牙髓干細胞的生物學特性及其在角膜和視網(wǎng)膜疾病治療中應(yīng)用的研究進展

［摘要］ 牙髓干細胞（DPSCs） 是一類具有廣泛應(yīng)用潛力的間充質(zhì)干細胞。DPSCs 因其多向分化潛能和易獲取的特點成為眼科領(lǐng)域研究的熱點。近年來，DPSCs 在角膜上皮損傷和視網(wǎng)膜退行性病變的治療中表現(xiàn)出潛在的臨床應(yīng)用前景。DPSCs 可以通過分化為角膜上皮細胞和抑制M1 巨噬細胞，促進角膜上皮再生和重建。此外，DPSCs 也可以分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞，替換原有視神經(jīng)元，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子介導(dǎo)損傷修復(fù)，促進視網(wǎng)膜的再生，改善視網(wǎng)膜原有功能?，F(xiàn)系統(tǒng)地回顧近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻，就DPSCs 的生物學特性及其在角膜和視網(wǎng)膜疾病治療中應(yīng)用的研究進展進行綜述，以期為DPSCs 在轉(zhuǎn)化醫(yī)學和眼科相關(guān)疾病治療中應(yīng)用的研究提供思路及策略。

［關(guān)鍵詞］ 牙髓干細胞； 眼； 角膜； 視網(wǎng)膜； 旁分泌

［中圖分類號］ R774. 1 ［文獻標志碼］ A

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始細胞，在特定條件下能夠產(chǎn)生一種或多種特殊細胞類型［1］。根據(jù)分化潛能的不同，干細胞可以分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞［2］。GRONTHOS 等［3］ 首次從成人第三磨牙中分離出快速增殖的單克隆干細胞群，將其移植到免疫功能低下的小鼠背部皮下時， 會產(chǎn)生一種牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為成牙本質(zhì)細胞，外層包繞著牙髓樣間質(zhì)組織， 該細胞群被稱為牙髓干細胞（dental pulpstem cells，DPSCs）。與神經(jīng)干細胞和角膜緣干細胞等單能干細胞不同，DPSCs 具有多向分化能力，在不同的誘導(dǎo)條件下具有向牙本質(zhì)、神經(jīng)、骨和脂肪等譜系分化的潛能［4-9］。近年來，DPSCs 在再生醫(yī)學和轉(zhuǎn)化醫(yī)學領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。DPSCs 的分化、增殖及旁分泌等特性使其可以促進角膜和視網(wǎng)膜疾病損傷的修復(fù)，但國內(nèi)外相關(guān)綜述類報道較少?，F(xiàn)對DPSCs 的生物學特性及其在角膜和視網(wǎng)膜疾病治療中的潛在應(yīng)用價值進行綜述，為DPSCs在相關(guān)眼科疾病治療中的應(yīng)用及轉(zhuǎn)化提供科學依據(jù)。

1 DPSCs 的培養(yǎng)和鑒別

DPSCs 呈梭形， 具有干細胞的一般生物學特性，同時還具備來源廣泛、取材方便和低免疫原性等優(yōu)點； 其與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrowmesenchymal stem cells， BMSCs） 有較多相似之處。二者具有相似的免疫表型， 如CD14 （-）、CD45 （-） 和CD146 （-）， 同時分泌相似的細胞因子，如生肌決定因子（myogenic determingfactor， MyoD）（-）、 神 經(jīng) 微 絲（-）、 整合素β1 （+） 和基質(zhì)細胞抗原1 （stromal cellsantigen 1， STRO-1）（+） 等［10-11］。2 種細胞分化途徑相似，DPSCs 分化的成牙質(zhì)細胞與BMSCs 分化的成骨細胞表達相似的礦化基質(zhì)蛋白， 且DPSCs 在體外培養(yǎng)時較BMSCs 表現(xiàn)出更高的增殖速率。BMSCs 在體外形成鈣化沉積物的同時還形成豐富的脂肪細胞簇， 而DPSCs 在體外形成的鈣化結(jié)節(jié)中不含脂肪細胞。DPSCs 和BMSCs 受相似的細胞因子調(diào)節(jié)，具有相同的蛋白表達譜，但在體外增殖能力和發(fā)育潛力方面存在顯著差異。

