防護風鏡對眼爆震傷誘導視網(wǎng)膜病理損傷和自噬變化的有效改善

摘要： 首先基于頭部動態(tài)測試系統(tǒng)與激波管和外場實彈實爆測試環(huán)境，驗證了眼部裝備（護目鏡和風鏡）的防護性能。研究結果表明，風鏡防護性能更優(yōu)，建議給執(zhí)勤人員配發(fā)兼容防紫外、強光、煙霧和防破片功能的風鏡產(chǎn)品，以提高相關人員眼部防護能力。此后，研究眼部爆震傷后組織損傷、功能改變及市售風鏡動物實驗版的防護作用與機制，為防治眼部爆震傷及風鏡后續(xù)的設計改進提供理論依據(jù)。選用比格犬和C57 小鼠進行相關動物實驗，通過HE、Tunel、Nissl 染色、視覺電生理檢查等檢測方法，發(fā)現(xiàn)隨著沖擊波強度的提高和傷后時間的延長，視網(wǎng)膜損傷程度和細胞凋亡程度均提高， 其中神經(jīng)節(jié)細胞層（ ganglion cell layer， GCL） 和光感受器內外節(jié)交界處（ layer of photoreceptorinner/outer segments， IS/OS）受到的損傷最嚴重；進一步研究分子變化發(fā)現(xiàn)，自噬相關調節(jié)蛋白SQSTM1/p62（P ＜ 0.000 1）和LC3-Ⅱ（P = 0.843 7）、LC3-Ⅰ（P = 0.003）的表達量明顯增高，說明視網(wǎng)膜損傷一定程度上是由爆震傷后自噬增強這一機制導致的。市售風鏡的動物實驗版能夠有效減輕沖擊波對視網(wǎng)膜的損傷，保護RNFL、INL/ONL、GCL 和IS/OS 的結構。同時，與其他組相比，3.5 MPa 組防護組與損傷組視網(wǎng)膜損傷和細胞凋亡程度差異最顯著，推測該強度下防護風鏡發(fā)揮了最大的保護作用，保護機制與防護降低視網(wǎng)膜細胞自噬相關。

關鍵詞： 比格犬；眼部爆震傷；防護風鏡；視網(wǎng)膜；線粒體；自噬

中圖分類號： O389 國標學科代碼： 13035 文獻標志碼： A

21 世紀以來，隨著科技的快速發(fā)展及世界范圍內熱點地區(qū)沖突不斷，爆炸性恐怖襲擊、軍事沖突、工業(yè)事故等所引起的爆震傷事件頻頻發(fā)生，爆震傷對人體健康的威脅日益凸顯。眼球作為身體內最重要、復雜、脆弱的器官之一，極易受到?jīng)_擊波的損傷[1-3]。由于眼球結構的特殊性，多種類型的爆震性損傷均能對其造成傷害，如：初級及三級爆震性損傷可造成眼球破裂，二級爆震性損傷可導致眼部穿通傷或貫通傷，而混合爆震性損傷還可以導致眼部燒傷。美軍對戰(zhàn)場傷亡的數(shù)據(jù)分析顯示，20% 的士兵在伊拉克和阿富汗戰(zhàn)爭中經(jīng)歷了頭面部損傷，其中83.3% 是由爆炸造成的[4-6]。有調查顯示，爆炸沖擊波可以造成眼部結構破壞，直接影響超過半數(shù)執(zhí)勤人員的戰(zhàn)斗能力。既往研究[7-9] 顯示，當沖擊波超壓峰值達到120～210 kPa 時，即可引起小鼠視力顯著下降，甚至失明。近年來，越來越多的研究人員開始關注爆震傷對眼部的影響及其防治策略，如何做好個體防護已成為當前研究的熱點。既往研究[10] 證實，無論是軍事行動中還是日常生活中，90% 的眼爆震傷都可通過正確佩戴個體防護裝備得到有效防護。因此，外軍特別是美軍一直以來都非常重視執(zhí)勤人員眼部防護技術的發(fā)展，陸續(xù)研制并裝備了多款眼部防護產(chǎn)品[11-12]。2017－2018 年間，美軍對現(xiàn)有防護眼鏡（主要是護目鏡和風鏡）進行了優(yōu)化升級，同時對其沖擊波防護效果進行了評估，提示佩戴防護鏡可提高眼部防護能力，有效減少戰(zhàn)斗減員[12-16]。

