橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子DNA的微量提取方法建立

摘""要：由橡膠樹(shù)白粉菌（Erysiphe"quercicola）引發(fā)的橡膠樹(shù)白粉病是我國(guó)天然橡膠產(chǎn)業(yè)中的一個(gè)重要病害，其對(duì)乳膠產(chǎn)量造成了嚴(yán)重威脅。隨著預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)合qPCR檢測(cè)和孢子捕捉技術(shù)有望成為高效預(yù)測(cè)白粉病流行的新方法。本研究針對(duì)橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子DNA的微量提取，通過(guò)比較不同預(yù)處理方式、不同材質(zhì)的研磨珠以及不同類(lèi)型的研磨裝置，篩選出了最適合的孢子樣品研磨體系。進(jìn)一步比較了CTAB法與幾種商業(yè)提取試劑盒的提取效率，最終確定了一種可行的孢子DNA微量提取方法：將白粉菌分生孢子水溶液置于4"℃超聲處理10"min后加入2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g以及0.2"mm氧化鋯珠0.2"g，用組織研磨儀在4"℃"70"Hz條件下研磨40"s，停10"s，20個(gè)循環(huán)，最后使用CTAB法提取DNA。通過(guò)qPCR定量，可以在101"個(gè)/mL的孢子懸浮液當(dāng)中檢出橡膠樹(shù)白粉菌DNA，且不受田間復(fù)雜情況的干擾，具有高靈敏度和強(qiáng)特異性，為橡膠樹(shù)白粉病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供了可靠的理論依據(jù)和有效的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；白粉菌；分生孢子；DNA；微量提取中圖分類(lèi)號(hào)：S432.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Establishment"of"a"Microscale"DNA"Extraction"Method"for"Rubber"Tree"Powdery"Mildew"Spores

FENG"Deyu1，2，"LIANG"Xiaoyu1，2，"WANG"Hanmo1，"HUANG"Xize1，"ZHOU"Shaoyao1，2，"WANG"Meng1，2，"ZHANG"Yu1，2*

1."Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."College"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China

Abstract："Powdery"mildew"caused"by"Erysiphe"quercicola"is"a"significant"disease"in"China’s"natural"rubber"industry，"posing"a"severe"threat"to"latex"production."With"the"continuous"advancement"of"predictive"and"forecasting"technologies，"the"combination"of"qPCR"detection"and"spore"capture"techniques"holds"promise"as"an"efficient"method"for"predicting"the"prevalence"of"powdery"mildew."In"this"study，"we"focused"on"the"microscale"extraction"of"DNA"from"rubber"tree"powdery"mildew"spores."We"compared"various"pre-treatment"methods，"different"types"of"grinding"beads"with"varying"materials，"and"different"types"of"grinding"machines"to"identify"the"most"suitable"spore"sample"grinding"system."Furthermore，"we"compared"the"efficiency"of"the"CTAB"method"with"several"commercial"extraction"kits."Ultimately，"we"established"a"feasible"microscale"DNA"extraction"method"for"spores："first，"the"powdery"mildew"spore"water"solution"subjected"to"4"℃"ultrasonication"for"10"min，"subsequently，"2"mm"zirconia"beads"（0.2"g），"glass"beads"（0.4-0.6"mm，"0.2"g），"and"0.2"mm"zirconia"beads"（0.2"g）"added，"tissue"grinder"70"Hz"at"4"℃，"grind"40"s，"stop"10"s，"20"cycles，"finally，"DNA"extracted"using"the"CTAB"method."This"method"effectively"and"stably"extracts"DNA"from"101"spores/mL"rubber"tree"powdery"mildew"spores，"without"being"affected"by"complex"field"conditions，"and"demonstrates"high"sensitivity"and"specificity."It"provides"a"reliable"theoretical"basis"and"an"effective"technical"approach"for"the"prediction"and"forecasting"of"rubber"tree"powdery"mildew.

