體DNA序列，在Foc4菌株的1號(hào)染色體的末端鑒定到Foc4菌株特有而Foc1菌株缺失的約1"Mb大小的基因組特異區(qū)間（Lineage-specific"genomic"region，"LSGR）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該基因組特異區(qū)間相對(duì)于染色體其它區(qū)域，預(yù)測(cè)的分泌蛋白（N端帶信號(hào)肽且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域）顯著富集。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從中選擇1個(gè)具有一定表達(dá)值且富含半胱氨酸（含量為8.5%）的分泌蛋白Foc4_01G021900.1作為研究對(duì)象，命名為FoSP1。本研究采用split-marker方法對(duì)FoSP1基因進(jìn)行敲除，通過(guò)比較突變體與野生型的表型和致病力差異，明確分泌蛋白FoSP1在B2菌株中的生物學(xué)功能，以期為研究基因組特異區(qū)間分泌蛋白的致病機(jī)制提供新的方向和思路。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試香蕉品種""巴西蕉（Musa"sp."AAA）試管苗由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織培養(yǎng)中心提供。試管苗經(jīng)沙床煉苗1個(gè)月，后移栽到椰糠和砂土1∶1的基質(zhì)上。待蕉苗達(dá)5～6葉齡，且株高20～30"cm時(shí)進(jìn)行接種試驗(yàn)。

1.1.2""菌株、質(zhì)粒""Foc4"B2菌株及質(zhì)粒pCT74［含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hyg）］均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3""引物設(shè)計(jì)""從測(cè)序結(jié)果中查找并提取FoSP1基因及其上、下游1500"bp的堿基序列，根據(jù)目的基因上、下游基因序列以及hyg的堿基序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建基因敲除融合片段所需的PCR引物和目的基因內(nèi)、外部驗(yàn)證引物，該引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.1.4""試劑、酶及培養(yǎng)基""潮霉素B（Hygromycin"B，50"mg/mL）、氨芐青霉素（Amp）、溶壁酶、蝸牛酶、高保真酶、MightyScript第一鏈cDNA合成Master"Mix及50×TAE電泳緩沖液及DNA"marker均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）、2×Taq"PCR"Master"Mix及真菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）均購(gòu)于天根（北京）生化科技有限公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）購(gòu)于Omega"Bio-Tek公司；山梨醇（D-Sorbitol）購(gòu)于北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；2×A8"FastHiFi"PCR"MasterMix購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司；膠回收試劑盒（TaKaRa"MiniBEST"Aga rose"Gel"DNA"Extraction"Kit"Ver.4.0）購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；其他具體試劑詳見(jiàn)試驗(yàn)步驟。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基、TB3液體培養(yǎng)基、TB3固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基和CZAPEK培養(yǎng)基等。

1.2""方法

1.2.1""pCT74質(zhì)粒DNA的提取""將質(zhì)粒pCT74轉(zhuǎn)移至DH5α中，培養(yǎng)后接入LB固體培養(yǎng)基，挑取單菌落接種于3"mL含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37"℃、250"r/min振蕩培養(yǎng)12"h左右。隨后將菌液轉(zhuǎn)移至1.5"mL離心管，12"000"r/min離心1"min，保留沉淀。參照普通質(zhì)粒小提試劑盒的方法提取質(zhì)粒DNA，并對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2""B2菌株基因組DNA的提取""將野生型菌株B2接種到裝有100"mL"PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，180"r/min、28"℃搖床振蕩培養(yǎng)3"d，3層擦鏡紙過(guò)濾收集菌絲，按照植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA。

1.2.3""目的基因的克隆""根據(jù)B2菌株基因組注釋的信息獲取目的基因的全長(zhǎng)序列信息。采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取B2菌株總RNA，然后利用MightyScript第一鏈cDNA合成Master"Mix合成cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），以B2菌株cDNA為模板，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出條帶單一且大小正確的條帶后測(cè)序，將得到的測(cè)序結(jié)果與目的基因的原始序列分別在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定序列的正確性。