目前，國際上已有多個團隊進行了眼部爆震傷的研究[17]，但我國對眼爆震傷的損傷機制及其防護的相關研究仍然處于初級階段。既往雖然對視覺系統(tǒng)防護技術進行了一些初步研究，但對基于眼部防護產(chǎn)品的生物體視覺系統(tǒng)致傷機理和防護機制并未進行深入研究。因此，希望通過本研究深入了解爆震傷對眼部視網(wǎng)膜損傷的影響及機制，為防護措施和治療策略的研究提供基礎數(shù)據(jù)和理論支持。本文中，首次建立結合眼部防護設備的動物爆震傷沖擊模型，同時針對爆炸沖擊致生物體視覺系統(tǒng)防護“后效應”開展組織損傷和機能障礙改變研究，從而為防、治爆炸沖擊致視覺系統(tǒng)損傷提供理論依據(jù)，為我國眼部防護及相關設備的研發(fā)與優(yōu)化提供參考。

1 實驗方法

1.1 基于物理模型的防護產(chǎn)品對比測試

分別基于外場實彈實爆環(huán)境和激波管實驗平臺，開展眼部防護裝備沖擊波防護性能測試，具體實驗條件描述如下。

1.1.1 外場實彈實爆環(huán)境

實驗中采用7 kg TNT 裸裝炸藥球，在距離爆炸中心3.8 m 處布放仿真物理頭部模型開展眼部防護裝備考核評測。經(jīng)初步計算[18] 可知，7 kg TNT 當量炸藥爆炸，在3.8 m 半徑距離上，產(chǎn)生的沖擊波超壓峰值約為200 kPa。

1.1.2 激波管實驗環(huán)境

基于中國科學院力學研究所的高溫燃氣激波管，構建超壓峰值為100～300 kPa、持續(xù)作用時間為1～5 ms 的沖擊波作用環(huán)境。

1.1.3 防護產(chǎn)品

本實驗中，護目鏡和風鏡均選用市售個體防護成熟產(chǎn)品，具體外形結構見圖1。頭部測試系統(tǒng)與激波管實驗平臺已在前期工作中進行了詳細介紹[19]，利用玻璃鋼手糊成型、具有中國人體尺寸的頭部模型作為承載平臺，分別在激波管環(huán)境和外場實彈實爆環(huán)境下對眼部防護產(chǎn)品的沖擊波防護性能進行考核并提出合理的現(xiàn)場防護建議措施。

1.2 BST-Ⅰ型生物激波管

采用陸軍特色醫(yī)學中心研制的生物激波管開展沖擊致傷試驗[20]。激波管全長39.0 m，由驅動段、擴張段、過渡段、試驗段、消波段及附屬設備、空氣壓縮機、高壓氣罐等組成，采用雙夾膜結構。驅動段長1.41 m，內徑為0.348 m；擴張段長1.0 m，內徑為0.348～1.000 m；過渡段和試驗段共長24.0 m，消波段長11.0 m，內徑為1.0 m。夾膜采用4 mm × 4 mm 的鋁制膜片。

當激波管驅動段壓力設置為3.5、4.0、4.5 和5.5 MPa 時，在實驗動物所放置位置處，空氣流場的超壓峰值分別約為350、400、450 和550 kPa。

為了深入了解爆震傷對眼部的具體影響，本實驗中首先選用比格犬作為實驗對象，模擬人體環(huán)境，初步明確爆震傷對眼部的具體影響，進而選用小鼠進行機制的研究。所有實驗均經(jīng)過道德倫理測試，倫理審查編號為IACUC – 20241337。

1.3 比格犬及分組

1.3.1 不同沖擊波強度

雄性比格犬10 只。設置激波管驅動段壓力分別為3.5、4.0、4.5 和5.5 MPa 進行爆炸沖擊致傷試驗，其中4.5 MPa 試驗組4 只比格犬，其余每組2 只比格犬。試驗時，試驗犬1 只眼睛佩戴市售風鏡動物實驗版進行防護（定制與試驗犬眼部結構相適配的風鏡外框，配套采用與上述個體防護風鏡產(chǎn)品結構、材料完全一致的鏡片產(chǎn)品）作為防護組，另1 只眼睛呈暴露狀態(tài)作為對照組。3.5、4.0 和5.5 MPa 組爆震傷后3 h 取樣，4.5 MPa 組試驗犬爆炸后分別在3 和6 h 取樣。爆炸時，麻醉比格犬頭部及四肢固定于特質金屬架，固定方向為鼻側朝向激波管驅動端，金屬架置于距離激波管試驗段末端擋板前10 cm 處，末端呈封閉狀態(tài)。共收集10 組眼球標本，隨后進行HE、Tunel 與Nissl 染色，觀察其視網(wǎng)膜各層的結構改變。

1.3.2 4.5 MPa 激波強度

雄性比格犬6 只，設置激波管驅動段壓力為4.5 MPa 開展爆炸沖擊致傷試驗。對每只比格犬左眼進行防護，防護方法與1.3.1 節(jié)中相同，于爆震傷后3 h 取樣。共收集6 組眼球標本，隨后進行HE、Tunel 和Nissl 染色，觀察其視網(wǎng)膜各層的結構改變。

