基于16S rDNA測序分析獨活寄生湯對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠腸道菌群的影響

〔摘要〕 目的 通過16S rDNA測序探討?yīng)毣罴纳鷾―uhuo Jisheng Decoction， DHJSD）在調(diào)控腸道菌群以治療膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA）中的潛在機(jī)制。方法 選取18只SD大鼠，隨機(jī)分為模型組（關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50 μL濃度為40 mg/mL的碘乙酸鈉）、空白組（灌胃等量生理鹽水）以及DHJSD組（造模方法與模型組相同，灌胃獨活寄生湯16.5 g/kg），每組6只。造模2周后開始干預(yù)，每天灌胃1次，持續(xù)4周，并觀察其一般情況。給藥結(jié)束后進(jìn)行取材，通過HE染色觀察軟骨變化。ELISA法檢測血清白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）炎癥因子水平。RT-qPCR檢測滑膜中核因子κB p65（nuclear factor-κB p65， NF-κB p65）、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin， mTOR）、AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）的相對表達(dá)量。取腸道糞便進(jìn)行16S rDNA測序分析腸道微生物群的差異。結(jié)果 相比空白組，模型組大鼠的活動減少，毛發(fā)失去光澤，攝食量和飲水量減少。相比模型組，DHJSD組大鼠的活動性、毛發(fā)光澤和飲食均明顯改善。HE染色結(jié)果表明，DHJSD能有效改善軟骨損傷，減輕纖維化和炎癥反應(yīng)。ELISA結(jié)果表明，相比空白組，模型組的IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α水平升高（Plt;0.01）。相比模型組，DHJSD組IL-1β、TNF-α水平降低（Plt;0.01）。RT-qPCR結(jié)果表明，相比空白組，模型組NF-κB p65、mTOR和AMPK的相對表達(dá)量升高（Plt;0.05）。相比模型組，DHJSD組mTOR的相對表達(dá)量降低（Plt;0.05）。16S rDNA測序結(jié)果表明，DHJSD可以調(diào)控KOA大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，并影響菌群的α和β多樣性。乳球菌屬（Lactococcus）和腸桿菌屬（Enterorhabdus）分別是DHJSD組和模型組中富集最顯著的菌群。結(jié)論 DHJSD能有效修復(fù)軟骨損傷，減緩KOA的進(jìn)展，其機(jī)制可能與調(diào)控腸道菌群、維護(hù)腸道屏障完整性以及減少免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 膝骨關(guān)節(jié)炎;16S rDNA測序;腸道菌群;獨活寄生湯;菌群多樣性;菌群相對豐度

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.020

Effects of Duhuo Jisheng Decoction on intestinal flora of rats with knee osteoarthritis based on 16S rDNA sequencing

LU Yifan1，2，3， XU Wuji2， XIONG Hui3， QI Xinyu3， WU Boyu4， JIAN Gonghui3，"YANG Zhuo1*， DUAN Jianhui1*

1. Changde First Hospital of Traditional Chinese Medicine， Changde， Hunan 415000， China; 2. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China; 3. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. Dongguan Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Dongguan， Guangdong 523000， China