1.2.4""FoSP1基因敲除融合片段的構(gòu)建""以提取的B2基因組DNA為模板，F(xiàn)oSP1-AF/FoSP1-AR和FoSP1-BF/FoSP1-BR為引物分別對(duì)FoSP1基因上、下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以提取的pCT74質(zhì)粒DNA為模板，HygF-pCT74/HygR-pCT74為引物對(duì)hyg基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。split-marker重疊PCR擴(kuò)增時(shí)分別以FoSP1基因上游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（A臂）和hyg基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，F(xiàn)oSP1-AF/YGR為引物；以FoSP1基因下游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（B臂）和hyg基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，HYF/FoSP1-BR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有PCR過(guò)程選擇適宜的退火溫度及延伸時(shí)間，優(yōu)化PCR程序條件，對(duì)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5""原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化""B2菌株在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3"d后，挑取菌絲在PDB液體培養(yǎng)基中搖培2"d，收集孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至新的PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18"h，過(guò)濾，收集菌絲并用0.7"mol/L"NaCl沖洗2遍。挑取菌絲加入酶解液（含10"mg/mL溶壁酶和20"mg/mL蝸牛酶），90"r/min搖床裂解3"h。用1×STC調(diào)整原生質(zhì)體濃度為5×107～5×108個(gè)/mL。將原生質(zhì)體（200"μL）和上、下游PCR重疊片段（各10"μL）混勻，冰上靜置30"min，逐滴加入1"mL"40%"PTC，輕搖混勻，室溫下靜置20"min。原生質(zhì)體用加有5"μL"Amp的5"mL"TB3液體培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化，28"℃、50"r/min振蕩培養(yǎng)12"h。將菌液和含hyg抗性的TB3下層固體培養(yǎng)基混勻，倒平板，28"℃培養(yǎng)12"h，倒入含hyg的TB3上層培養(yǎng)基，28"℃培養(yǎng)2～5"d。

1.2.6""FoSP1敲除突變體的篩選與驗(yàn)證""挑取轉(zhuǎn)化子于含hyg的PDA平板，28"℃培養(yǎng)5"d，刮取菌絲提取基因組。以提取的轉(zhuǎn)化子基因組DNA及野生型B2基因組DNA為模板，F(xiàn)oSP1-outsideF/"FoSP1-outsideR作引物進(jìn)行PCR正篩，F(xiàn)oSP1-"insideF/FoSP1-insideR作引物進(jìn)行PCR負(fù)篩，并對(duì)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，只有正、負(fù)篩選擴(kuò)增出的條帶均符合預(yù)期結(jié)果的轉(zhuǎn)化子才能被確定為正確的敲除突變體。

1.2.7""敲除突變體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)表型分析""取野生型菌株和敲除突變體直徑為5"mm的菌餅，分別接種到PDA、CM、MM及CZAPEK培養(yǎng)基上，28"℃培養(yǎng)5"d，測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.8""分生孢子產(chǎn)生及萌發(fā)""取野生菌株和敲除突變體直徑為5"mm的菌餅，分別加入3"mL無(wú)菌水中，震蕩懸浮混勻，計(jì)算每毫升的孢子數(shù)并統(tǒng)計(jì)及比較孢子萌發(fā)率，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.9""脅迫因子敏感性試驗(yàn)""滲透壓脅迫試驗(yàn)：打取直徑為5"mm的野生型和敲除突變體的菌餅分別接種于不同濃度NaCl（1、2"mol/L）和山梨醇（1、2"mol/L）的PDA平板上，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，28"℃培養(yǎng)5"d后觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。過(guò)氧化氫耐受性試驗(yàn)：打取直徑為5"mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，分別接種于含有不同濃度H2O2（0.1%、0.25%、0.5%）的PDA平板上，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，28"℃培養(yǎng)5"d后觀察菌落直徑大小，并拍照記錄。