1.4 C57/B6J 小鼠及分組

雄性C57/B6J 小鼠共30 只，將每只C57/B6J 小鼠用1% 戊巴比妥鈉麻醉后單獨放入固定籠位中，小鼠在籠中不能轉身，將固定籠的方向調整為鼻側朝向激波管驅動段，固定籠置于固定架上，并將固定架置于距離激波管試驗段末端擋板前10 cm 處，末端呈封閉狀態(tài)。試驗時，激波管驅動段壓力分別設置為4.5 和3.5 MPa。因小鼠頭部體積過小，無法對其單眼進行有效防護，因此利用驅動段壓力3.5 MPa 作為防護組，4.5 MPa 作為損傷組。共收集30 組眼球標本，進行HE、Tunel 和Nissl 染色，觀察其視網(wǎng)膜各層的結構改變。

1.5 Tunel 染色

Tunel 染色是一種用于檢測細胞凋亡中DNA 片段化的常用技術，用于實現(xiàn)對細胞凋亡的定性和定量分析，其分析指標包括熒光強度和細胞凋亡數(shù)目等。將比格犬和小鼠的眼球石蠟切片在二甲苯中脫蠟5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。無系列乙醇（100%、95%、85%、75%）復水，每梯度3 min。蒸餾水浸泡2 min。滴加20 μg/ml 不含DNase 的蛋白酶K，20～37 ℃ 作用15～30 min。PBS洗滌3 次。根據(jù)試劑盒說明書配制適當量的TUNEL 檢測液（碧云天，C1090），在樣品上加50 μl TUNEL檢測液，37 ℃ 避光孵育60 min。PBS 或HBSS 洗滌3 次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.6 HE 染色

視網(wǎng)膜HE 染色是一種常用的組織學染色技術，用于觀察視網(wǎng)膜組織的形態(tài)結構，其分析指標包括視網(wǎng)膜的層次結構、各層厚度、細胞數(shù)量和排列以及病理變化等。將比格犬和小鼠的眼球石蠟切片在二甲苯中脫蠟5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10min。系列乙醇（100%、95%、85%、75%）復水，每梯度3 min。蒸餾水浸泡2 min。蘇木素染液染色10 min，蒸餾水洗去浮色。分化液分化10～60 s，自來水滴加或浸洗2 次，每次3～5 min。置伊紅染液90 s，傾去多余染色液后快速脫水。脫水，透明，封片后觀察。

1.7 Nissl 染色

Nissl 染色是一種用于顯示細胞內結構的組織學染色技術，其敏感指標包括細胞核染色、陽性細胞數(shù)、尼氏小體的形態(tài)和分布等。將比格犬和小鼠的眼球石蠟切片在二甲苯中脫蠟5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。系列乙醇（100%、95%、85%、75%）復水，每梯度3 min。蒸餾水浸泡2 min。用尼氏染色液（甲苯胺藍法）置于50～60 ℃ 溫箱浸染20～40 min。蒸餾水漂洗切片。95% 乙醇迅速分化。無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固后觀察。

1.8 電鏡

視網(wǎng)膜電鏡檢查多用于觀察視網(wǎng)膜細胞的超微結構，包括自噬溶酶體等各種細胞器、吞噬泡等各類膜性結構等。將比格犬和小鼠的眼球標本在2.5% 的戊二醛溶液中4 ℃ 固定過夜，然后按下列步驟處理樣品：倒掉固定液，用濃度為0.1 M（即0.1 mol/L）、pH=7.0 的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min；用1% 的鋨酸溶液固定樣品1～2 h；倒掉固定液，用濃度為0.1 M、pH=7.0 的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min；用梯度濃度（50%、70%、80%、90% 和95%）的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100% 的乙醇處理一次，每次20 min；最后過渡到純丙酮處理20 min；用包埋劑與丙酮體積比為1∶1 的混合液處理樣品1 h；用包埋劑與丙3 酮體積比為3∶1 的混合液處理樣品3 h；純包埋劑處理樣品過夜；將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70 ℃ 加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert 超薄切片機中切片，獲得厚度為70～90 nm 的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50% 乙醇飽和溶液各染色15 min，即可在透射電鏡中觀察。

1.9 視覺電生理檢查

提前12 h 對大鼠進行暗適應，在標準暗室紅光環(huán)境下，使用法國邁威視覺電生理檢查儀參照ISCEV 國際標準進行視覺電生理檢查。具體操作步驟如下：常規(guī)麻醉（3 mL/MPa 1% 戊巴比妥鈉 +50 μL50% 速眠新）及復方托比卡胺滴眼液散瞳后，將麻醉好的小鼠置于電生理操作臺上固定，滴入1～2 滴鹽酸奧布卡因滴眼液進行眼球表面麻醉，隨后安放電極依次進行視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram， ERG）和視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential， VEP）的檢測。將ERG 作用電極（Ag-Cl 環(huán)狀電極）放于角膜上，參考電極（不銹鋼針狀電極）插入小鼠臉頰皮下，接地電極（不銹鋼針狀電極）插入小鼠尾部皮下。VEP 記錄電極均為不銹鋼針狀電極，作用電極置于兩耳連線中心皮下，參考電極和接地電極位置同ERG 作用電極。ERG 結果分析時選取暗適應3.0 反應b 波幅值、明適應3.0 反應b 波幅值和OPS 反應的O2 波幅值。VEP 結果分析時選取P2 波峰時值和幅值。