〔Abstract〕 Objective To explore the potential mechanism of Duhuo Jisheng Decoction （DHJSD） in regulating intestinal flora for the treatment of knee osteoarthritis （KOA） through 16S rDNA sequencing. Methods Eighteen SD rats were randomized into model group （intra-articularly injected with 50 μL of sodium iodoacetate at a concentration of 40 mg/mL）， blank group （gavaged with an equal volume of normal saline）， and DHJSD group （modeled using the same method as the model group and gavaged with DHJSD at a dose of 16.5 g/kg）， with six rats in each group. Intervention began two weeks after modeling， with once-daily gavage for four weeks， during which the rat general condition was observed. After the administration period， samples were collected. Cartilage changes were observed using HE staining. ELISA was used to measure serum levels of inflammatory factors including interleukin （IL）-1β， IL-6， IL-17， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）. RT-qPCR was employed to determine the relative expression levels of nuclear factor-κB p65 （NF-κB p65）， mechanistic target of rapamycin （mTOR）， AMP-activated protein kinase （AMPK）， and phospha?tidylinositol 3-kinase （PI3K） in the synovium. Fecal samples were collected for 16S rDNA sequencing to analyze differences in the intestinal flora. Results Compared with the blank group， rats in the model group exhibited decreased activity， lusterless fur， and reduced food and water intake. In contrast， the DHJSD group showed significant improvements in activity， fur luster， and food intake compared to the model group. The HE staining indicated that DHJSD effectively reduced cartilage damage， fibrosis， and inflammatory responses. The ELISA showed that， compared with the blank group， the levels of IL-1β， IL-6， IL-17， and TNF-α in the model group were significantly higher （Plt;0.01）. However， compared with the model group， the levels of IL-1β and TNF-α in the DHJSD group were significantly lower （Plt;0.01）. The RT-qPCR indicated that， compared with the blank group， the relative expression levels of NF-κB p65， mTOR， and AMPK significantly increased in the model group （Plt;0.05）. Compared with the model group， the relative expression level of mTOR in the DHJSD group significantly decreased （Plt;0.05）. The 16S rDNA sequencing showed that DHJSD regulated the intestinal microbiota structure in KOA rats， and affected both α and β diversity of the microbiota. Lactococcus and Enterorhabdus were the most significantly enriched genera in the DHJSD and model groups， respectively. Conclusion DHJSD can effectively repair cartilage damage and slow down the progression of KOA. Its mechanism may be related to regulating intestinal flora， maintaining intestinal barrier integrity， and reducing immune-inflammatory responses.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; 16s rDNA sequencing; intestinal flora; Duhuo Jisheng Decoction; microbial diversity; relative abundance of microbiota

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA）是一種常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨的逐漸磨損、骨質(zhì)增生和關(guān)節(jié)功能的退化，導(dǎo)致疼痛、僵硬和活動受限[1-2]。KOA的發(fā)病機(jī)制主要包括軟骨退變、炎癥反應(yīng)、骨質(zhì)變化和機(jī)械負(fù)荷等，其中關(guān)節(jié)軟骨的退變和磨損是其核心病理改變，骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解是導(dǎo)致軟骨損傷的主要原因[3-4]。由于人口老齡化和肥胖癥的流行，KOA的患病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢[5]。目前，針對KOA主要以抗炎、止痛和手術(shù)治療為主[6]。然而這些方法的臨床效果有限，且可能伴有較高的副作用風(fēng)險。中醫(yī)學(xué)治療KOA以整體調(diào)理為主，注重標(biāo)本兼治，具有獨特的優(yōu)勢，在改善癥狀和提高患者生活質(zhì)量方面顯示出良好的潛力[7]。

獨活寄生湯（Duhuo Jisheng Decoction， DHJSD）是一種傳統(tǒng)中藥方劑，臨床上對KOA治療效果顯著[8]。其現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制涉及多種成分和多靶點的協(xié)同作用?，F(xiàn)代研究表明，DHJSD具有抗炎、止痛、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、促進(jìn)血液循環(huán)和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理學(xué)效應(yīng)[9-10]。DHJSD通過抑制軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和分化，保護(hù)軟骨和骨組織，從而延緩軟骨退變，維持關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)，減緩疾病進(jìn)展[11]。然而，其具體機(jī)制尚未完全明確。

腸道菌群失調(diào)可以通過各種機(jī)制影響KOA的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展，包括炎癥和免疫調(diào)節(jié)[12]。腸道菌群中某些有益菌能夠促進(jìn)抗炎性免疫細(xì)胞的生成，減少炎癥介質(zhì)的釋放[13]。而腸道菌群失調(diào)則可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失衡，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的釋放，從而加重KOA的病情[14]。因此，本研究旨在通過16S rDNA測序探討DHJSD在調(diào)控腸道菌群以治療KOA中的潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1" 動物

健康2月齡SPF級雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量為250～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心，環(huán)境條件控制為恒溫（21±3） ℃、相對濕度50%±10%，并保持良好通風(fēng)。大鼠自由飲食，食用普通飼料，光照和黑暗周期各為12 h。本實驗嚴(yán)格遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物倫理委員會的規(guī)定（批準(zhǔn)號：LLBH-202207190001）。