1.2.10""致病性測(cè)定""將FoSP1基因野生型菌株和敲除突變體菌株分別接種于100"mL的PDB液體培養(yǎng)基中，180"r/min、28"℃搖床振蕩培養(yǎng)3"d，過(guò)濾收集分生孢子并用無(wú)菌水重懸，將孢子懸浮液調(diào)至106個(gè)/mL。野生型菌株與敲除突變體菌株孢子懸浮液分別接種10株巴西蕉幼苗，刺傷根部后每株苗澆50"mL孢子懸浮液，以清水作為對(duì)照。30"d后觀察外部葉片黃化情況，切開(kāi)球莖，觀察球莖褐變程度，拍照記錄并記錄幼苗發(fā)病級(jí)數(shù)，病害分級(jí)及病情指數(shù)計(jì)算參照郭立佳等[10]的方法。數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""FoSP1基因預(yù)測(cè)編碼產(chǎn)物生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)克隆出FoSP1基因的全長(zhǎng)，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為387"bp，其蛋白編碼129個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)（pI）為8.29，其中半胱氨酸含量為8.5%。原子總數(shù)為1869，蛋白分子式為C593H911N169"O182S14，其不穩(wěn)定指數(shù)為51.04，總平均親水性系數(shù)為-0.321，表明該蛋白為親水蛋白，不具有穩(wěn)定性。使用TargetP和SingalP軟件預(yù)測(cè)該蛋白為分泌蛋白，其信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于第20～21位氨基酸殘基之間；TMHMM軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)oSP1蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域；用big-Pi"Predictor軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白沒(méi)有GPI位點(diǎn)；用PROSITE軟件分析結(jié)果顯示，該蛋白無(wú)任何已知的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。因此，F(xiàn)oSP1是一個(gè)新的分泌蛋白。

2.2""構(gòu)建基因敲除線性片段

采用split-marker方法對(duì)FoSP1基因進(jìn)行敲除（圖1）。PCR擴(kuò)增得到1390"bp的潮霉素基因片段以及1297"bp的A臂和1367"bp的B臂；第2輪PCR擴(kuò)增融合片段A-hyg和hyg-B，分別擴(kuò)增出2338、2138"bp的DNA條帶，經(jīng)測(cè)序，結(jié)果與目的條帶序列一致，A-hyg和hyg-B敲除線性片段構(gòu)建成功。

2.3""敲除突變體的PCR鑒定

將FoSP1基因敲除線性片段轉(zhuǎn)化至野生型菌株B2原生質(zhì)體，后經(jīng)再生培養(yǎng)及復(fù)篩，獲得若干轉(zhuǎn)化子，任取其中10個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。正篩結(jié)果顯示，10個(gè)轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出1條約1590"bp的目的條帶，而野生型菌株基因組DNA擴(kuò)增出735"bp的目的條帶（圖2A）；負(fù)篩結(jié)果顯示10個(gè)轉(zhuǎn)化子基因組均未擴(kuò)出條帶，野生型菌株B2基因組擴(kuò)增出1條約416"bp的條帶（圖2B）。將轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段序列一致。以上結(jié)果表明，所挑選的10個(gè)轉(zhuǎn)化子均為FoSP1基因敲除突變體，選取1株用于后續(xù)試驗(yàn)，命名為ΔFoSP1。

2.4nbsp;"基因敲除突變體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)表型分析

在4種不同的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，突變株ΔFoSP1的菌落形態(tài)特征與野生型菌株的菌落形態(tài)特征相似（圖3A），并且突變株的菌落直徑大小與野生型無(wú)顯著差異（圖3B），說(shuō)明FoSP1蛋白不影響B(tài)2菌株的菌落形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。

2.5""基因敲除突變體分生孢子的產(chǎn)生及萌發(fā)

計(jì)算平板菌落生長(zhǎng)邊緣菌塊的孢子產(chǎn)量，結(jié)果表明，突變株的分生孢子產(chǎn)量極顯著低于野生型菌株（Plt;0.01），野生型菌株的孢子產(chǎn)量約為9.2×105個(gè)/mL，ΔFoSP1的孢子產(chǎn)量約為3.6×105個(gè)/mL（圖4A）。在分生孢子萌發(fā)過(guò)程中，突變株的分生孢子萌發(fā)率極顯著低于野生型（Plt;0.01）。8"h時(shí)野生型菌株的分生孢子萌發(fā)率達(dá)到70%左右，突變株的萌發(fā)率在40%～50%之間（圖4B）。綜合研究表明，與野生型相比，F(xiàn)oSP1基因敲除突變體產(chǎn)孢量減少、分生孢子萌發(fā)率降低，由此可見(jiàn)，F(xiàn)oSP1基因?qū)2菌株的產(chǎn)孢過(guò)程有影響。