1.10 WB 檢測

取新鮮比格犬或小鼠的視網(wǎng)膜組織放于100 mL 裂解液中，置于冰上裂解1 h，取2 μL 用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，按照標準公式計算樣品上樣量。將25 mL 5xloading buffer 加入含有腦組織的裂解液中，100 ℃ 水浴10 min，12 000g 離心15 min，取上清用于檢測。在12% 的分離膠和5% 的濃縮膠中進行蛋白電泳，每孔上樣蛋白總量為30 μg，按恒壓80 和120 V 分別跑濃縮膠和分離膠。恒壓110 V 電轉至PVDF 膜，5% 牛血清白蛋白封閉1 h。一抗根據(jù)試劑商說明書稀釋濃度用1xTBST 進行稀釋后4 ℃ 過夜。對應種屬二抗孵育1 h 后凝膠成像設備曝光。

1.11 數(shù)據(jù)處理

在分子生物學實驗中，每只小鼠進行3 次技術重復實驗，并對數(shù)據(jù)求平均值。每組的3 個平均值用于組間統(tǒng)計比較。

在病理實驗中，每組3 只小鼠的一個切片在免疫熒光激光共聚焦顯微鏡下觀察，從每個切片中隨機選擇3 個視野以定量檢測指標，并對數(shù)據(jù)進行平均。每組得到的3 個平均值用于組間統(tǒng)計比較。

1.12 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析采用Prism 軟件9.0 版。每組的所有值均以平均值±標準差表示。根據(jù)方差的齊性，選擇使用參數(shù)和非參數(shù)檢驗。根據(jù)不同的比較情況，使用Student t 檢驗或單因素方差分析以及Sidak 或Turkey 的多重比較檢驗來分析統(tǒng)計差異。P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果與分析

2.1 基于物理模型的防護產(chǎn)品對比測試結果分析

2.1.1 激波管測試環(huán)境

太陽鏡和風鏡的防護性能測試實驗裝置如圖2 所示，對照組為無眼部防護裝備（裸頭模）。圖3 為了3 種不同防護狀態(tài)下的實驗結果。由圖3（a） 可知，在裸頭模、佩戴太陽鏡和風鏡的測試條件下，噴管出口處傳感器測試3 次試驗所得沖擊波波形基本一致，超壓峰值分別為192、203 和206 kPa。所有數(shù)據(jù)至少重復測量3 次。對比3 種不同狀態(tài)頭模測試結果可知（圖3（b）），佩戴太陽鏡和風鏡可實現(xiàn)對眼部的有效防護，超壓峰值分別由397 kPa 下降至約311 和166 kPa，且風鏡的防護效果更佳。

2.1.2 外場實彈實爆環(huán)境

圖4 為在外場實彈實爆考核測試環(huán)境下，裸頭模、佩戴太陽鏡和風鏡頭模的防護性能測試結果。其中，圖4（a） 為自由場所測超壓-時間（Δp-t）曲線，圖4（b） 為裸頭模、佩戴護目鏡和風鏡頭模所測超壓-時間（Δp-t）曲線。由圖4 可知，佩戴太陽鏡和風鏡可有效保護執(zhí)勤人員眼部免受爆炸沖擊傷害，且風鏡的防護效果明顯優(yōu)于護目鏡。與裸頭模相比，佩戴護目鏡后，頭模眼部爆炸沖擊波超壓峰值下降72.2%，佩戴風鏡后下降約80%，該測試結果與激波管測試結果一致。所有數(shù)據(jù)至少重復測量3 次。因此，結合實際訓練、演訓情況，建議給執(zhí)勤人員隊配發(fā)兼容防紫外、強光、煙霧和防破片功能的風鏡防護產(chǎn)品。

2.2 生物體防護效應分析

本研究中同時選用比格犬和小鼠建立了動物爆炸沖擊波損傷模型。比格犬在生理結構、代謝途徑和遺傳背景等方面與人類更接近；且大動物模型可以模擬爆炸沖擊波損傷的復雜性和多樣性，可更深入地研究疾病的發(fā)病機制、病理變化、疾病進程以及防治措施。為使實驗結果更具有真實性和可靠性，選用小鼠建立爆炸沖擊波損傷模型進行結果驗證。

