木薯MeAHL17基因的克隆及表達分析

摘""要：AT-hook核定位蛋白（AT-hook"nuclear"localized"proteins，"AHLs）是一種小的DNA結(jié)合蛋白基序，在植物的生長發(fā)育、器官構(gòu)建、逆境脅迫與激素信號應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用。本研究從華南8號木薯（SC8）中克隆獲得MeAHL17基因，利用生物信息學(xué)方法對MeAHL17基因進行啟動子分析、蛋白理化性質(zhì)分析、保守功能域的預(yù)測和序列比對。結(jié)果表明：MeAHL17基因的開放閱讀框長度為939"bp，編碼一個具有312個氨基酸的蛋白，其理論等電點為6.89，分子式為C1420H2215N415O451S11，分子量為32.669"38"kDa，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Lys+Arg）為23，帶負電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為24，脂肪系數(shù)為57.47，總平均親水性系數(shù)（GRAVY）為–0.491，不穩(wěn)定系數(shù)為58.06；該蛋白不含有信號肽，位于細胞膜內(nèi)，無跨膜結(jié)構(gòu)，含有5個糖基化位點和45個磷酸化位點，是一個不穩(wěn)定的親水性酸性蛋白；MeAHL17蛋白包含AT-hook保守核心序列和PPC結(jié)構(gòu)域的保守核心序列，符合AT-hook家族的典型結(jié)構(gòu)特征。通過亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄活性分析實驗證明MeAHL17是一個定位于細胞核且具有轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子。組織表達模式分析表明，MeAHL17基因主要在體胚、須根和愈傷組織中表達。不同激素處理表明，MeAHL17基因受到乙烯（ACC）、茉莉酸甲酯（JA）和生長素（IAA）等激素的誘導(dǎo)表達，推測其可能參與了乙烯、茉莉酸甲酯和生長素信號途徑。非生物脅迫處理表明，MeAHL17基因響應(yīng)干旱和鹽脅迫。本研究初步確定了木薯MeAHL17基因在生長發(fā)育、激素信號和逆境脅迫等方面具有重要的作用，為進一步研究其功能提供理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：木薯；MeAHL17；基因克??；亞細胞定位；轉(zhuǎn)錄活性分析；表達模式分析中圖分類號：S31""""""文獻標志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"MeAHL17"Gene"in"Cassava

ZHANG"Yawen1，2，3，"WANG"Xiaotong1，2，3，"ZHANG"Xinglong1，2，3，"TANG"Xiangning1，2，3，"LIU"Jiao2，3*，"GUO"Jianchun2，3*

1."School"of"Life"and"Health"Sciences，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Institute"for"Tropical"Agricultural"Resources"/"Key"Laboratory"for"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572000，"China

Abstract："AT-hook"nuclear"localized"proteins"（AHLs）"are"small"DNA-binding"protein"motifs"that"play"an"important"role"in"plant"growth"and"development，"organ"construction，"stress"and"hormone"signaling"response."In"this"study，"MeAHL17"was"cloned"from"cassava"cultivar"SC8."Bioinformatics"methods"were"used"to"analyze"MeAHL17"promoter，"protein"physicochemical"properties，"prediction"of"conserved"functional"domain"and"sequence"comparison."The"results"showed"that"the"open"reading"frame"length"of"MeAHL17"gene"was"939"bp，"encoding"a"protein"with"312"amino"acids，"its"theoretical"isoelectric"point"was"6.89，"its"molecular"formula"was"C1420H2215N415O451S11，"and"its"molecular"weight"was"32.669"38"kDa."The"total"number"of"positively"charged"amino"acid"residues"（Lys+Arg）"was"23，"the"total"number"of"negatively"charged"amino"acid"residues"（Asp+Glu）"was"24，"the"fat"coefficient"was"57.47，"the"total"average"hydrophilic"coefficient"（GRAVY）"was"-0.491"and"the"instability"coefficient"was"58.06."The"protein"contains"no"signal"peptide，"is"located"in"the"cell"membrane，"has"no"transmembrane"structure，"contains"5"glycosylation"sites"and"45"phosphorylation"sites，"and"is"an"unstable"hydrophilic"acidic"protein"MeAHL17"contained"AT-hook"conserved"core"sequences"and"PPC"domain"conserved"core"sequences，"which"was"consistent"with"the"typical"structural"characteristics"of"AT-hook"family."Through"subcellular"localization"and"transcriptional"activity"analysis"experiments，"MeAHL17"was"proved"to"be"a"nucleus"localized"transcription"factor"with"transcriptional"activity."Tissue"expression"pattern"analysis"showed"that"MeAHL17"was"mainly"expressed"in"somatic"embryo，"fibrous"root"and"callus."Different"hormone"treatments"showed"that"MeAHL17"was"induced"by"ethylene"（ACC），"methyl"jasmonate"（JA）"and"growth"hormone"（IAA），"which"suggested"that"MeAHL17"might"be"involved"in"ethylene，"methyl"jasmonate"and"growth"hormone"signaling"pathway."Abiotic"stress"treatment"showed"that"MeAHL17"was"responsive"to"drought"and"salt"stress."This"study"preliminarily"identified"the"important"role"of"MeAHL17"in"growth"and"development，"hormone"signaling"and"stress，"and"provided"theoretical"basis"and"reference"for"further"study"of"its"function.