2 DPSCs 的生物學特性

2. 1 DPSCs的免疫學特性

聶姍姍等［12］ 發(fā)現(xiàn)：在正常狀態(tài)下，DPSCs 表達組織相容性復(fù)合體（major histocompatibilitycomplex， MHC）- Ⅰ 類分子， 體外培養(yǎng)的第2 代DPSCs中未見MHC-Ⅱ類分子明顯表達。使用γ干擾素（ interferon-γ，IFN-γ）刺激DPSCs后，MHC-Ⅱ類分子表達明顯上調(diào)，但淋巴細胞未見明顯增殖，提示DPSCs 可能具有免疫調(diào)節(jié)功能。采用DPSCs 刺激異體淋巴細胞，異體淋巴細胞不產(chǎn)生增殖反應(yīng)，表明DPSCs 具有較低的抗原反應(yīng)性。DING 等［13］發(fā)現(xiàn)：DPSCs 不能刺激同種異體T 淋巴細胞增殖，且在與混合淋巴細胞的反應(yīng)中抑制T 淋巴細胞和B 淋巴細胞增殖。此外， DPSCs 上調(diào)白細胞介素（interleukin， IL）-10， 下調(diào)IL-2 和IL-17， 并阻礙IFN-γ 的產(chǎn)生。提示轉(zhuǎn)化生長因子β1 （transforminggrowth factor- β1， TGF- β1） 單克隆抗體可以恢復(fù)DPSCs 抑制的T 淋巴細胞增殖，TGF-β1 可能參與了DPSCs 抑制淋巴細胞增殖的過程。同時， 將DPSCs與人外周血單核細胞共培養(yǎng)，調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞的數(shù)量明顯增加，輔助性T 淋巴細胞17 （T helpercell 17，Th17） 細胞明顯減少。

巨噬細胞由經(jīng)典激活的M1 巨噬細胞和選擇性激活的M2 巨噬細胞2 種表型組成。M1 巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎細胞因子，具有促炎作用；相反，M2 巨噬細胞分泌IL-10 等抗炎細胞因子，具有抗炎作用。

DPSCs 具有抗炎作用。核因子κB （nuclearfactor kappa-B，NF-κB） 是調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)過程中的經(jīng)典信號通路，DPSCs 可以部分阻斷NF-κBP65 亞基的表達，下調(diào)NF-κB 和P38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號傳導(dǎo)的激活，導(dǎo)致M1 巨噬細胞分泌TNF-α 減少［14-15］。DPSCs 與巨噬細胞共培養(yǎng)時， DPSCs 通過抑制M1 巨噬細胞分泌TNF-α，對M1 巨噬細胞產(chǎn)生免疫抑制作用。將DPSCs 移植到糖尿病大鼠后肢骨骼肌后， 坐骨神經(jīng)中M2 巨噬細胞明顯增加，M1 巨噬細胞明顯減少，改善了坐骨神經(jīng)血供和軸突形態(tài)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度得以恢復(fù)［16］。

研究［17-18］ 顯示： 干細胞來源的外泌體在調(diào)節(jié)巨噬細胞極化中發(fā)揮重要作用。SHEN 等［14］ 發(fā)現(xiàn)：DPSCs 外泌體中的微小RNA（microRNA，miR）-1246表達水平較高，且可以促進巨噬細胞從促炎表型轉(zhuǎn)化為抗炎表型介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)。

2. 2 DPSCs和血管重建

功能性血管的形成需要內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和周細胞等不同類型細胞之間相互作用， DPSCs 參與并促進血管生成。DPSCs 不但能夠分化為內(nèi)皮細胞和周細胞，還可分泌促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）［19-21］。DPSCs 還通過旁分泌途徑分泌VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（basicfibroblast growth factor，bFGF） 和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF） 等神經(jīng)營養(yǎng)因子，以旁分泌方式誘導(dǎo)血管生成［22］。