2.2.1 爆炸沖擊波對比格犬視網(wǎng)膜病理形態(tài)學的影響

為了觀察爆炸沖擊波對比格犬視網(wǎng)膜病理形態(tài)學的影響，本研究中采用了HE 染色法（圖5）。與防護組相比，損傷組的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）和內外核層（inner nuclear layer/outer nuclear layer，INL/ONL）厚度均減?。▓D6）。其中，INL 厚度減小最顯著，提示其可能對沖擊波損傷最敏感。試驗結果同時提示，視網(wǎng)膜損傷程度與沖擊波強度正相關。但值得注意的是，5.5 MPa 組視網(wǎng)膜損傷程度最低，不排除與動物個體差異相關。同時，3.5 MPa 組與其他組相比，防護前后視網(wǎng)膜厚度差異最大，可知該強度下防護發(fā)揮了最大的保護作用。5.5 MPa 組視網(wǎng)膜厚度差異最小，由于實驗犬數(shù)量有限，不除外與實驗動物個體差異性有關，因此進一步選用雄性C57/B6J 小鼠進行了相關實驗的驗證。

HE 結果（圖7）顯示，防護組的RNFL、INL 和ONL 厚度均大于損傷組，說明市售風鏡動物實驗版可有效減輕沖擊波對視網(wǎng)膜的損傷。此外，在4.5 MPa 測試條件下，與沖擊波損傷3 h 相比，6 h 實驗組的INL 和ONL 組織較厚，如圖8（a）～（b） 所示，提示可能在急性損傷后，視網(wǎng)膜有一定程度的恢復。此外，分別計算了3 h 實驗組和6 h 實驗組的INL/ONL 比值（圖8（c）），發(fā)現(xiàn)該比值隨著時間的推移而增大，且損傷組的增大幅度更大。這是由于INL 相對于ONL 具有更快的恢復能力。

為了檢測沖擊波對視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響，采用Tunel 染色法，將凋亡細胞標記為綠色熒光（圖9～10）。由圖9 可以看出，在不同強度的沖擊波損傷后，損傷組的RNFL、INL 和ONL 厚度均低于防護組，說明防護措施有效地保護了視網(wǎng)膜細胞免受凋亡。在各個視網(wǎng)膜層中，發(fā)現(xiàn)光感受器內外節(jié)交界處（inner segment/outer segment，IS/OS）的凋亡信號最強烈，表明光感受器細胞（photoreceptor）可能對沖擊波損傷最敏感靶點，凋亡細胞最多。進一步測量IS/OS 層的厚度（圖11），分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同強度的沖擊波損傷后，損傷組IS/OS 層的厚度小于防護組。這說明沖擊波可能導致了IS/OS 層細胞的凋亡。其中，3.5 MPa 損傷組IS/OS 層與防護組相比，差異最顯著，推測在該強度下視網(wǎng)膜防護措施發(fā)揮了最大的作用。

對4.5 MPa 測試條件下爆炸后不同時間點的防護組和損傷組的IS/OS 厚度（圖10）進行了測量和統(tǒng)計分析，結果（圖12）顯示，該值隨著時間的推移而增大，表明感光細胞整體有一定的恢復能力。相比于損傷組，防護組的IS/OS 值增大更明顯，說明實驗防護措施的保護作用不僅體現(xiàn)在直接降低視網(wǎng)膜的損傷程度，也體現(xiàn)在保護視網(wǎng)膜的修復潛力。

2.2.2 爆炸沖擊波對比格犬視網(wǎng)膜RGCs 的影響

HE 染色結果（圖5 和7）顯示，沖擊波損傷后3 h 與6 h 組RNFL 厚度沒有明顯變化，提示沖擊波會對RNFL 造成的不可逆損傷，可能與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞不可再生的特征相關。使用與通過視乳頭相鄰的切片，以盡量減少視網(wǎng)膜厚度和位置的變化。對每只動物至少有2 個切片的計數(shù)取平均值。每張染色切片自視乳頭起，于50×放大倍數(shù)平均取8 個區(qū)域，定義為單位視野。對單位視野下視網(wǎng)膜中RGC 數(shù)量進行統(tǒng)計，該結果與損傷組單位視野下的RGC 數(shù)量減少相吻合（圖13），說明沖擊波對神經(jīng)節(jié)細胞層及其突觸均造成了一定損傷。同時，也發(fā)現(xiàn)在4.5 MPa 測試條件下，相對3 h 實驗組而言， 6 h 實驗組RGC 的數(shù)量并不會隨著爆炸后時間的延長而恢復，而是呈現(xiàn)穩(wěn)定的狀態(tài)（圖14），與RNFL 厚度的變化趨勢相似。這可能是由于RGC 及其軸突對沖擊波損傷的修復能力較差，或者是其損傷機制與其他細胞不同導致。