Keywords："rubber"tree;"Erysiphe"quercicola;"spores;"DNA;"microscale"extraction

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.002

由橡膠樹(shù)白粉菌（Erysiphe"quercicola）引起的橡膠樹(shù)白粉病是我國(guó)植膠區(qū)重要葉部病害之一，主要危害橡膠樹(shù)的嫩葉、嫩芽、嫰梢和花序，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致大面積葉片脫落，從而降低乳膠產(chǎn)量[1]。該病害流行程度與橡膠樹(shù)葉片物候期、氣候因子以及田間越冬菌量有關(guān)。通常情況下，嫩葉期平均氣溫較高、物候期不整齊，以及越冬菌量大都會(huì)導(dǎo)致橡膠樹(shù)白粉病的大流行，而且分生孢子可全年不斷地進(jìn)行侵染[2-3]"。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)橡膠樹(shù)白粉病的流行規(guī)律以及預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)方法進(jìn)行了廣泛研究[4]，白粉菌的分生孢子具有體積小和質(zhì)量輕的特點(diǎn)，可以隨著空氣流動(dòng)而傳播。因此，使用孢子捕捉技術(shù)可以在病害爆發(fā)前或早期連續(xù)監(jiān)測(cè)空氣中的分生孢子數(shù)量，這對(duì)于白粉病的早期預(yù)測(cè)和預(yù)報(bào)至關(guān)重要[5-6]。

以往對(duì)孢子捕捉器樣本中的病菌孢子分類(lèi)和計(jì)數(shù)通常需要依賴(lài)顯微鏡觀察其形態(tài)特征，這種方法耗時(shí)且容易受到孢子皺縮和重疊等問(wèn)題的干擾，從而降低準(zhǔn)確性。為了提高準(zhǔn)確性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用了計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別技術(shù)，建立了智能化孢子捕捉分析系統(tǒng)[7-8]，該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)孢子的自動(dòng)采集和顯微圖像的遠(yuǎn)程采集傳輸?shù)纫幌盗泄δ躘9]，從而顯著提高了孢子識(shí)別的準(zhǔn)確性[10]。但對(duì)低豐度的樣本，分子生物學(xué)方法可以更精確地獲得孢子數(shù)量，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time"quantitative"PCR，"qPCR）技術(shù)的出現(xiàn)，不僅可以檢測(cè)孢子捕捉器中的目標(biāo)樣品，還能對(duì)其捕獲情況進(jìn)行定量分析[11]。將qPCR與孢子捕捉技術(shù)相結(jié)合，可以為病害防控提供實(shí)用的方法，這一方法已在小麥白粉病[12]、黃瓜白粉病[13]、桃樹(shù)白粉病[14]的預(yù)測(cè)、預(yù)報(bào)工作中得到了應(yīng)用。qPCR檢測(cè)技術(shù)的成功應(yīng)用，高效獲取目標(biāo)生物的DNA是關(guān)鍵。前人研究已經(jīng)通過(guò)對(duì)捕捉帶上的小麥白粉菌分生孢子進(jìn)行洗脫和破壁，發(fā)現(xiàn)了一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取小麥白粉菌DNA的方法，該方法最低可有效提取捕捉帶上約50個(gè)小麥白粉菌分生孢子的基因組DNA，其靈敏性和提取產(chǎn)率均超過(guò)了商業(yè)試劑盒[15]。本研究通過(guò)優(yōu)化研磨程序、評(píng)估CTAB提取法與其他幾種商業(yè)試劑盒的提取效率，成功構(gòu)建了一種適用于橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子基因組DNA的微量提取方法。該方法能夠有效地提取出101"個(gè)/mL孢子懸浮液當(dāng)中的橡膠樹(shù)白粉菌DNA，有助于孢子捕捉技術(shù)進(jìn)一步評(píng)估膠園中白粉菌分生孢子的流行動(dòng)態(tài)，這對(duì)于預(yù)防和控制橡膠樹(shù)白粉病，從而保護(hù)橡膠樹(shù)的健康生長(zhǎng)具有重要意義。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試樣品""橡膠樹(shù)白粉菌菌株采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所天然橡膠良種苗木繁育基地，于本實(shí)驗(yàn)室單斑分離獲得菌株，并使用熱研73397橡膠樹(shù)芽接苗接種穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，菌株經(jīng)鑒定命名為HO-3；田間孢子樣品收集自白粉病高發(fā)地區(qū)的云南景洪（22°01?00?N，100°49?00?E）和海南保亭（18°23?00?N，109°48?00?E）監(jiān)測(cè)綜合試驗(yàn)站的Burkard孢子捕捉器。

1.1.2""供試藥劑""β-巰基乙醇購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，蛋白酶K購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，三氯甲烷、異戊醇購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司，異丙醇與乙醇等購(gòu)自廣東西隴科學(xué)股份有限公司；DNA提取試劑盒：2×CTAB"Solution（北京酷萊博科技有限公司），TIANamp"Soil"DNA"Kit[天根生化科技（北京）有限公司]，F(xiàn)astDNA?"SPIN"Kit"for"Soil（MP"Biomedicals"For"USA），HP"Plant"DNA"Kit（Omega"Bio-Tek"For"USA）；"qPCR"SYBR"Green"Master"Mix（南京諾唯贊科技有限公司）。