Keywords："cassava;"MeAHL17;"gene"cloning;"subcellular"localization;"transcriptional"activity"analysis;"expression"pattern"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.001

木薯（Manihot"esculenta"Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）、木薯屬（Manihot）植物，是世界三大薯類（甘薯、馬鈴薯、木薯）和六大糧食作物（小麥、水稻、玉米、馬鈴薯、大麥、木薯）之一，廣泛種植于非洲、美洲和亞洲100多個國家的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。木薯雖然具有許多生物學(xué)優(yōu)勢，比如耐貧瘠、抗旱和產(chǎn)量高等[3]，但持續(xù)干旱、鹽毒害和低溫等不利條件均可能導(dǎo)致木薯長勢不佳和低產(chǎn)[4-5]。AT-hook核定位蛋白（AT-hook"nuclear"localized"proteins，"AHLs）在植物的生長發(fā)育、器官構(gòu)建、逆境脅迫和激素信號應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用[6]。因此，研究AT-hook基因?qū)δ臼砥贩N改良具有重要意義。

目前，AHL基因家族已在多個物種中進行了全基因組鑒定和分析，從擬南芥（Arabidopsis"thaliana）中鑒定出29個AHLs[7]，水稻（Oryza"sativa）有20個AHLs[8]，高粱（Sorghum"bicolor）有22個AHLs[9]，玉米（Zea"mays）有37個AHLs[10]，分別從雷蒙德氏棉（Gossypium"raimondii）、亞洲棉（Gossypium"arboreum）和陸地棉（Gossypium"hirsutum）中各鑒定出48、51和99個AHLs[11]，大豆（Glycine"max）基因組中鑒定出63個AHLs[12]，葡萄（Vitis"vinifera）中鑒定出14個AHLs[13]，花生（Arachis"hypogaea）中鑒定出64個AHLs[14]，胡蘿卜（Daucus"carota）中鑒定出47個AHLs[15]，毛果楊（Populus"trichocarpa）中鑒定出37個AHLs[16]，甘藍型油菜（Brassica"napus）中鑒定出122個AHLs[17]，近一年來又相繼在核桃（Juglans"regia）、鵝掌楸（Liriodendron"chinense）、蕪菁（Brassica"rapa）和番茄（Solanum"lycopersicum）中各鑒定出37、21、42和18個AHLs[18-21]；隨著對植物中AHLs基因的研究不斷積累，AHLs已被證明可以調(diào)控多種生長發(fā)育過程，包括花發(fā)育[22]、下胚軸伸長[23-24]、花粉發(fā)育和育性[25-26]、玉米穗發(fā)育[27]、維管組織分化[28]，調(diào)節(jié)開花時間[29-31]以及葉片衰老調(diào)節(jié)[32]等。AHLs也參與了植物對生物和非生物脅迫的反應(yīng)，包括增強抗旱性[33-34]和調(diào)節(jié)植物抵抗病原微生物入侵的能力[35-36]。AHLs還參與調(diào)節(jié)初級代謝[37]、調(diào)節(jié)赤霉素[38]的穩(wěn)態(tài)以及調(diào)控茉莉酸和生長素相關(guān)基因的表達[33，"39-40]。盡管AHL基因家族有如此廣泛的作用，但對其功能的了解還不夠全面和系統(tǒng)化，依舊值得繼續(xù)探索。

雖然已有研究表明MeAHL17在抗木薯細菌性枯萎?。╟assava"bacterial"blight，"CBB）中具有積極作用[41]，但是該基因在其他激素信號應(yīng)答與逆境脅迫等方面作用的機制還未知，依舊值得繼續(xù)探索。本研究通過克隆木薯MeAHL17基因，并對其進行生物信息學(xué)分析、亞細胞定位、轉(zhuǎn)錄活性分析和表達模式分析，為進一步研究MeAHL17參與木薯生長發(fā)育、逆境脅迫和激素信號應(yīng)答等方面的功能提供理論依據(jù)和參考。

1""材料與方法

1.1""材料

植物材料：華南8號（SC8）木薯采自國家木薯種質(zhì)資源圃；本生煙由本實驗室提供。

質(zhì)粒和菌株：pCAMBIA1300-35S-GFP和pGBKT7載體質(zhì)粒由本實驗室提供；大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101和酵母菌株AH109購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

試劑：多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Plant"Total"RNA"Isolation"Kit"Plus）購自成都福際生物技術(shù)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（MonScriptTM"RTIII"ALL-in-One"Mix）和qPCR試劑（MonAmpTM"ChemoHS"qPCR"Mix）購自莫納生物科技有限公司；LA"Taq?高保真酶和pMDTM"19-vector購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和T4"DNA連接酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo"Fisher"Scientific公司；MES和乙酰丁香酮（AS）購自北京索萊寶科技有限公司；六水合氯化鎂購自西隴化工科技有限公司。

引物：本研究引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

1.2""方法

1.2.1""MeAHL17基因的克隆""以SC8組培苗作為提取RNA的材料，用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取木薯總RNA，取4～6"μL總RNA樣品用1%濃度的瓊脂糖膠檢測其質(zhì)量，用超微量分光光度計檢測其濃度。用MonScriptTM"RTIII"ALL-in-One"Mix試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于基因擴增。利用phytozome網(wǎng)站（https：//phy tozome.jgi.doe.gov）查找到MeAHL17序列（Manes."02G145600）后，于NCBI數(shù)據(jù)庫Primer-BLAST設(shè)計MeAHL17的擴增引物（MeAHL17-F/Me AHL17-R，"表1），以反轉(zhuǎn)錄后所得cDNA為模板，PCR擴增MeAHL17編碼區(qū)片段。反應(yīng)體系：LA"Taq"0.5"μL，10×LA"PCR"Buffer"5"μL，dNTP"Mixture"8"μL，上下游引物各1"μL，模板2"μL，加ddH2O補至50"μL。反應(yīng)程序為：94"℃預(yù)變性5"min；94"℃"30nbsp;s，54"℃"30"s，72"℃"1"min，循環(huán)35次；72"℃延伸10"min；16"℃保存。取3"μL"PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖膠檢測目的條帶，再進行產(chǎn)物純化，用pMDTM"19-vector試劑將pMD19-T載體和MeAHL17基因片段連接，按照唯地生物的DH5α"Chemically"Competent"Cell的說明書進行轉(zhuǎn)化，隨機挑取多個菌斑進行PCR檢測并擴大培養(yǎng)，選取3個陽性克隆送至楠山生物技術(shù)有限公司進行測序驗證后，用質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取pMD19T-MeAHL17質(zhì)粒。