通過Tunel 染色法，對不同強度沖擊波損傷后，各組視網(wǎng)膜單位視野下RGC 的凋亡數(shù)量進行了量化（圖15），發(fā)現(xiàn)不同激波強度下，損傷組的RGC 凋亡數(shù)量均顯著大于防護組（P ＜ 0.001），說明防護措施對RGC 層具有較強的保護能力。對4.5 MPa 測試條件下爆炸后不同時間點的防護組和損傷組單位視野下各組RGC 的凋亡數(shù)量進行了量化（圖16），結果顯示，相比于損傷組，防護組RGC 的凋亡數(shù)量隨時間變化更顯著（P = 0.000 3），凋亡細胞數(shù)目逐漸減少趨于正常值，這也表明防護措施不僅可以減弱沖擊波對視網(wǎng)膜細胞的即時損傷，還在一定程度上穩(wěn)定了視網(wǎng)膜細胞的保護和修復能力。還對單位視野下各組凋亡細胞總數(shù)進行了量化（圖17），結果顯示，不同激波強度下，損傷組的細胞凋亡總數(shù)均大于防護組，說明防護措施在整體上對視網(wǎng)膜全層起到了防護作用。

為了進一步檢測沖擊波對RGC 損傷情況的影響，采用了Nissl 染色法，結果如圖18～19 所示，可以發(fā)現(xiàn)：在不同強度的沖擊波損傷后，與損傷組相比，防護組的神經(jīng)節(jié)細胞層（ganglion cell layer， GCL）厚度均大于損傷組，這與之前HE 染色的結果一致。統(tǒng)計了單位視野下視網(wǎng)膜GCL 的陽性細胞數(shù)，結果如圖20 所示，可以看出，不同激波條件下，防護組的陽性細胞數(shù)均少于損傷組。同時，對4.5 MPa 測試條件下爆炸后不同時間點的防護組和損傷組的陽性細胞數(shù)進行統(tǒng)計，結果如圖21 所示，可以看出，損傷組與防護組的陽性細胞數(shù)均隨時間減少趨于正常值（P ＜ 0.05）。這說明防護措施對RGC 具有一定的保護作用。

2.2.3 4.5 MPa 激波下，爆炸沖擊波對比格犬視網(wǎng)膜的影響

為了進一步提升實驗結論的真實性與可靠性，在4.5 MPa 測試條件下開展了后續(xù)實驗。HE 染色結果（圖22）顯示，保護組的INL 厚度與ONL 厚度都明顯大于防護組（圖23，df 為自由度）。對單位視野下視網(wǎng)膜中RGC 數(shù)量進行統(tǒng)計（圖24（a）），損傷組中的RGC 數(shù)目明顯小于防護組。Nissl 染色結果（圖22）顯示，損傷組單位視野下視網(wǎng)膜GCL 的陽性細胞數(shù)大于防護組（圖24（b））。差異均具有統(tǒng)計學意義。Tunel 檢測結果（圖25）顯示，防護組中視網(wǎng)膜的GCL 層凋亡細胞數(shù)量相比較損傷組顯著下降。

2.2.4 爆炸沖擊波對小鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)學的影響

在小鼠沖擊波損傷后第3 天，對防護組和損傷組小鼠視網(wǎng)膜組織進行了相關指標的檢測，檢測結果如圖26 所示。HE 和Nissl 染色結果顯示損傷組小鼠的視網(wǎng)膜中，內網(wǎng)層（inner plexiform layer， IPL）、INL、外網(wǎng)層（outer plexiform layer， OPL）以及ONL 細胞厚度明顯小于防護組，防護組的小鼠總體視網(wǎng)膜厚度大于損傷組，差異具有統(tǒng)計學意義，提示市售風鏡動物實驗版能有效保護視網(wǎng)膜。

2.2.5 爆炸沖擊波對小鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響

Tunel 檢測結果顯示，防護組中視網(wǎng)膜的GCL 層凋亡細胞數(shù)量相比較損傷組顯著下降（P = 0.001 8），如圖27 所示。而視網(wǎng)膜中INL、ONL、IPL、OPL 及色素上皮層（retinal pigment epithelium layer）中的凋亡細胞未觀察到組間差異。該結果可能與RGC 細胞及其軸突不可再生相關，而視網(wǎng)膜其他細胞可能在損傷后存在修復可能。

2.2.6 爆炸沖擊波對小鼠視網(wǎng)膜視覺功能的影響

對小鼠3 d 后的視覺電生理進行了檢查，發(fā)現(xiàn)防護組Ops 中的O2 幅值增加（P = 0.007 4）（圖28），表明防護組的視網(wǎng)膜內層功能狀態(tài)改善；VEP 的潛伏期縮短（P = 0.012 6）（圖29（a）～（b））以及VEP 中的P2 幅值增加（P = 0.024 9）（圖29（c）），表明防護組視覺通路健康狀況改善；與損傷組相比差異具有統(tǒng)計學意義，說明防護組的小鼠視覺功能明顯優(yōu)于損傷組小鼠。