1.1.3""主要儀器""KQ-800DE超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），LGJ-10普通型（0.12"m2）真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），LUKYM-I冷凍組織研磨儀（廣州露卡測(cè)序儀器有限公司），JY-650E細(xì)胞破碎儀（上海熙揚(yáng)儀器有限公司），CFX"Connect?"熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad"有限公司），CX21生物顯微鏡（OLYMPUS）。

1.2""方法

1.2.1""菌種培養(yǎng)與孢子懸浮液配置""熱研73397橡膠樹(shù)芽接苗于28"℃培育，待抽出2～3"cm古銅葉時(shí)接種白粉菌，后在18～22"℃、70%～90%"RH的條件下培養(yǎng)12～16"d即可獲得橡膠樹(shù)白粉菌孢子，用超純水洗脫下白粉菌分生孢子，利用顯微鏡加血球計(jì)數(shù)板將懸浮液濃度調(diào)整為104"個(gè)/mL，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?01、102、103、104"個(gè)/mL的白粉菌孢子懸浮液，作為本試驗(yàn)的研究對(duì)象。

1.2.2""優(yōu)化研磨程序""（1）樣品不同預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化。采用超聲處理和冷凍干燥處理2種方法與無(wú)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行比較，以?xún)?yōu)化樣品研磨的預(yù)處理?xiàng)l件。超聲處理的條件為在4"℃下超聲10"min，冷凍干燥處理則是將樣品置于–30"℃冷凍干燥器中直至樣品水分被完全抽干為止。

（2）不同研磨設(shè)備效果比較。冷凍組織研磨儀的工作參數(shù)為：溫度4"℃，振動(dòng)頻率70"Hz，運(yùn)行時(shí)間40"s，停頓時(shí)間10"s，循環(huán)次數(shù)為20次。細(xì)胞破碎儀的工作參數(shù)為：樣品放置于冰水混合物上，超聲功率360"W，運(yùn)行時(shí)間為2"s，停頓時(shí)間為3"s，總破碎時(shí)間8"min。

（3）不同材質(zhì)研磨珠體系。根據(jù)研磨珠的材質(zhì)不同，分為石英砂體系和玻璃珠加氧化鋯珠2個(gè)體系。石英砂研磨體系添加的研磨珠數(shù)量分別為：2"mm石英砂0.2"g、0.5"mm石英砂0.2"g、0.2"mm石英砂0.2"g。玻璃珠加氧化鋯珠研磨體系添加的研磨珠數(shù)量為：2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g以及0.2"mm氧化鋯珠0.2"g。

1.2.3""比較4種不同DNA提取方法的效率""參照TIANamp"Soil"DNA"Kit、FastDNA?"SPIN"Kit"for"Soil、HP"Plant"DNA"Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。按傳統(tǒng)CTAB法進(jìn)行橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子DNA的提取與純化。

1.2.4""熒光定量PCR驗(yàn)證""根據(jù)橡膠樹(shù)白粉菌（E."quercicola）基因組上的一段保守序列[16]（Gene"Bank："KP171513.1）設(shè)計(jì)定量PCR引物（DQ-25F："5?-ACCCCATCACGACTAAAATA-3?，"DQ-25R："5?-GGAAGTGGACCGACGAA-3?）。PCR反應(yīng)體系（20"μL）：qPCR"SYBR"Green"Master"Mix"10"μL，DNA"3"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各0.5"μL，ddH2O補(bǔ)足至20"μL。擴(kuò)增程序：95"℃"30"s，95"℃"5"s，55"℃"35"s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析溫度范圍為60～95"℃。使用配套軟件BioRad"CFXManager分析定量數(shù)據(jù)，根據(jù)孢子濃度轉(zhuǎn)化以10為底的對(duì)數(shù)（x），與對(duì)應(yīng)的Cq值（y）繪制圖表，Cq值越小表示初始模板濃度越高。

1.2.5""驗(yàn)證DNA提取體系穩(wěn)定性""對(duì)101、102、103、104"個(gè)/mL的懸浮液樣品進(jìn)行3次獨(dú)立提取DNA，并使用qPCR進(jìn)行定量檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌DNA。每組樣品3次重復(fù)，分析組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)，以評(píng)估提取體系的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