1.2.2""生物信息學(xué)分析""使用如表2所示的在線分析軟件對MeAHL17進行生物信息學(xué)分析。

1.2.3""亞細胞定位""以pMD19T-MeAHL17載體質(zhì)粒為模板，通過設(shè)計引物AHL17-F（Sal"Ⅰ）/AHL17-R（BamH"I）對其進行PCR擴增；pCAMBIA1300-GFP載體質(zhì)粒用Sal"I和BamH"I限制性內(nèi)切酶對其進行雙酶切；純化PCR產(chǎn)物和酶切后的載體質(zhì)粒；利用T4"DNA連接酶將pCAMBIA1300-GFP載體與MeAHL17基因片段連接，轉(zhuǎn)化DH5α并擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，取4"μL"pCAMBIA1300-MeAHL17-GFP質(zhì)粒和pCA MBIA1300-GFP空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101感受態(tài)細胞，隨機挑取多個菌斑進行PCR檢測（引物為1300-F/1300-R）并擴大培養(yǎng)，將含有pCAMBIA"1300-MeAHL17-GFP質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP空載質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射至煙草葉片中瞬時表達，培養(yǎng)48～72"h后用DAPI染料染色10"min，用清水清洗5～8次后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

1.2.4""轉(zhuǎn)錄活性分析""設(shè)計同源重組引物BD-"AHL17-F/BD-AHL17-R，并以pMD19T-MeAHL17載體質(zhì)粒為模板進行擴增；利用限制性內(nèi)切酶BamH"I和Sal"I對pGBKT7載體進行雙酶切，純化PCR產(chǎn)物和酶切后的載體后，利用同源重組酶將pGBKT7載體與MeAHL17基因片段連接，轉(zhuǎn)化DH5α并擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，取4"μL"pGB KT7-MeAHL17、pGBKT7-p53+pGADT7-largeT（陽性對照）和pGBKT7（陰性對照）轉(zhuǎn)化AH109感受態(tài)細胞，PCR檢測（引物為BD-F/BD-R）后，擴大培養(yǎng)至OD600約0.7，稀釋后各取5"μL菌液點到SD/-Trp/X-α-gal固體缺陷培養(yǎng)基上，觀察酵母菌的生長情況。

1.2.5""MeAHL17基因表達模式分析""（1）MeAHL17在不同組織器官的表達模式分析。將SC8的愈傷、體胚、嫩葉、成熟葉、莖、須根、塊根、塊根韌皮部和塊根木質(zhì)部等9個組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)測序結(jié)果提取MeAHL17的FPKM值（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段）進行不同組織的表達模式分析。

（2）MeAHL17在不同塊根發(fā)育時期的表達模式分析。將SC8的塊根形成期（種植后80"d）、塊根膨大期（種植后130、180"d）和塊根成熟期（種植后230、280"d）的塊根進行轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)測序結(jié)果提取MeAHL17的FPKM值進行木薯塊根不同發(fā)育時期的表達模式分析。

（3）MeAHL17在不同激素處理下的表達模式分析。以MS培養(yǎng)基上生長8周左右的生長狀態(tài)良好且一致的木薯組培苗為對象，用100"μmol/L脫落酸（ABA）、100"μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、100"μmol/L乙烯前體（ACC）和100"μmol/L生長素（IAA）溶液噴灑木薯的根、莖、葉，進行外源激素處理0、6、12、24"h，每個樣品3個重復(fù)。提取樣品RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA稀釋10倍作為模板，以β-Tublin為內(nèi)參基因，對MeAHL17基因進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系：MonAmpTM"ChemoHS"qPCR"Mix"5"μL，上、下游引物各0.2"μL，DNA模板1"μL，Nuclease-Free"Water"3.6"μL；反應(yīng)程序：95"℃"10"min；95"℃"10"s，58"℃"10"s，72"℃"30"s，共40個循環(huán)；95"℃"15"s，60"℃"15"s，95"℃"15"s作溶解曲線。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，表達量用2–ΔΔCT方法計算相對表達量。

（4）MeAHL17在不同脅迫處理下的表達模式分析。用20%的聚乙二醇（polyethylene"glycol，"PEG）溶液模擬干旱脅迫處理；用300"mmol/L的氯化鈉（NaCl）溶液進行鹽脅迫處理；將木薯放置到4"℃的培養(yǎng)房中進行低溫脅迫處理。分別處理0、12、24、48"h，每個樣品3個重復(fù)，后續(xù)實驗操作同1.2.5-（3）。

2""結(jié)果與分析

2.1""MeAHL17基因的克隆

本研究從SC8組培苗中提取總RNA，并用1%濃度的瓊脂糖膠檢測其質(zhì)量，膠圖顯示質(zhì)量良好（圖1A）。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以其為模板PCR擴增出MeAHL17編碼區(qū)序列，獲得全長939"bp的目的基因（圖1B）。為驗證得到的MeAHL17序列的準確性，將擴增的MeAHL17編碼區(qū)序列與將pMD19-T載體進行連接并測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴增獲得的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中LOC110606315對應(yīng)的基因序列和木薯數(shù)據(jù)庫中Manes.02G145600對應(yīng)的基因序列完全一致，說明成功得到目的基因MeAHL17（圖1C）。

2.2""生物信息學(xué)分析

2.2.1""MeAHL17基因啟動子分析""通過在線網(wǎng)站Plantcare對MeAHL17的啟動子進行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，MeAHL17基因啟動子的順式作用元件除了核心元件TATA-box與CAAT-box外，還包括脫落酸、水楊酸和茉莉酸甲酯等激素響應(yīng)元件，低溫響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件等（表3）。