2.6""脅迫因子敏感性分析

分別選擇在加有不同濃度的NaCl和山梨醇的PDA平板上進(jìn)行滲透壓脅迫試驗(yàn)，28"℃恒溫培養(yǎng)5"d后，敲除突變體和野生型菌株菌落生長(zhǎng)情況在加有NaCl和山梨醇的PDA平板上無(wú)明顯差異。氧化脅迫分別選擇在加入不同濃度H2O2的PDA平板上進(jìn)行試驗(yàn)，28"℃恒溫培養(yǎng)4"d后發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的增大，敲除突變體和野生型受到的抑制均呈現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)，敲除突變體和野生型菌株生長(zhǎng)無(wú)明顯差異（圖5）。說(shuō)明FoSP1蛋白不參與B2菌株對(duì)于外源脅迫壓力的適應(yīng)性。

2.7""基因敲除突變體對(duì)巴西蕉的致病性

在巴西蕉幼苗上對(duì)ΔFoSP1突變株進(jìn)行致病性測(cè)定。接種培養(yǎng)30"d后觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組蕉苗無(wú)發(fā)病癥狀，其余蕉苗均呈現(xiàn)不同程度的發(fā)病情況；試驗(yàn)組中，接種野生型菌株的蕉苗，大部分葉片出現(xiàn)大面積的黃化現(xiàn)象，部分植株下部葉片已經(jīng)枯死，縱切球莖后可以觀察到其維管束褐化較為嚴(yán)重，發(fā)病部位呈黑褐色；接種ΔFoSP1菌株的蕉苗發(fā)病程度較輕，植株部分葉片邊緣出現(xiàn)黃化，切開(kāi)球莖后發(fā)現(xiàn)其褐化面積較少或者未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象（圖6A）。病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，接種敲除突變體菌株ΔFoSP1的巴西蕉幼苗平均病情指數(shù)（30.7）顯著低于野生型菌株B2（51.7）（圖6B，Plt;0.05）。由此可見(jiàn)，敲除FoSP1基因?qū)е翨2菌株對(duì)巴西蕉的致病性減弱。

3""討論

近年來(lái)，植物真菌全基因組序列的解析為植物病原的分泌蛋白組提供了重要的研究基礎(chǔ)。于欽亮等[11]基于生物信息學(xué)的方法對(duì)禾谷鐮刀菌（F."graminearum）全基因組進(jìn)行信號(hào)肽分析，預(yù)測(cè)出