1.2.6""驗(yàn)證田間孢子樣品的DNA提取效果""取海南和云南兩地區(qū)橡膠樹(shù)白粉病流行期內(nèi)孢子捕捉器取的樣品。將最優(yōu)體系提取捕捉器樣品中的橡膠樹(shù)白粉菌DNA，進(jìn)行qPCR定量，將檢測(cè)結(jié)果與鏡檢結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3""數(shù)據(jù)處理

使用IBM"SPSS"Statistics"26軟件進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)以及顯著性差異分析，并使用Origin軟件進(jìn)行線性擬合和圖像繪制。

2""結(jié)果與分析

2.1""研磨程序優(yōu)化

2.1.1""不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)研磨效果的影響""將超聲處理、冷凍干燥處理以及無(wú)預(yù)處理3種樣品預(yù)處理方式進(jìn)行對(duì)比，提取結(jié)果經(jīng)過(guò)qPCR驗(yàn)證。未進(jìn)行預(yù)處理的102、101"個(gè)/mL懸浮液，提取的白粉菌DNA，檢測(cè)循環(huán)次數(shù)（Cq）均高于35，表明這些樣品中的橡膠白粉菌DNA濃度較低，或者可能存在檢測(cè)假陽(yáng)性情況。經(jīng)過(guò)2種預(yù)處理方法后，能夠顯著提高橡膠白粉菌的DNA產(chǎn)率，101、102、103、104"個(gè)/mL的樣品均能檢出白粉菌DNA。其中，超聲處理的提取效果要比冷凍干燥處理更好，提取的DNA濃度更高（圖1）。通過(guò)比較3組處理的qPCR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，孢子樣品經(jīng)過(guò)4"℃下超聲預(yù)處理10"min，提取產(chǎn)率更高，而且所需時(shí)間更短，更易于操作。

2.1.2""研磨裝置對(duì)研磨效果的影響""通過(guò)qPCR進(jìn)行樣品DNA的定量檢測(cè)，比較冷凍組織研磨儀與細(xì)胞破碎儀的研磨效果。2種研磨裝置均能夠成功提取到橡膠樹(shù)白粉菌DNA，但冷凍組織研磨儀的研磨效果明顯優(yōu)于細(xì)胞破碎儀（圖2）。因此，使用冷凍組織研磨儀4"℃，振動(dòng)頻率70"Hz，運(yùn)行時(shí)間40"s，停頓時(shí)間10"s，循環(huán)20次對(duì)橡膠樹(shù)白粉菌孢子樣品進(jìn)行研磨處理更適合。

2.1.3""研磨珠材質(zhì)對(duì)研磨效果的影響""不同粒徑的研磨珠組合，可以影響樣品中提取的DNA的質(zhì)量。本研究觀察不同研磨珠材質(zhì)對(duì)橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子樣品的DNA提取效果的影響，確定了2種效果較好的研磨珠組合，分別是3種粒徑石英砂組合和氧化鋯珠加玻璃珠的組合。在qPCR定量驗(yàn)證中，氧化鋯珠與玻璃珠的組合提取DNA濃度均高于石英砂組，并且Cq值都在35以下，表明其研磨效果更佳（圖3）。因此，選擇添加2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g以及0.2"mm氧化鋯珠0.2"g作為本研究的研磨珠。

2.2""DNA提取方法比較

將CTAB法與另外3種商業(yè)DNA試劑盒對(duì)比提取4個(gè)濃度梯度（101、102、103、104"個(gè)/mL）的孢子懸浮液中的橡膠樹(shù)白粉菌DNA。由圖4可知，4種提取方法的提取產(chǎn)率從高到低分別為CTAB法gt;FastDNA?"SPIN"Kit"for"Soil提取試劑盒g(shù)t;TIANamp"Soil"DNA"Kit提取試劑盒g(shù)t;HP"Plant"DNA"Kit提取試劑盒，其中CTAB法在提取4個(gè)梯度的懸浮液中的橡膠樹(shù)白粉菌DNA中，提取產(chǎn)率均為最高，F(xiàn)astDNA?"SPIN"Kit"for"Soil提取試劑盒雖然也能提取出101"個(gè)/mL的白粉菌樣品DNA，與CTAB法的提取濃度無(wú)顯著差異，但其成本要高于CTAB法。因此，從實(shí)際操作與成本綜合考慮出發(fā)，本研究選擇CTAB法作為DNA提取方法。