2.2.2""MeAHL17蛋白理化性質(zhì)分析""通過在線網(wǎng)站ProtParam對MeAHL17蛋白理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeAHL17蛋白由312個氨基酸組成，理論等電點為6.89，分子式為C1420H2215N415O451S11，分子量為32"669.38"kDa，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Lys+Arg）為23，帶負電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為24，脂肪系數(shù)為57.47，總平均親水性系數(shù)（GRAVY）為–0.491，不穩(wěn)定系數(shù)為58.06，結(jié)合親水性預(yù)測結(jié)果（圖2A）表明，MeAHL17蛋白是一個親水性的、不穩(wěn)定的酸性蛋白。

對MeAHL17蛋白進行糖基化位點和磷酸化位點預(yù)測，結(jié)果顯示，MeAHL17蛋白有5個糖基化位點（圖2B）和45個磷酸化位點（圖2C），包括Tyr（18個）、Ser（24個）、Thr（3個），說明木薯MeAHL17蛋白活性的調(diào)控可能與磷酸化修飾有關(guān)。通過Protter軟件對MeAHL17進行蛋白結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)MeAHL17不含有信號肽，位于細胞膜內(nèi)，無跨膜結(jié)構(gòu)（圖2D）。

2.2.3""MeAHL17蛋白保守功能域的預(yù)測和序列比對""通過NCBI網(wǎng)站對MeAHL17蛋白的保守功能域進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含AHL基因家族特有的DUF296保守結(jié)構(gòu)域，即PPC結(jié)構(gòu)域（圖3）；將木薯MeAHL17與其他物種中同源性較高的AHL蛋白進行序列比對，發(fā)現(xiàn)所有蛋白序列具有高度保守性，且包含AT-hook保守核心序列和包含PPC結(jié)構(gòu)域的保守核心序列（圖4），說明MeAHL17是一個AHL基因。

2.3""亞細胞定位

將GV3101/pCAMBIA1300-MeAHL17-GFP和GV3101/pCAMBIA1300-GFP活化集菌后，利用侵染液將菌體重懸，然后注射煙草葉片進行瞬時表達。結(jié)果如圖5所示，MeAHL17定位在細胞核。

2.4""轉(zhuǎn)錄活性分析

將pGBKT7-MeAHL17、pGBKT7-p53+pGADT7-"largeT（陽性對照）和pGBKT7（陰性對照）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至AH109酵母感受態(tài)后，點到SD/-Trp/"X-α-gal固體缺陷培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)pGBKT7-MeAH L17在SD/-Trp/X-α-gal固體缺陷培養(yǎng)基上與陽性對照一樣變藍，而陰性對照未變藍（圖6），說明MeAHL17是轉(zhuǎn)錄因子且具有轉(zhuǎn)錄活性。

2.5""MeAHL17基因表達模式分析

2.5.1""MeAHL17在不同組織器官的表達模式分析""根據(jù)實驗室已有的SC8木薯的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對MeAHL17進行表達模式分析，發(fā)現(xiàn)該基因在木薯不同組織表達量差異顯著，其中，MeAHL17在體胚的表達量最高，其次是須根、愈傷和塊根韌皮部，在塊根和莖中表達量較低，其余組織幾乎不表達（圖7）。

2.5.2""MeAHL17在塊根發(fā)育時期的表達模式分析""在SC8木薯塊根發(fā)育過程中，MeAHL17在木薯種植后180"d的塊根中表達量最高，在其他時間段表達量差異不顯著（圖8）。

2.5.3""MeAHL17在各激素處理下的表達模式分析""由于MeAHL17基因啟動子含有ABA、MeJA等響應(yīng)元件，為驗證MeAHL17是否在木薯中響應(yīng)激素脅迫，通用實時熒光定量PCR法分析MeAHL17在各激素處理下的響應(yīng)情況。如圖9所示，MeAHL17可以被外源乙烯前體、茉莉酸甲酯、和生長素誘導(dǎo)，并且在根、莖和葉中的表達模式略有不同：施加乙烯前體（ACC）后，MeAHL17在莖中的相對表達量隨著處理時間的延長逐漸增加，該基因在根、莖和葉中的相對表達量均在處理后24"h達到最高水平，其相對表達量分別約為0"h的9倍、5倍和3倍；施加脫落酸后，MeAHL17的相對表達量在根、莖和葉中略有變化；施加茉莉酸甲酯后，MeAHL17在根和莖中的相對表達量隨著處理時間的延長逐漸增加，且在處理后24"h達到最高水平，其相對表達量分別約為0"h的10倍和6倍，但MeAHL17在葉中不響應(yīng)外源茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)；施加生長素后，MeAHL17在根、莖和葉中的相對表達量隨著處理時間的延長逐漸增加，且其在莖和葉中的相對表達量在處理后24"h達到最高水平，分別約為0"h的8倍和10倍，但MeAHL17在根中的相對表達量在處理后12"h達到最高水平，約為0"h對照的27倍。結(jié)果表明，MeAHL17可能參與了乙烯、茉莉酸甲酯、和生長素信號途徑。

2.5.4""MeAHL17在不同脅迫處理下的表達模式分析""為驗證MeAHL17是否在木薯中響應(yīng)逆境脅迫，通過實時熒光定量PCR法分析MeAHL17在不同脅迫處理下的響應(yīng)情況。如圖10所示，在干旱處理下，MeAHL17相對表達量在12"h達到最高水平，約為0"h的2倍，而隨著時間的延長，相對表達量回到正常水平；在鹽脅迫處理下，MeAHL17相對表達量在12"h達到最高水平，約為0"h的2倍，而隨著時間的延長，相對表達量逐漸降低；在低溫處理下，MeAHL17相對表達量在0～24"h無明顯變化，但是在處理48"h后MeAHL17相對表達量降低。結(jié)果表明，MeAHL17響應(yīng)干旱和鹽脅迫。