606個(gè)潛在的分泌蛋白編碼基因，其中有79個(gè)分泌蛋白具有可預(yù)測(cè)的功能性描述。MA等[12]以鐮刀菌屬中3個(gè)不同寄主范圍的生理小種，包括禾谷鐮刀菌、輪枝鐮刀菌（F."verticillioides）和尖孢鐮刀菌番茄?；停‵."oxysporum"f."sp."Lycopersici）為研究對(duì)象，對(duì)其分泌蛋白組進(jìn)行差異比較，發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)毒菌株特有的4條譜系特異性（LS）基因組區(qū)域的LS染色體可將弱毒株轉(zhuǎn)化為強(qiáng)毒株，LS染色體中含有大量的激發(fā)子類和細(xì)胞壁降解酶類分泌蛋白基因，從而證明分泌蛋白類群在鐮刀菌生物學(xué)毒性中起重要作用。黃影華[13]通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法對(duì)菌株Foc"TR4-14013進(jìn)行全基因組表達(dá)量測(cè)定，并通過(guò)對(duì)所選的5個(gè)分泌蛋白進(jìn)行基因克隆、基因敲除和致病性分析，首次對(duì)其功能進(jìn)行了研究。病原真菌分泌蛋白的研究進(jìn)展，一方面增進(jìn)了對(duì)病原真菌分泌蛋白的分泌機(jī)制的了解，另一方面進(jìn)一步闡明了病原真菌對(duì)植物的致病過(guò)程[11]。真菌的分泌蛋白分子量一般較小，半胱氨酸含量較高。在尖孢鐮刀菌SIX家族蛋白質(zhì)中，所有SIX6分泌蛋白均具有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，其中1個(gè)位于信號(hào)肽中[14]；Foc菌株中flh2基因編碼蛋白的半胱氨酸含量占總氨基酸序列的3%[6]。本研究的FoSP1蛋白與該研究相比，半胱氨酸含量更高，為8.5%，因此具有分泌蛋白的特性。本研究中，F(xiàn)oSP1基因敲除突變菌株ΔFoSP1的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、菌落形態(tài)特征均未產(chǎn)生明顯變化，這表明其不參與Foc4"B2菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程的調(diào)控。分生孢子是大多數(shù)真菌的無(wú)性繁殖方式，對(duì)真菌形成侵染循環(huán)至關(guān)重要[15]。鐮刀菌在孢子萌發(fā)后形成菌絲體，可侵染作物根尖或新鮮傷口組織，在寄主體內(nèi)繁殖并產(chǎn)生大量的致病性相關(guān)分泌物[16]。魏晨星[17]研究發(fā)現(xiàn)Foc4菌株FoCaMK基因敲除突變體生長(zhǎng)速率及菌落形態(tài)與野生型菌株相比無(wú)顯著差異，但產(chǎn)孢量明顯降低，致病性顯著降低；聶燕芳等[18]的研究表明，F(xiàn)oc4菌株敲除突變體ΔFoupe1的菌絲和孢子形態(tài)無(wú)明顯差異，并且對(duì)NaCl、山梨醇脅迫不敏感，但菌株菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量顯著下降，并且對(duì)巴西蕉的致病力顯著降低；GUO等[19]發(fā)現(xiàn)Fosp9基因敲除突變體可能對(duì)真菌生長(zhǎng)和發(fā)育無(wú)影響，且對(duì)滲透脅迫的耐受性、細(xì)胞壁降解酶的分泌無(wú)影響，本研究結(jié)果與其相似。

綜上所述，F(xiàn)oSP1蛋白是一個(gè)新的分泌蛋白，使用split-marker基因敲除獲得了FoSP1敲除突變菌株，通過(guò)分析FoSP1基因敲除菌株表型和致病性的變化，初步揭示FoSP1蛋白參與尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種B2的產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)及其對(duì)香蕉致病性的調(diào)控。此結(jié)果為進(jìn)一步研究基因組特異區(qū)間分泌蛋白在尖孢鐮刀菌致病過(guò)程的作用奠定了良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]"王芳，"郇青鶴，"柯佑鵬，"過(guò)建春，"劉秋冬."中國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)的全要素生產(chǎn)率、技術(shù)進(jìn)步與效率變化[J]."廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2016，"43（12）："168-175."WANG"F，"HUAN"Q"H，"KE"Y"P，"GUO"J"C，"LIU"Q"D."Changes"of"total"factor"productivity，"technological"progress"and"efficiency"in"Chinese"banana"industry[J]."Guangdong"Agricultural"Sciences，"2016，"43（12）："168-175."（in"Chinese）

[2]"郭云峰."香蕉尖孢鐮刀菌效應(yīng)蛋白E1功能研究[D]."海口："海南大學(xué)，"2019."GUO"Y"F."Function"analysis"of"E1"effector"from"Fusarium"oxysporum[D]."Haikou："Hainan"University，"2019."（in"Chinese）

[3]"WANG"Y，"XIA"Q，"WANG"G，"ZHANG"H，"LU"X，"SUN"J，"ZHANG"X."Differential"gene"expression"in"banana"roots"in"response"to"Fusarium"wilt[J]."Canadian"Journal"of"Plant"Pathology，"2017，"39（2）："163-175.

[4]"ORDONEZ"N，"GARCIA"F"A，"LAGHARI"H，"AKKARY"M，"KEMA"G"H."First"report"of"Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense"tropical"race"4"causing"Panama"disease"in"Cavendish"bananas"in"Pakistan"and"Lebanon[J]."Plant"Disease，"2016，"100（1）："209.

[5]"VAN"DEN"BRINK"J，"DE"VRIES"R"P."Fungal"enzyme"sets"for"plant"polysaccharide"degradation[J]."Applied"Microbiology"and"Biotechnology，"2011，"91："1477-1492.