2.3""提取體系準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

本研究基于前文中的研磨程序優(yōu)化以及比較不同DNA提取方式等，利用最優(yōu)組合，成功構(gòu)建了一套適用于橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子DNA的微量提取方法。使用該體系提取101、102、103、104"個(gè)/mL懸浮液的橡膠樹(shù)白粉菌樣品DNA，進(jìn)行qPCR定量檢測(cè)。擴(kuò)增曲線成梯度分布，熔解曲線呈現(xiàn)單峰，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9198（圖5），該提取體系在室內(nèi)評(píng)價(jià)工作中，表現(xiàn)出較好的準(zhǔn)確性。

2.4""提取體系穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

通過(guò)3次提取懸浮液的橡膠樹(shù)白粉菌DNA樣品，使用qPCR進(jìn)行定量檢測(cè)，并對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，以評(píng)估該提取體系的穩(wěn)定性（表1）。無(wú)論哪個(gè)濃度范圍內(nèi)的孢子濃度在該提取體系條件下，3次測(cè)定結(jié)果均表現(xiàn)出很好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，組內(nèi)變異系數(shù)在0.30%～2.62%之間，組間變異系數(shù)為2.99%～7.14%，2組數(shù)值的變異系數(shù)均在15%以下。這表明該體系在處理橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子樣品時(shí)具有良好的重復(fù)性，可以穩(wěn)定地提取出適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的橡膠樹(shù)白粉菌基因組DNA。

2.5""田間孢子捕捉器樣品DNA提取驗(yàn)證

橡膠樹(shù)白粉病流行期內(nèi)，使用孢子捕捉器在云南和海南獲取的樣品成功觀察到了白粉菌分生孢子，并進(jìn)行了孢子密度的統(tǒng)計(jì)。按照建立的提取體系提取了白粉菌分生孢子DNA，并使用qPCR進(jìn)行定量。將Cq值轉(zhuǎn)化為孢子密度，然后進(jìn)行2種檢測(cè)方法的相關(guān)性分析（圖6）。云南和海南地區(qū)監(jiān)測(cè)站的孢子樣品顯示，2種檢測(cè)方法的相關(guān)系數(shù)分別為0.8555和0.9307，二者檢測(cè)結(jié)果一致。這表明，使用本研究構(gòu)建的提取體系結(jié)合qPCR定量技術(shù)，可以作為人工鏡檢的替代方法，且不受田間復(fù)雜情況的影響，具有高靈敏度和特異性。

3""討論""

真菌分生孢子具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，富含多酚、多糖和蛋白質(zhì)等復(fù)雜細(xì)胞成分，這些因素會(huì)影響DNA提取的效率和質(zhì)量。周潔等[17]使用烘箱40"℃將孢子懸浮液中的水分烘干，結(jié)合液氮研磨法，用以提取土壤中的蚧蠟輪枝菌DNA。受此啟發(fā)，本研究選擇冷凍干燥儀處理孢子懸浮液中的水分，增加白粉菌孢子與研磨珠接觸面積的同時(shí)，還避免了溫度過(guò)高導(dǎo)致核酸的降解，從而提高提取效率。超聲處理可以破壞分生孢子的壁膜結(jié)構(gòu)，釋放細(xì)胞質(zhì)[18]。本研究將2種研磨前預(yù)處理方法與無(wú)預(yù)處理進(jìn)行比較，結(jié)果表明，研磨前預(yù)處理能顯著提高對(duì)白粉菌孢子樣品的研磨效率，且能提取到含101"個(gè)/mL孢子懸浮液中的白粉菌DNA。本研究中，使用超聲處理要比冷凍干燥處理更能提高研磨效率，因此，選擇超聲處理作為研磨前對(duì)樣品的預(yù)處理方式。