3""討論

AT-hook核定位蛋白是一種小的DNA結(jié)合蛋白基序，在生物界中廣泛存在[42]，最先是由GOODWIN等[43]在哺乳動物非組蛋白的染色體高遷移率蛋白HMG-I"（Y）中發(fā)現(xiàn)。AT-hook核定位蛋白主要包含2個特殊的保守功能結(jié)構(gòu)域，AT-hook基序和植物與原核生物保守基序（plant"and"Prokaryote"conservative，"PPC）結(jié)構(gòu)域，后者也稱為domain"of"unknown"function#296（DUF296）結(jié)構(gòu)域[44-45]。AT-hook基序是AT-hook蛋白結(jié)合DNA和核定位的重要結(jié)構(gòu)域[46-47]，其核心序列由Arg（R）-Gly（G）-Arg（R）-Pro（P）構(gòu)成，其中脯氨酸主要負責該序列的穩(wěn)定性，而精氨酸則是深入到雙鏈DNA內(nèi)部并和DNA中富含AT堿基的區(qū)域相互作用[46，"48]；PPC結(jié)構(gòu)域與AT-hook蛋白在細胞核中的定位有關(guān)，該結(jié)構(gòu)域長度約為120個氨基酸，位于AT-hook基序的羧基末端，PPC結(jié)構(gòu)域包含保守的Gly（G）-Arg（R）-Phe（F）-Glu（E）-Ile（I）-"Leu（L）序列[9，"44，"49]。

本研究成功從華南8號木薯中克隆獲得MeAHL17基因，其編碼區(qū)序列長939"bp，編碼312個氨基酸。通過對MeAHL17蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，MeAHL17蛋白是一個親水性的、不穩(wěn)定的酸性蛋白且不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，與胡冬秀等[14]和王曉彤等[50]的研究結(jié)果一致。對MeAHL17蛋白進行糖基化位點和磷酸化位點預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeAHL17蛋白有5個糖基化位點和45個磷酸化位點，已有研究表明AtAHL10的S314位點磷酸化能在干旱脅迫下調(diào)節(jié)發(fā)育和激素相關(guān)基因的表達，從而對植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[33]，因此推測MeAHL17蛋白的磷酸化修飾對木薯的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。通過MeAHL17蛋白保守功能域的預(yù)測和與其他物種中已鑒定的且同源性較高的AHL蛋白進行序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含AHL基因家族特有的PPC保守結(jié)構(gòu)域，且包含AT-hook保守核心序列和PPC結(jié)構(gòu)域的保守核心序列，符合AT-hook基因家族結(jié)構(gòu)特征[7]。通過亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄活性分析實驗證明，MeAHL17是一個定位于細胞核且具有轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子。

已有研究表明，AT-hook基因在植物的生長發(fā)育、器官構(gòu)建、逆境脅迫和激素信號應(yīng)答等方面發(fā)揮重要的作用[6]，如，AHL18通過調(diào)節(jié)根尖分生組織的伸長和細胞分裂從而參與主根生長和側(cè)根發(fā)育[51]；AHL22通過調(diào)控FT和PIF4的表達來控制開花和下胚軸伸長[24，"31]，AHL轉(zhuǎn)錄因子通過降低PIFs與激素信號通路相關(guān)基因的結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄激活來影響葉柄的生長[52]；ORE7/ESC基因可以延緩茉莉酸甲酯、脫落酸和乙烯激素參與的葉片衰老進程[32]；LcAHL基因參與了抗干旱脅迫和體細胞胚的發(fā)育，且在體細胞胚發(fā)生過程中呈高表達[19]。在本研究中，結(jié)合MeAHL17在各激素處理下的表達模式分析和不同組織器官的表達模式分析，推測MeAHL17可能通過參與乙烯、茉莉酸甲酯、和生長素信號途徑，從而對植物的生長發(fā)育，尤其是體胚和根的發(fā)育發(fā)揮重要的調(diào)控作用；MeAHL17在不同脅迫處理下的表達模式分析結(jié)果表明MeAHL17對干旱和鹽脅迫有所響應(yīng)。以上研究結(jié)果為進一步了解MeAHL17基因在木薯生長發(fā)育、器官構(gòu)建及逆境脅迫與激素信號應(yīng)答等方面的功能奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