3 DPSCs 眼科臨床應(yīng)用

3. 1 角膜損傷

角膜緣干細胞 （limbal stem cells，LSCs） 可以阻止結(jié)膜上皮侵入角膜， 保持角膜組織的透明性， 維持角膜上皮的動態(tài)穩(wěn)定［23］。燒傷、化學損傷、感染和慢性炎癥可導(dǎo)致LSCs 損失或角膜緣生態(tài)破壞， 致使角膜緣干細胞缺陷（limbal stem celldeficiency， LSCD）［24-27］。LSCD 可導(dǎo)致持續(xù)性上皮缺損、角膜結(jié)膜化、新生血管形成、角膜瘢痕和慢性炎癥［28］。傳統(tǒng)的藥物治療可以控制炎癥， 改善淚膜，逐步恢復(fù)角膜緣微環(huán)境，促進健康角膜上皮細胞的分化。但若LSCD 未改善，則需進行羊膜移植手術(shù)， 但單純的羊膜移植手術(shù)不能修復(fù)嚴重LSCD 丟失的LSCs， LSCD 對角膜的損害仍會持續(xù)加重［29-30］。

3. 1. 1 DPSCs 向角膜上皮細胞的分化 KUSHNEREV 等［31］ 刮除人供體角膜的上皮層后， 將DPSCs 轉(zhuǎn)移至角膜接觸鏡（contact lens，CL） 的角膜接觸面，發(fā)現(xiàn)大部分DPSCs 附著在角膜表面，且陽性表達角蛋白（keratin，KRT） 3 和角膜上皮細胞標志物KRT12， 并限制結(jié)膜細胞標志物KRT19 陽性細胞向角膜中心遷移。由此可見，DPSCs 可以分化為角膜上皮細胞， 并且能夠限制結(jié)膜上皮細胞的侵入，阻止角膜結(jié)膜化［32］。

GOMES 等［33］ 將組織工程DPSCs 片移植至輕度化學灼傷（mild chemical burn，MCB） 和重度化學灼傷（severe chemical burn， SCB） 動物模型的角膜床， 結(jié)果顯示： 未接受DPSCs 移植的對照組兔角膜完全結(jié)膜化和混濁， 接受DPSCs 移植的兔眼角膜透明度有所改善，MCB 組較SCB 組兔的角膜更清晰，新生血管形成也較少。SPILLER 等［34］發(fā)現(xiàn)：VEGF 主要由M1 巨噬細胞產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)是血管形成的主要調(diào)節(jié)因素。DPSCs 既具有直接促進血管重建的作用，又有抑制M1 巨噬細胞延緩新生血管形成的作用。

研究［33］ 發(fā)現(xiàn)：MCB 組重建角膜細胞中KRT3和角膜上皮細胞標志物KRT18 染色呈強陽性，表明有角膜上皮細胞生成。ATP 結(jié)合家族亞家族G 亞型成員2 （ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）、腫瘤蛋白P63和抗人LSCs抗體β1-integrin在角膜上皮基底細胞層陽性表達，證實DPSCs可以向LSCs分化［35］。然而，由于SCB 組重建角膜的化學損傷嚴重，局部微環(huán)境的變化較大，KRT3 和P63表達呈陰性。組織工程DPSCs 片的成功移植為LSCD 的治療提供了新的視角， 具有重要的臨床意義。

3. 1. 2 DPSCs 向角膜基質(zhì)細胞的分化 研究［36-37］發(fā)現(xiàn)： 誘導(dǎo)DPSCs 向角膜基質(zhì)細胞分化后醛脫氫酶3 家族成員A1 （aldehyde dehydrogenase 3 familymember A1，ALDH3A1）、碳水化合物磺基轉(zhuǎn)移酶6（carbohydrate sulfotransferase 6， CHST6） 和角膜基質(zhì)細胞特征性基因前列腺素D2 合酶（prostaglandin D2 synthase， PTGDS） 表達上調(diào)，4 周后觀察到DPSCs 產(chǎn)生排列整齊的膠原，并誘導(dǎo)出透明的角膜基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)； 將DPSCs 注射到小鼠的角膜基質(zhì)中，使用光學相干斷層掃描（opticalcoherence tomogrophy， OCT） 評估小鼠角膜的光散射和基質(zhì)水腫程度，結(jié)果與陰性對照組小鼠無明顯差異， 提示DPSCs 移植并不影響角膜透明度，也不誘導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)。由此證實DPSCs 可以向角膜基質(zhì)細胞進行分化，且在角膜盲的個性化臨床治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。