2.2.7 爆炸沖擊波對小鼠視網(wǎng)膜細胞自噬情況的影響

此外，還通過電鏡技術進一步檢測了損傷后視網(wǎng)膜細胞中的自噬情況，發(fā)現(xiàn)與防護組比較，損傷組RGC 中胞漿成分已降解的單層膜自噬溶酶體和有包繞胞漿成分的多層膜吞噬泡數(shù)量明顯增多（圖30），該結構為細胞自噬后形成，其數(shù)量可以用來衡量細胞內自噬現(xiàn)象的程度；自噬相關調節(jié)蛋白SQSTM1/p62（P ＜ 0.000 1）和LC3-Ⅱ （P = 0.843 7）、LC3-Ⅰ （P = 0.003）的表達量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（圖31～32，圖32（b） 中ns 表示不顯著）。SQSTM1/p62 和LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表達量變化反映了細胞自噬活動的狀態(tài)。在自噬活性正常時，SQSTM1/p62 和LC3-Ⅱ的水平會受到調控，不會異常積累。而在自噬過程受阻或增強時，這些蛋白的表達量可能會上升，從而影響細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。提示沖擊波損傷可以造成視網(wǎng)膜細胞自噬，同時與防護組比較，損傷組中小鼠的RGC 自噬現(xiàn)象增強，防護組視功能較好可能與防護后RGC 自噬程度較低相關。

3 討 論

作為重要的單兵防護裝備，軍用眼鏡能有效抵御戰(zhàn)場強光、沙塵、破片等多重威脅，更重要的是，軍用眼鏡作為眼部爆震傷的防護裝置，已經(jīng)在世界范圍內得到了廣泛使用。為了評估防護產(chǎn)品對眼部的防護能力及其防護機制，本實驗中采用陸軍特色醫(yī)學中心研制的BST-Ⅰ型生物激波管，該激波管具有工作效能高、損傷程度可控等優(yōu)勢，可有效制作眼部爆震傷模型[19， 21-23]，同時分別選用比格犬和小鼠作為被試動物，對市售護目鏡和風鏡兩款防護產(chǎn)品進行抗沖擊波防護性能測試，對其防護性能進行對比分析。研究發(fā)現(xiàn)，對于眼部爆震傷的防護，風鏡的防護性能更優(yōu)，其可能通過減少爆震波對眼部的直接沖擊力、緩和壓力波的沖擊，保護眼部免受傷害。

本研究使用的市售風鏡動物實驗版，其特點是能夠全包圍眼部區(qū)域，避免爆炸波從間隙處進入，并且能夠緩沖爆炸波對眼部的沖擊。在本模型中，爆震傷雖然未對眼部外形未造成嚴重傷害，但對視網(wǎng)膜的結構造成了顯著影響，影響了眼部功能。實驗結果顯示，該防護眼鏡能夠顯著降低爆炸波對視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷程度，尤其是對GCL 的保護效果最明顯。同時，隨著沖擊波強度的提高和爆炸后時間的延長，視網(wǎng)膜組織中其他多種細胞及結構均受損，細胞凋亡程度均提高，其中GCL 和IS/OS 受到的損傷最嚴重；而視網(wǎng)膜細胞也出現(xiàn)了較嚴重的自噬現(xiàn)象。此外，相比其他組，在3.5 MPa 測試條件下的損傷組視網(wǎng)膜厚度和細胞凋亡程度差異最顯著，推測該強度下防護風鏡發(fā)揮了最大的保護作用，可能與防護組視網(wǎng)膜細胞自噬減少相關。

推測該防護風鏡可能通過以下機制實現(xiàn)其保護作用：（1） 通過吸收、分散和減少沖擊能量，減少爆炸波對眼部區(qū)域的直接沖擊作用，緩沖爆炸波對眼球表面的沖擊力；（2） 降低爆炸超壓對眼球內部結構的損傷，減輕視網(wǎng)膜各層的損傷；（3） 阻止爆炸波從眼周縫隙處進入眼球內部，避免視網(wǎng)膜缺血、缺氧和繼發(fā)性損傷。這在我們的實驗中可以看出，市售風鏡動物實驗版能有效地減輕沖擊波對視網(wǎng)膜的損傷，保護RGC、RNFL、INL/ONL、GCL 和IS/OS 層結構的完整性和功能。