• TEMBO"M，"MATAA"M，"LEGG"J"P，"CHIKOTI"P"C，"NTAWURUHUNGA"P."Cassava"mosaic"disease："incidence"and"yield"performance"of"cassava"cultivars"in"Zambia[J]."Journal"of"Plant"Pathology，"2017，"99（3）："681-689.
• LEBOT"V，"ATHERTON"J，"REES"A."Tropical"root"and"tuber"crops："cassava，"sweet"potato，"yams"and"aroids[M]."Beijing："CABI，"2020.
• OKOGBENIN"E，"SETTER"T"L，"FERGUSON"M，"MUTEGI"R，"CEBALLOS"H，"OLASANMI"B，"FREGENE"M."Phenotypic"approaches"to"drought"in"cassava："review[J]."Frontiers"in"Physiology，"2013，"4："93.
• EL-SHARKAWY"M"A."Cassava"biology"and"physiology"cassava："a"crop"for"sustainable"agriculture"and"food"security"in"developing"countries[J]."Plant"Molecular"Biology，"2004，"56："481-501.
• 王惠君，"王文泉，"李文彬，"陳新，"盧誠，"黎明，"陳友."木薯的抗寒性及北移栽培技術(shù)研究進展綜述[J]."熱帶作物學(xué)報，"2016，"37（7）："1437-1443."WANG"H"J，"WANG"W"Q，"LI"W"B，"CHEN"X，"LU"C，"LI"M，"CHEN"Y."Research"progress"on"cold"resistance"of"cassava"and"northward"migration"cultivation"techniques[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2016，"37（7）："1437-1443."（in"Chinese）
• 李津璇，"郭敏，"王加峰，"楊瑰麗."AT-hook基因及其在植物開花調(diào)控中的研究進展[J]."中國農(nóng)學(xué)通報，"2021，"37（27）："77-81.LI"J"X，"GUO"M"，"WANG"J"F，"YANG"G"L."Research"progress"of"AT-hook"genes"and"their"role"in"plant"flowering"regulation[J]."Chinese"Agricultural"Science"Bulletin，"2021，"37（27）："77-81."（in"Chinese）
• 肖朝文."擬南芥AT-hook蛋白的功能研究[D]."北京："中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，"2009.XIAO"C"W."Functional"study"of"AT-hook"protein"in"Arabidopsis"Thaliana[D]."Beijing："Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"2009."（in"Chinese）
• KIM"H"B，"OH"C"J，"PARK"Y"C，"LEE"Y，"CHOE"S，"AN"C"S，"CHOI"S"B."Comprehensive"analysis"of"AHL"homologous"genes"encoding"AT-hook"motif"nuclear"localized"protein"in"rice[J]."Bmb"Reports，"2011，"44（10）："680.
• ZHAO"J，"FAVERO"D"S，"QIU"J，"ROALSON"E"H，"NEFF"M"M."Insights"into"the"evolution"and"diversification"of"the"AT-hook"motif"nuclear"localized"gene"family"in"land"plants[J]."Bmc"Plant"Biology，"2014，"14（1）："266.
• BISHOP"E"H，"KUMAR"R，"LUO"F，"SASKI"C，"SEKHON"R"S."Genome-wide"identification，"expression"profiling，"and"network"analysis"of"AT-hook"gene"family"in"maize[J]."Genomics，"2019，"112（2）："1233-1244.
• ZHAO"L，"LU"Y，"CHEN"W，"YAO"J，"LI"Y，"LI"Q，"PAN"J，"FANG"S，"SUN"J，"ZHANG"Y."Genome-wide"identification"and"analyses"of"the"AHL"gene"family"in"cotton"（Gossypium）[J]."BMC"Genomics，"2020，"21（1）："69.
• WANG"M，"CHEN"B，"ZHOU"W，"XIE"L，"WANG"L，"ZHANG"Y，"ZHANG"Q."Genome-wide"identification"and"expression"analysis"of"the"AT-hook"motif"nuclear"localized"gene"family"in"soybean[J]."BMC"Genomics，"2021，"22（1）："361.
• LI"X，"HE"H，"WANG"H，"WU"X，"MAO"J."Identification"and"expression"analysis"of"the"AHL"gene"family"in"grape"（Vitix"vinifera）[J]."Plant"Gene，"2021，"26："100285.
• 胡冬秀，"劉浩，"梁炫強，"吳自明，"方加海."花生AT-hook家族基因的生物信息學(xué)分析[J]."熱帶作物學(xué)報，"2021，"42（3）："649-659.HU"D"X，"LIU"H"，"LIANG"X"Q，"WU"Z"M，"FANG"J"H."Bioinformatics"analysis"of"AT-hook"genes"in"peanut[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2021，"42（3）："649-659."（in"Chinese）
• MACHAJ"G，"GRZEBELUS"D."Characteristics"of"the"AT-Hook"motif"Containing"Nuclear"Localized"（AHL）"genes"in"carrot"provides"insight"into"their"role"in"plant"growth"and"storage"root"development[J]."Genes，"2021，"12（5）："764.
• WANG"H，"LENG"X，"YANG"J，"ZHANG"M，"ZENG"M，"XU"X，"WANG"F，"LI"C."Comprehensive"analysis"of"AHL"gene"family"and"their"expression"under"drought"stress"and"ABA"treatment"in"Populus"trichocarpa[J]."PeerJ，"2021，"9："e10932.
• ZHANG"W"M，"FANG"D，"CHENG"X"Z，"CAO"J，"TAN"X"L."Insights"into"the"molecular"evolution"of"AT-Hook"motif"nuclear"localization"genes"in"Brassica"napus[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2021，"12："714305.
• JIA"P，"LIU"J，"YAN"R，"YANG"K，"DONG"Q，"LUAN"H，"ZHANG"X，"LI"H，"GUO"S，"QI"G."Systematical"characterization"of"the"AT-Hook"gene"family"in"Juglans"regia"L."and"the"functional"analysis"of"the"JrAHL2"in"flower"induction"and"hypocotyl"elongation[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2023，"24（8）："7244.