1.2nbsp; 藥物

本研究中使用的DHJSD購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。獨活15 g、桑寄生15 g、白芍10 g、黨參15 g、川芎6 g、當(dāng)歸15 g、牛膝10 g、防風(fēng)10 g、甘草6 g（批號：92240205、92230921、92240156、92240836、92240528、92240802、92240407、92240945、92231239）購自湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司;杜仲10 g、秦艽10 g、肉桂6 g （批號：AB442472、AB450782、A2041902）購自廣東一方制藥有限公司;茯苓15 g、熟地黃15 g、細(xì)辛3 g （批號：C240636、C240397、C240397）購自湖南天地恒一制藥有限公司。

將上述藥材混合后加水煎煮兩次，每次1 h，第1次加水量為藥材重量的10倍，第2次為8倍。煎煮后的藥液用紗布過濾，收集2次藥液。將過濾后的藥液在50 ℃水浴中減壓濃縮至1 g/mL原藥材的濃縮液，分裝于無菌瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3" 主要試劑和儀器

HE染液、分化液、返藍(lán)液（Servicebio公司，批號：G1005、G1005-3、G1005-4）;RNA提取試劑、microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA標(biāo)志物Marker、qPCR試劑盒（Vazyme公司，批號：R401-01、R233-01、MD101-02、Q712-02）;核酸染料（Biotium公司，批號：41003）。PCR梯度擴(kuò)增儀（Scilogex公司，型號：SCI1000-G）;微量分光光度計（美國GE醫(yī)療公司，型號：GE NanoVue Plus）;高速組織研磨儀（Jingxin公司，型號：JXFSTPRP-48）;臺式冷凍離心機(jī)、掌上離心機(jī)（Scilogex公司，型號：CF1524R、S1010E）;旋渦混合器（Servicebio公司，型號：MV-100）;4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱（XINGX公司，型號：BC-1480Y、BC-628GE）;酶標(biāo)儀（Rayto公司，型號：RT-6100，450 nm波長）;微量高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，型號：TG16W）;臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號：TGL16M）。

1.4" 建模、分組和干預(yù)

采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉的方法[15]構(gòu)建KOA大鼠模型。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，固定后在無菌條件下，將2 mg碘乙酸鈉溶于50 μL無菌生理鹽水中（濃度為40 mg/mL），并緩慢注射到右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)?？瞻捉M大鼠注射等體積的無菌生理鹽水。消毒后，將大鼠放回籠內(nèi)飼養(yǎng)2周，自由進(jìn)食和活動，并觀察其關(guān)節(jié)狀態(tài)和活動情況。造模后第1天大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹，滑膜充血水腫，右側(cè)患肢承重下降，提示造模成功[16]。

將18只大鼠編號，并按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、DHJSD組，每組6只，每籠3只?？瞻捉M予以右膝關(guān)節(jié)腔注射50 μL無菌生理鹽水，其余兩組進(jìn)行造模。DHJSD組大鼠的服藥量依據(jù)人-鼠等效劑量[17]換算[大鼠劑量（mg/kg）=6.17×人劑量（mg/kg）]，按每只大鼠體質(zhì)量給予DHJSD 16.5 g/（kg·d）。造模2周后開始干預(yù)，每天灌胃1次，持續(xù)4周。DHJSD組每天以16.5g/（kg·d）的劑量給予DHJSD藥液3 mL灌胃，空白組和模型組則以等量生理鹽水灌胃。

1.5" 取材方法

在干預(yù)4周后，對各組大鼠進(jìn)行頸椎脫位處死處理。常規(guī)消毒雙膝術(shù)區(qū)皮膚后，切開皮膚并暴露關(guān)節(jié)囊，完整切下脛骨平臺軟骨。剔除軟骨表面的脂肪和肌肉組織，使用生理鹽水沖洗干凈。部分軟骨用于HE染色，其余軟骨經(jīng)過處理后立即放入-80 ℃冰箱保存，以備后續(xù)檢測。

1.6" 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1" 一般情況觀察" 各組大鼠的整體生存狀況評估包括以下幾個方面：大鼠的活動水平、毛發(fā)的光澤度以及飲食情況等。