3. 1. 3 DPSCs 向角膜內(nèi)皮樣細胞的分化 WAGONER 等［38］ 先將誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cells， IPSCs） 分化為神經(jīng)嵴細胞，再誘導(dǎo)神經(jīng)嵴細胞分化為角膜內(nèi)皮樣細胞。BOSCH 等［39］ 據(jù)此提出了DPSCs 兩步誘導(dǎo)方案， 先誘導(dǎo)DPSCs 分化為神經(jīng)嵴干細胞， 再誘導(dǎo)其分化為閉鎖小帶蛋白1 （zonula occludens-1，ZO-1）、Na+/K+ATP 酶α1 亞基（ATPase Na+/K+transporting α1 polypetide，ATP1A1）、Ⅳ型膠原蛋白α2 （collagen type Ⅳ alpha2，COL4A2） 和角膜內(nèi)皮細胞特異性蛋白Ⅷ 型膠原A2 （collagen type Ⅷalpha2，COL8A2） 上調(diào)的角膜內(nèi)皮樣細胞，該細胞具有與角膜內(nèi)皮細胞相同的特征性六邊形結(jié)構(gòu)，證實DPSCs 可以分化為角膜內(nèi)皮樣細胞， 為角膜內(nèi)皮損傷治療提供了新的思路。

DPSCs 可以分化為角膜內(nèi)皮樣細胞、角膜基質(zhì)細胞、角膜上皮細胞和LSCs 等。移植的DPSCs可恢復(fù)受損角膜組織的透明性， 將DPSCs 應(yīng)用于角膜重建具有一定的可行性，但其具體機制尚未完全闡明。DPSCs 可能分化為單一種類的角膜細胞或同時分化為幾種角膜細胞參與角膜重建，并可通過DPSCs 抑制M1 巨噬細胞促進角膜上皮再生。DPSCs 減少輕度化學灼傷眼新生血管形成的機制和利用DPSCs 分化的角膜細胞制作有功能性的全層角膜方法也是需要探索的問題。

3. 2 視網(wǎng)膜退行性疾病

視網(wǎng)膜退行性疾病主要包括青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜色素變性［40-44］。目前針對以上幾種視網(wǎng)膜退行性疾病的治療方法主要是對癥治療，從而緩解視網(wǎng)膜細胞變性及凋亡的進展，尚缺乏有效的促進視網(wǎng)膜細胞再生的方法。

3. 2. 1 DPSCs 向視網(wǎng)膜光感受器樣細胞的分化 DPSCs 與小鼠視網(wǎng)膜Müller 細胞在條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后，神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP） 和神經(jīng)前體細胞標志物多聚唾液酸神經(jīng)細胞黏附分子（ polysialicacid neural cell adhesion molecule， PSA-NCAM）雙陽性的細胞數(shù)量增加，約44% 的DPSCs 視紫紅質(zhì)編碼基因視錐-視桿細胞同源異形框基因（conerodhomeobox containing gene， CRX） 上調(diào)且陽性表達視紫紅質(zhì)和神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈（neuralretina leucine zipper， NRL） 蛋白， 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）表達明顯增加。提示DPSCs 能夠?qū)Σ煌囊暰W(wǎng)膜條件培養(yǎng)液作出反應(yīng)， 誘導(dǎo)出神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞和視網(wǎng)膜光感受器樣細胞， 且具有分泌BDNF 的能力［45］。