• TANG"Y，"WU"W，"ZHENG"X，"LU"L，"CHEN"X，"HAO"Z，"LIU"S，"CHEN"Y."AT-Hook"transcription"factors"show"functions"in"Liriodendron"chinense"under"drought"stress"and"somatic"embryogenesis[J]."Plants，"2023，"12（6）："1353.
• ZHANG"X，"LI"J，"CAO"Y，"HUANG"J，"DUAN"Q."Genome-wide"identification"and"expression"analysis"under"abiotic"stress"of"BrAHL"genes"in"Brassica"rapa[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2023，"24（15）："12447."
• WANG"L，"LI"T，"LIU"N，"LIU"X."Identification"of"tomato"AHL"gene"families"and"functional"analysis"their"roles"in"fruit"development"and"abiotic"stress"response[J]."Plant"Physiol"Biochem，"2023，"202："107931.
• JIN"Y，"LUO"Q，"TONG"H，"WANG"A，"CHENG"Z，"TANG"J，"LI"D，"ZHAO"X，"LI"X，"WAN"J，"JIAO"Y，"CHU"C，"ZHU"L."An"AT-hook"gene"is"required"for"palea"formation"and"floral"organ"number"control"in"rice[J]."Developmental"Biology，"2011，"359（2）："277-288.
• STREET"I"H，"SHAH"P"K，"SMITH"A"M，"AVERY"N，"NEFF"M"M.The"AT-hook-containing"proteins"SOB3/AHL29"and"ESC/AHL27"are"negative"modulators"of"hypocotyl"growth"in"Arabidopsis[J]."The"Plant"Journal，"2010，"54（1）："1-14.
• XIAO"C，"CHEN"F，"YU"X，"LIN"C，"FU"Y"F."Over-expression"of"an"AT-hook"gene，"AHL22，"delays"flowering"and"inhibits"the"elongation"of"the"hypocotyl"in"Arabidopsis"thaliana[J]."Plant"Molecular"Biology，"2009，"71（1）："39-50.
• LOU"Y，"XU"X"F，"ZHU"J，"GU"J"N，"BLACKMORE"S，"YANG"Z"N."The"tapetal"AHL"family"protein"TEK"determines"nexine"formation"in"the"pollen"wall[J]."Nature"Communications，"2014，"5（1）："3855.
• JIA"Q"S，"ZHU"J，"XU"X"F，"LOU"Y，"ZHANG"Z"L，"ZHANG"Z"P，"YANG"Z"N."Arabidopsis"AT-hook"protein"TEK"positively"regulates"the"expression"of"arabinogalactan"proteins"for"Nexine"formation[J]."Molecular"Plant，"2015，"8（2）："251-260.
• GALLAVOTTI"A，"MALCOMBER"S，"GAINES"C，"STANFI ELD"S，"WHIPPLE"C，"KELLOGG"E，"SCHMIDT"R"J."BARREN"STALK"FASTIGIATE1"is"an"AT-hook"protein"required"for"the"formation"of"maize"ears[J]."The"Plant"Cell，"2011，"23（5）："1756-1771.
• ZHOU"J，"WANG"X，"LEE"J"Y，"LEE"J"Y."Cell-to-cell"movement"of"two"interacting"AT-hook"factors"in"Arabidopsis"root"vascular"tissue"patterning[J]."The"Plant"Cell，"2013，"25（1）："187-201.
• XU"Y，"WANG"Y，"STROUD"H，"GU"X，"SUN"B，"GAN"E"S，"NG"K"H，"JACOBSEN"S"E，"He"Y，"ITO"T."A"matrix"protein"silences"transposons"and"repeats"through"interaction"with"retinoblastoma-associated"proteins[J]."Current"Biology，"2013，"23（4）："345-350.
• XU"Y，"GAN"E"S，"ITO"T."The"AT-hook/PPC"domain"protein"TEK"negatively"regulates"floral"repressors"including"MAF4"and"MAF5[J]."Plant"Signaling"amp;"Behavior，"2013，"8（8）："e25006.
• YUN"J，"KIM"Y"S，"JUNG"J"H，"SEO"P"J，"PARK"C"M."The"AT-hook"motif-containing"protein"AHL22"regulates"flowering"initiation"by"modifying"FLOWERING"LOCUS"T"chromatin"in"Arabidopsis[J]."Journal"of"Biological"Chemistry，"2012，"287（19）："15307-15316.
• LIM"P"O，"KIM"Y，"BREEZE"E，"KOO"J"C，"WOO"H"R，"RYU"J"S，"PARK"D"H，"BEYNON"J，"TABRETT"A，"BUCHANAN-"WOLLASTON"V，"NAM"H"G."Overexpression"of"a"chromatin"architecture-controlling"AT-hook"protein"extends"leaf"longevity"and"increases"the"post-harvest"storage"life"of"plants[J]."Plant"Journal"for"Cell"amp;"Molecular"Biology，"2010，"52（6）："1140-1153.
• WONG"M"M，"BHASKARA"G"B，"WEN"T"N，"LIN"W"D，"NGUYEN"T"T，"CHONG"G"L，"VERSLUES"P"E."Phosphoproteomics"of"Arabidopsis"highly"ABA-Induced1"identifies"AT-hook-LIke10"phosphorylation"required"for"stress"growth"regulation[J]."Proceedings"of"the"National"Academy，"2019，"116（6）："2354-"2363.
• ZHOU"L，"LIU"Z，"LIU"Y，"KONG"D，"LI"T，"YU"S，"MEI"H，"XU"X，"LIU"H，"CHEN"L，"LUO"L."A"novel"gene"OsAHL1"improves"both"drought"avoidance"and"drought"tolerance"in"rice[J]."Scientific"Reports，"2016，"6："30264.
• LU"H，"ZOU"Y，"FENG"N."Overexpression"of"AHL20"negatively"regulates"defenses"in"Arabidopsis[J]."Journal"of"Integrative"Plant"Biology，"2010，"52（9）："801-808.
• KUMAR"K，"PURAYANNUR"S，"KALADHAR"V"C，"PARIDA"S"K，"VERMA"P"K."mQTL-seq"and"classical"mapping"implicates"the"role"of"an"AT-HOOK"MOTIF"CONT AINING"NUCLEAR"LOCALIZED"（AHL）"family"gene"in"Ascochyta"blight"resistance"of"chickpea[J]."Plant，"Cell"amp;"Environment，"2018，"41（9）："2128-2140.