[6]"李恒."香蕉枯萎鐮刀菌四號(hào)生理小種flh2和mon1基因的功能分析[D]."?？冢?海南大學(xué)，"2019.LI"H."Functional"analysis"of"flh2"and"mon1"gene"in"Fasurium"oxysporum"f."sp."cubense[D]."Haikou："Hainan"University，"2019."（in"Chinese）

[7]"郭立佳，"王飛燕，"梁昌聰，"楊臘英，"汪軍，"劉磊，"黃俊生."香蕉枯萎病菌假定分泌蛋白SP10的功能分析[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2016，"37（3）："525-531."Guo"L"J，"WANG"F"Y，"LIANG"C"C，"YANG"L"Y，"WANG"J，"LIU"L，"HUANG"J"S."Functional"analysis"of"the"putative"secretory"protein"SP10"in"the"fungal"pathogen"Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense"causing"Fusarium"wilt[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2016，"37（3）："525-531."（in"Chinese）

[8]"DOEHLEMANN"G，"VAN"DER"LINDE"K，"A?MANN"D，"SCHWAMMBACH"D，nbsp;HOF"A，"MOHANTY"A，"JACKSON"D"A，"KAHMANN"R."Pep1，"a"secreted"effector"protein"of"Ustilago"maydis，"is"required"for"successful"invasion"of"plant"cells[J]."PLoS"Pathogens，"2009，"5（2）："e1000290.

[9]"SAITOH"H，"FUJISAWA"S，"MITSUOKA"C，"ITO"A，"HIRABUCHIL"A，"IKEDA"K，"IRIEDA"H，"YOSHINO"K，"YOSHIDAL"K，"MATSUMURAL"H，"TOSA"Y，"WIN"J，"KAMOUN"S，"TAKANO"Y，"TERAUCHIL"R."Large-scale"gene"disruption"in"Magnaporthe"oryzae"identifies"MC69，"a"secreted"protein"required"for"infection"by"monocot"and"dicot"fungal"pathogens[J]."PloS"Pathogens，"2012，"8（5）："e1002711.

• 郭立佳，"彭軍，"楊臘英，"王國(guó)芬，"梁昌聰，"劉磊，"黃俊生."大蕉枯萎病病原菌的分離、鑒定和致病性測(cè)定[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2013，"34（1）："105-110."GUO"L"J，"PENG"J，"YANG"L"Y，"WANG"G"F，"LIANG"C"C，"LIU"L，"HUAGN"J"S."Isolation"and"ldentification"of"plantain"（Musa"paradisiaca"Linn.）"Fusarium"wilt"disease"pathogen"and"pathogenicity"test[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2013，"34（1）："105-110."（in"Chinese）

[11]"于欽亮，"馬莉，"劉林，"楊靜，"蘇源，"王云月，"朱有勇，"李成云."禾谷鐮刀菌基因組中含寄主靶向模體分泌蛋白功能的初步分析[J]."生物技術(shù)通報(bào)，"2008（1）："160-165.YU"Q"L，"MA"L，"LIU"L，"YANG"J，"SU"Y，"WANG"Y"Y，"ZHU"Y"Y，"LI"C"Y."Primary"analysis"of"host-targeting-motif"harbored"secreted"proteins"in"genome"of"Fusarium"graminearum[J]."Biotechnology"Bulletin，"2008（1）："160-165."（in"Chinese）