本實驗結果顯示，沖擊波損傷眼部后，視網(wǎng)膜感光細胞層出現(xiàn)了較明顯的病理改變。我們發(fā)現(xiàn)，當色素上皮完整性喪失、視紫紅質的缺失與錯定位和錐體細胞嚴重受損時，會出現(xiàn)與本實驗類似的Tunel染色結果[24]。根據(jù)以往的研究，光感受器內段含有大量線粒體，視網(wǎng)膜超微結構改變顯示，爆震傷后0.5 h，光感受器細胞的內節(jié)線粒體出現(xiàn)腫脹變性，外節(jié)盤膜也呈現(xiàn)紊亂、稀疏的狀態(tài)。所以可以推測，IS/OS 層檢測到的高熒光強度很可能與線粒體的變化有關。結合本次小鼠實驗，發(fā)現(xiàn)損傷組胞漿成分已降解的單層膜自噬溶酶體和有包繞胞漿成分的多層膜吞噬泡數(shù)量明顯增多；同時自噬相關調節(jié)蛋白SQSTM1/p62 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達量明顯降低。這表明爆炸沖擊波可造成視網(wǎng)膜中以IS/OS 層為主的線粒體自噬現(xiàn)象增強。色素上皮層富含色素于抗氧化劑，具有保護和抗氧化功能。并且色素上皮層中的線粒體氧化應激可導致色素上皮層和視網(wǎng)膜光感受器的代謝功能障礙[25]。所以，可以推測爆炸沖擊波也作用于色素上皮層導致其氧化應激，進而促進IS/OS 層的線粒體自噬現(xiàn)象。

本研究雖然取得了一定成果，但仍有不足之處，需要繼續(xù)在今后的工作中改進。首先，本研究的實驗動物主要是以小型哺乳動物，如鼠類為主，而人類與之在生理結構和反應機制上存在差異。本研究的實驗結果可能無法完全套用到人類身上，因此需要進一步對人類研究進行實證支持。此外，爆震對眼部的損傷程度也會受到實驗環(huán)境、爆炸距離、動物的身體狀況等多種因素的影響。這些因素的變化可能會對實驗結果產(chǎn)生影響。這方面的未盡之處也需要在未來的研究中得到改善和完善。其次，本研究主要關注的是外界壓力對眼球結構的影響，但并未深入研究爆震傷對視功能的影響。另外，本研究主要關注的是爆震創(chuàng)傷及影響，而對于創(chuàng)傷后的康復過程和治療方法并未詳細探討。對于如何提高爆震傷康復的效率，如何降低爆震對眼部的長期影響等問題值得在未來的研究中深入探討。總之，雖然本研究取得了一定的進展，但仍有許多未盡之處需在未來的研究中繼續(xù)深入。因此，今后的工作中需要從更多的角度和指標來系統(tǒng)性評價防護眼鏡對沖擊波的防護作用，并對其進行更全面的優(yōu)化和改進，以提高其防護性能和適應性能，為爆震傷眼部防護和創(chuàng)傷恢復提供更多更準確的科學依據(jù)。

4 結 論

首先，基于頭部動態(tài)測試系統(tǒng)與激波管和外場實彈實爆測試環(huán)境，驗證了護目鏡和風鏡的防護性能。研究表明，風鏡防護沖擊波的性能更優(yōu)，建議給執(zhí)勤人員配發(fā)兼容防紫外、強光、煙霧和防破片功能的風鏡產(chǎn)品，以提高相關人員眼部防護能力。然后，探索了視覺系統(tǒng)組織損傷和機能障礙改變及市售風鏡動物實驗版的防護作用與機制，選用比格犬和C57BL/6J 小鼠開展了相關動物實驗，通過BST-I 型生物激波管制模后，采用病理、視覺電生理檢查等測試方法，探究了沖擊波傷后視網(wǎng)膜病理和功能改變，發(fā)現(xiàn)爆炸后視網(wǎng)膜損傷和細胞凋亡程度均提高，其中GCL 和IS/OS 受到的損傷最嚴重；視網(wǎng)膜細胞自噬現(xiàn)象較重。市售風鏡動物實驗版能夠有效地減輕沖擊波對視網(wǎng)膜的損傷，保護視網(wǎng)膜各層結構的完整性。同時，與其他組相比，3.5 MPa 強度下的實驗組視網(wǎng)膜厚度和細胞凋亡程度差異最顯著，推測該強度下防護眼鏡發(fā)揮了最大的保護作用，可能與在防護作用下RGC 自噬現(xiàn)象降低有關。盡管，目前已經(jīng)取得了一些關于眼部爆震傷損傷機制的重要突破，但仍然需要進一步的研究。隨著技術的發(fā)展，期待未來能夠采用更安全有效的防護設備和治療手段，最終減少爆震傷對人體眼部的危害。

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（責任編輯 張凌云）

基金項目： 陜西省自然科學基礎研究計劃重點項目（2023-JC-ZD-48）；空軍軍醫(yī)大學軍事醫(yī)學提升計劃（2021JSTS14）；西京醫(yī)院醫(yī)務人員培養(yǎng)交叉融合專項（XJZT24JC39）