• LI"B，"KLIEBENSTEIN"D"J."The"AT-hook"motif-encoding"gene"METABOLIC"NETWORK"MODULATOR"1"underlies"natural"variation"in"Arabidopsis"primary"metabolism[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2014，"5："415.
• MATSUSHITA"A，"FURUMOTO"T，"ISHIDA"S，"TAKAHASHI"Y."AGF1，"an"AT-hook"protein，"is"necessary"for"the"negative"feedback"of"AtGA3ox1"encoding"GA"3-oxidase[J]."Plant"Physiology，"2007，"143（3）："1152-1162.
• RASHOTTE"A"M，"CARSON"S"D，"TO"J"P，"KIEBER"J"J."Expression"profiling"of"cytokinin"action"in"Arabidopsis[J]."Plant"Physiology，"2003，"132（4）：1998-2011.
• VOM"ENDT"D，"SOARES"E"SILVA"M，"KIJNE"J"W，"PASQUALI"G，"MEMELINK"J."Identification"of"a"bipartite"jasmonate-responsive"promoter"element"in"the"Catharanthus"roseus"ORCA3"transcription"factor"gene"that"interacts"specifically"with"AT-hook"DNA-binding"proteins[J]."Plant"Physiology，"2007，"144（3）："1680-1689.
• HU"W，"JI"C，"LIANG"Z，"YE"J，"OU"W，"DING"Z，"ZHOU"G，"TIE"W，"YAN"Y，"YANG"J，"MA"L，"YANG"X，"WEI"Y，"JIN"Z，"XIE"J，"PENG"M，"WANG"W，"GUO"A，"XU"B，"GUO"J，"CHEN"S，"WANG"M，"ZHOU"Y，"LI"X，"LI"R，"XIAO"X，"WAN"Z，"AN"F，"ZHANG"J，"LENG"Q，"LI"Y，"SHI"H，"MING"R，"LI"K."Resequencing"of"388"cassava"accessions"identifies"valuable"loci"and"selection"for"variation"in"heterozygosity[J]."Genome"Biology，"2021，"22（1）："316.
• CHURCHILL"M"E，"TRAVERS"A"A."Protein"motifs"that"recognize"structural"features"of"DNA[J]."Trends"in"Biochemical"Sciences，"1991，"16（1）："92-97.
• GOODWIN"G"H，"SANDERS"C，"JOHNS"E"W."A"new"group"of"chromatin-associated"proteins"with"a"high"content"of"acidic"and"basic"amino"acids[J]."European"Journal"of"Biochemistry，"1973，"38（1）："14-19.
• 王元元，"劉姣，"郭育強，"王碩，"符少萍，"段瑞軍，"李瑞梅，"姚遠，"胡新文，"郭建春."AT-hook蛋白的最新研究進展[J]."基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，"2020，"39（2）："713-717.WANG"Y"Y，"LIU"J，"GUO"Y"Q，"WANG"S，"FU"S"P，"DUAN"R"J，"LI"R"M，"YAO"Y，"HU"X"W，"GUO"J"C."Recent"advances"in"AT-hook"proteins[J]."Genomics"and"Applied"Biology，"2020，"39（2）："713-717."（in"Chinese）
• ZHAO"J，"FAVERO"D"S，"PENG"H，"NEFF"M"M."Arabidopsis"thaliana"AHL"family"modulates"hypocotyl"growth"redundantly"by"interacting"with"each"other"via"the"PPC/DUF296"domain[J]."Proceedings"of"the"National"Academy"of"Sciences，"2013，"110（48）："E4688-E4697.
• ARAVIND"L，"LANDSMAN"D."AT-hook"motifs"identified"in"a"wide"variety"of"DNA-binding"proteins[J]."Nucleic"Acids"Research，"1998，"26（19）："4413-4421.
• DO"H"J，"SONG"H，"YANG"H"M，"KIM"D"K，"KIM"N"H，"KIM"J"H，"CHA"K"Y，"CHUNG"H"M，"KIM"J"H."Identification"of"multiple"nuclear"localization"signals"in"murine"Elf3，"an"ETS"transcription"factor[J]."FEBS"Letters，"2006，"580（7）："1865-"1871.
• DELANEY"S"K，"ORFORD"S"J，"MARTIN-HARRIS"M，"TIMMIS"J"N."The"fiber"specificity"of"the"cotton"FSltp4"gene"promoter"is"regulated"by"an"AT-rich"promoter"region"and"the"AT-hook"transcription"factor"GhAT1[J]."Plant"amp;"Cell"Physiology，"2007，"48（10）："1426.
• FUJIMOTO"S，"MATSUNAGA"S，"YONEMURA"M，"UCHI YAMA"S，"AZUMA"T，"FUKUI"K."Identification"of"a"novel"plant"MAR"DNA"binding"protein"localized"on"chromosomal"surfaces[J]."Plant"Molecular"Biology，"2004，"56（2）："225-239.
• 王曉彤，"張建禹，"耿沙，"任思楊，"毋志浩，"李瑞梅，"姚遠，"郭建春，"劉姣，"胡新文."木薯MeAHL22基因的克隆及功能初步分析[J]."分子植物育種，"2022，"20（5）："1443-1451.WANG"X"T，"ZHANG"J"Y，"GENG"S，"REN"S"Y，"WU"Z"H，"LI"R"M，"YAO"Y，"GUO"J"C，"LIU"J，"HU"X"W."Cloning"and"functional"analysis"of"MeAHL22"gene"in"cassava[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2022，"20（5）："1443-1451."（in"Chinese）
• SIRL"M，"SNAJDROVA"T，"GUTIERREZ-ALANIS"D，"DUBROVSKY"J"G，"VIELLE-CALZADA"J"P，"KULICH"I，"SOUKUP"A."AT-Hook"motif"nuclear"localised"protein"18"as"a"novel"modulator"of"root"system"architecture[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2020，"21（5）："1886.
• FAVERO"D"S，"KAWAMURA"A，"SHIBATA"M，"TAK EBAYASHI"A，"JUNG"J"H，"SUZUKI"T，"JAEGER"K"E，"ISHIDA"T，"IWASE"A，"WIGGE"P"A，"NEFF"M"M，"SUGI MOTO"K."AT-hook"transcription"factors"restrict"petiole"growth"by"antagonizing"PIFs[J]."Current"Biology，"2020，"30（8）："1454-1466.