針對(duì)這類(lèi)生物含量較低的樣品，常規(guī)的液氮加研缽研磨破壁效果不佳，同時(shí)還會(huì)造成樣品的大量損耗，在本研究比較了細(xì)胞破碎儀和冷凍組織研磨儀2種裝置的研磨效果。細(xì)胞破碎儀的工作原理是將電能轉(zhuǎn)換為聲能，聲能通過(guò)液體介質(zhì)變?yōu)橐粋€(gè)個(gè)密集的小氣泡，小氣泡迅速破裂，產(chǎn)生能量，以實(shí)現(xiàn)破碎效果。WANG等[19]通過(guò)在富含腐殖酸的砂樣品中提取惡臭假單胞菌（Pseudomonas"putida）基因組DNA時(shí)，證明了細(xì)胞破碎儀能有效提高樣品的裂解效率。而組織研磨儀的工作原理，是通過(guò)摩擦研磨珠和孢子來(lái)實(shí)現(xiàn)破碎效果[20]。2種研磨儀都能有效破碎101、102、103、104"個(gè)/mL白粉菌懸浮液樣品，但冷凍組織研磨儀在本研究表現(xiàn)出更高的研磨效率，因此選擇冷凍組織研磨儀研磨本試驗(yàn)孢子樣品更為合適。

研磨珠材質(zhì)有玻璃珠、氧化鋯珠[21]和石英研磨珠[22]，其中氧化鋯珠具有更高的硬度與密度[23-24]，可以在短時(shí)間內(nèi)破碎孢子且產(chǎn)生的熱量較少，最大程度地減少核酸降解的可能性。NIU等[25]通過(guò)將小粒徑（0.5"mm和0.1"mm）氧化鋯珠和材料密度較低的玻璃珠（0.5"mm）組合，可以從富含有機(jī)物和生物硅粘土的海底沉積物中，提取微生物DNA。為此，在本研究中針對(duì)樣品特定來(lái)源進(jìn)行優(yōu)化，加入了大粒徑的氧化鋯珠（2"mm），用以破碎橡膠白粉菌分生孢子堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，以及保留了小粒徑的氧化鋯珠與玻璃珠，以保證在處理白粉菌分生孢子微量樣品時(shí)，也能獲得較好的研磨效果。在比較不同的DNA提取方法時(shí)，CTAB法的提取產(chǎn)率最高。這種差異的原因是另外3種商業(yè)試劑盒在DNA洗脫純化過(guò)程中使用了過(guò)濾柱，這可能導(dǎo)致核酸丟失。相比之下，CTAB法通過(guò)異丙醇直接將產(chǎn)物沉淀在離心管底部，雖然提取時(shí)間較長(zhǎng)，但成本最低[26]。

此外，本研究利用qPCR技術(shù)對(duì)孢子捕捉器捕捉的橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子進(jìn)行了定量檢測(cè)。與鏡檢孢子密度顯著正相關(guān)的結(jié)果表明，qPCR技術(shù)結(jié)合孢子捕捉技術(shù)具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。首先，它準(zhǔn)確性高，使用橡膠樹(shù)白粉菌特異性引物，只會(huì)擴(kuò)增出白粉菌特異性片段的產(chǎn)物，無(wú)需考慮其他形態(tài)特征相似的孢子。其次，它具有高靈敏度和強(qiáng)耐受性，鏡檢觀察容易受到田間復(fù)雜情況的干擾，影響統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確性。另外，該技術(shù)獲取數(shù)據(jù)的時(shí)間較短，能夠同時(shí)處理多個(gè)樣品，極大地節(jié)約了操作時(shí)間[27]。目前，這項(xiàng)工作還有許多可以拓展的方向，例如提高DNA提取的質(zhì)量，以滿(mǎn)足SSR、SRAP等分子標(biāo)記技術(shù)和遺傳多樣性分析等分子實(shí)驗(yàn)需求，為橡膠樹(shù)白粉菌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析以及分子生物學(xué)研究提供技術(shù)支持[28]。

4""結(jié)論""

本研究成功構(gòu)建了1種適用于橡膠樹(shù)白粉菌分生孢子DNA的微量提取方法。該方法為4"℃超聲處理10"min，添加2"mm氧化鋯珠0.2"g、0.4～0.6"mm玻璃珠0.2"g和0.2"mm氧化鋯珠0.2"g，冷凍組織研磨儀在4"℃條件下、振動(dòng)頻率為70"Hz、研磨40"s、停10"s、循環(huán)20次，使用CTAB法提取。

經(jīng)田間孢子捕捉器樣品驗(yàn)證后，定量結(jié)果與鏡檢觀察呈現(xiàn)出高度一致的正相關(guān)性，表明qPCR技術(shù)是一種可靠的替代方法，可取代顯微鏡觀察和菌落培養(yǎng)。有效提取孢子捕捉器上的白粉菌孢子DNA對(duì)于預(yù)測(cè)橡膠樹(shù)白粉病的爆發(fā)流行具有關(guān)鍵意義，同時(shí)也為其他分子檢測(cè)技術(shù)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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