[12]"MA"L"J，"VAN"DER"DOES"H"C，"BORKOVICH"K"A，"COLEMAN"J"J，"DABOUSSI"M"J，"DI"PIETRO"A，"DUFRESNE"M，"FREITAG"M，"GRABHERR"M，"HENRI SSAT"B，"HOUTERMAN"P"M，"KANG"S，"SHIM"W"B，"WOLOSUHK"C，"XIE"X，"XU"J"R，"ANTONIW"J，"BAKER"S"E，"BLUHM"B"H，"BREAKSPEAR"A，"BROWN"D"W，"BUTCHKO"R"A，"CHAPMAN"S，"COULSON"R，"COUTINHO"P"M，"DANCHIN"E"G，"DIENER"A，"GALE"LR，"GARDINER"D"M，"GOFF"S，"HAMMOND-KOSACK"K"E，"HIBURN"K，"HUA-VAN"A，"JONKERS"W，"KAZAN"K，"KODIRA"C"D，"KOEHRSEN"M，"KUMAR"L，"LEE"Y"H，"LI"L，"MANNERS"J"M，"MIRANDA-SAAVEDRA"D，"MUKHER JEE"M，"PARK"G，"PARK"J，"PARK"S"Y，"PROCTOR"R"H，"REGEV"A，"RUIZ-ROLDAN"M"C，"SAIN"D，"SAKTHIK UMAR"S，"SYKES"S，"SCHWARTZ"D"C，"TURGEON"B"G，"WAPINSKI"I，"YODER"O，"YOUNG"S，"ZENG"Q，"ZHOU"S，"GALAGA"J，"CUOMO"C"A，"KISTLER"HC，"REP"M."Comparative"genomics"reveals"mobile"pathogenicity"chromosomes"in"Fusarium[J]."Nature，"2010，"464（7287）："367-373.

[13]"黃影華."香蕉枯萎病菌5個(gè)分泌蛋白的基因克隆和功能分析[D]."廣州："仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，"2022."HUANG"Y"H."Gene"cloning"and"function"analysis"of"five"secreted"proteins"in"Fusarium"oxysporum"f."sp."Cubense[D]."Guangzhou："Zhongkai"University"of"Agriculture"and"Engineering，"2022."（in"Chinese）

[14]"DE"SAIN"M，"REP"M."The"role"of"pathogen-secreted"proteins"in"fungal"vascular"wilt"diseases[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2015，"16（10）："23970-23993.

[15]"YAN"X，"LI"Y，"YUE"X"F，"WANG"C"C，"QUE"Y"W，"KONG"D"D，"MA"Z"H，"TALBOT"N，"WANG"Z"Y."Two"novel"transcriptional"regulators"are"essential"for"infection-related"morphogenesis"and"pathogenicity"of"the"rice"blast"fungus"Magnaporthe"oryzae[J]."PLoS"Pathogens，"2011，"7（12）："e1002385.

[16]"林羽立."尖孢鐮刀菌效應(yīng)蛋白研究進(jìn)展[J]."農(nóng)業(yè)與技術(shù)，"2021，"41（20）："77-80.LIN"Y"L."Research"progress"of"Fusarium"oxysporum"effector"protein[J]."Agriculture"and"Technology，"2021，"41（20）："77-80."（in"Chinese）

[17]"魏晨星."尖孢鐮刀菌FoYjeF和FoCaMK基因的可變剪接及其功能分析[D]."鄭州："河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2023."WEI"C"X."Alternative"splicing"and"functional"analysis"of"FoYjeF"and"FoCaMK"genes"of"Fusarium"oxysporum[D]."Zhengzhou："Henan"Agricultural"University，"2023."（in"Chinese）

[18]"聶燕芳，"劉春奇，"李華平，"李云鋒."香蕉枯萎病菌分泌蛋白FoUPE1的基因功能研究[C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)."植物病理科技創(chuàng)新與綠色防控："中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2021年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集."北京："中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，"2021.NIE"Ynbsp;F，"LIU"C"Q，"LI"H"P，"LI"Y"F."Study"on"gene"function"of"secretory"protein"FoUPE1"of"banana"Fusarium"oxysporum[C]//Scientific"and"Technological"Innovation"and"Green"Prevention"and"Control"of"Plant"Pathology："Pro ceedings"of"the"2021"Annual"Conference"of"China"Society"of"Plant"Pathology."Beijing："China"Agricultural"Science"and"Technology"Press，"2021."（in"Chinese）

[19]"GUO"L"J，"WANG"J，"LIANG"C"C，"YANG"L"Y，"ZHOU"Y，"LIU"L，"HUANG"J"S."Fosp9，"a"novel"secreted"protein，"is"essential"for"the"full"virulence"of"Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense"on"banana"（Musa"spp.）[J]."Applied"and"Environmental"Microbiology，"2022，"88（6）："e0060421.