3. 2. 2 DPSCs 向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞的分化 ROOZAFZOON 等［46］ 將DPSCs 分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞置于3D 支架中培養(yǎng)，結(jié)果顯示：與常規(guī)二維細胞培養(yǎng)比較， 配對盒轉(zhuǎn)錄因子6 （pairedbox 6， Pax6）、無調(diào)性bHLH 轉(zhuǎn)錄因子7 （atonalbHLH transcription factor 7，Atoh7） 和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性標記基因大腦特異性同源盒/POU 結(jié)構(gòu)域3B （brain specific homeobox/POU domainprotein 3B，Brn3B） 在3D 結(jié)構(gòu)中的表達分別增加了2. 307 倍、1. 624 倍和3. 140 倍，提示3D 纖維蛋白支架更有利于DPSCs 向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞分化，更接近自然的組織特性，為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的體外培養(yǎng)和利用提供了參考。

3. 2. 3 DPSCs 在視網(wǎng)膜退行性疾病動物模型中的應(yīng)用 DPSCs 移植到視神經(jīng)鉗夾模型大鼠玻璃體后，可旁分泌腦源性神經(jīng)因子、神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子3 等細胞因子，促進視神經(jīng)損傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinalganglion cells， RGCs） 修復(fù)和軸突再生［47-49］ 。MEAD 等［50］ 將DPSCs 移植至RGCs 損傷大鼠玻璃體中，5 周后RGCs 存活率為95%，而對照組存活率為67%，證實DPSCs 可以保護RGCs 及其軸突，維持RGCs 功能， 提示應(yīng)用DPSCs 可以成為治療青光眼的新途徑。

ALSAEEDI 等［51］ 將DPSCs 注射至視網(wǎng)膜變性大鼠的玻璃體內(nèi)，結(jié)果顯示：與對照組比較，注射DPSCs 組大鼠b 波振幅減小程度較輕， 表明DPSCs 在視網(wǎng)膜中起保護作用，可以減輕碘酸鈉對視網(wǎng)膜組織的毒性， 但其保護作用是由于DPSCs分化細胞的替代作用或由分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)保護作用尚需進一步探討。

DPSCs 在治療視網(wǎng)膜退行性疾病方面同樣具有巨大潛力，目前對其可能的作用機制有以下幾種觀點：①DPSCs 通過分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞以替代病變部位的細胞［46］；② DPSCs 通過旁分泌途徑分泌營養(yǎng)因子， 保護神經(jīng)元存活， 促進軸突再生和視網(wǎng)膜功能恢復(fù)［47］；③ 細胞分化和營養(yǎng)因子同時作用， DPSCs 分化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以作為支持細胞并分泌營養(yǎng)因子，進而改善原有功能［52］。

神經(jīng)干細胞在視網(wǎng)膜退行性疾病方面的作用機制包括替換原有視神經(jīng)元及分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子介導(dǎo)損傷修復(fù)，與DPSCs 的作用機制相似［53］。DPSCs是否先分化為神經(jīng)干細胞，再對視網(wǎng)膜退行性疾病進行修復(fù)， 尚需進一步研究。同時， DPSCs 分化后的細胞在替代病變部位的光感受器細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞后是否具有正常的細胞功能且如何安全地利用細胞分化或旁分泌途徑分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子也需進一步探討。

4 小結(jié)與展望

DPSCs 具有分化為角膜內(nèi)皮樣細胞、角膜基質(zhì)細胞和角膜上皮細胞等能力，移植后可恢復(fù)角膜透明性， 具備角膜重建的潛力。此外， DPSCs 可能通過細胞替代或分泌營養(yǎng)因子在治療視網(wǎng)膜退行性疾病方面展現(xiàn)出潛在的臨床前景。盡管研究人員已經(jīng)取得了部分研究進展，但仍然需要更多的實驗和臨床研究來進一步驗證和探索牙髓干細胞在眼科相關(guān)疾病治療方面的機制、療效及安全性。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉翔宇參與論文選題、文獻整理和論文撰寫，張夢迪參與論文審校，王霽雪參與論文審校和論文撰寫指導(dǎo)，徐春玲參與論文選題和論文撰寫指導(dǎo)。

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