1.6.2" 大鼠軟骨組織病理變化" 取下大鼠右后膝關(guān)節(jié)，用生理鹽水沖洗并去除軟組織后，固定于4%多聚甲醛24 h，10% EDTA脫鈣3周。脫水、透明、石蠟包埋后，切片并進(jìn)行HE染色，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)病理變化。

1.6.3" ELISA檢測" 采用ELISA法測定IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的水平，具體操作步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.4" RT-qPCR檢測" 采用RT-qPCR檢測滑膜中核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）、AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的相對表達(dá)量。使用Trizol法提取滑膜組織總RNA，并測定OD值。配制逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增等反應(yīng)體系，利用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，并通過內(nèi)參基因計算相對表達(dá)量，最終以2-ΔΔCt值進(jìn)行計算。引物序列詳見表1。

1.6.5" 腸道菌群16S rDNA測序分析" 取新鮮大鼠糞便后，提取DNA并進(jìn)行16S rDNA高通量測序。使用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rDNA的V3～V4區(qū)域。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化和質(zhì)量檢測后，通過Illumina Miseq平臺進(jìn)行測序。

1.7" 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，使用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)以“x±s”表示，兩組間比較符合正態(tài)分布者使用兩獨立樣本t檢驗，不符合則使用秩和檢驗。3組或3組以上組間比較，符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布則采用Kruskal-Wallis檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 一般情況

空白組大鼠活動正常，毛發(fā)光滑有光澤，攝食量和飲水量均正常。模型組大鼠的活動減少，毛發(fā)失去光澤，攝食量和飲水量減少。與模型組相比，DHJSD組大鼠的活動增加，行為狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)恢復(fù)光澤，攝食量和飲水量恢復(fù)正常，食欲增加。

2.2" 組織病理學(xué)觀察

空白組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)基本正常，軟骨層厚度均勻，表面平滑，表層、中間層、深層及鈣化層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞無壞死變性，小梁間連接呈網(wǎng)狀，骨髓腔較小，骨髓細(xì)胞豐富，個別小梁輕微破碎。模型組出現(xiàn)重度異常的組織結(jié)構(gòu)，軟骨組織大量壞死和纖維化，軟骨細(xì)胞大量變性和壞死，骨髓腔內(nèi)可見大量異型細(xì)胞，表明KOA模型成功建立。與模型組相比，DHJSD組軟骨組織結(jié)構(gòu)顯著改善，軟骨層厚度均勻，表面平滑，軟骨細(xì)胞無明顯壞死變性，纖維化程度減輕，異型細(xì)胞數(shù)量減少。詳見圖1。

2.3" DHJSD對KOA大鼠血清炎癥因子的影響

與空白組比較，模型組的IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α水平升高（Plt;0.01）;與模型組比較，DHJSD組IL-1β、TNF-α水平降低（Plt;0.01）。詳見表2。

2.4" DHJSD對KOA大鼠滑膜組織NF-κB p65、mTOR、AMPK和PI3K表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組NF-κB p65、mTOR和AMPK的表達(dá)量升高（Plt;0.05）;與模型組比較，DHJSD組mTOR的表達(dá)量降低（Plt;0.05）。詳見表3。

2.5" 腸道菌群分析

2.5.1" 各組大鼠腸道菌群在α多樣性上的變化" 送檢的18個大鼠糞便樣本檢測均合格，可用于16S rDNA高通量測序。α多樣性分析稀釋曲線平緩，表明數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，樣品可做進(jìn)一步分析。如表4所示，與空白組相比，模型組和DHJSD組大鼠的Observed_otus和Chao1指數(shù)均增加，表明這兩組大鼠腸道菌群的物種豐富度較高。模型組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)高于空白組，表明模型組的菌群多樣性增加。DHJSD組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)低于模型組，表明其菌群多樣性較低。模型組的Pielou_e指數(shù)高于空白組和DHJSD組，表明其菌群均勻度高。

2.5.2" 各組大鼠腸道菌群在β多樣性上的變化" NMDS分析的stress值為0.06，表明該模型擬合度較好（stresslt;0.2），NMDS有一定的解釋意義。結(jié)果表明，3組之間的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。DHJSD組的微生物群落結(jié)構(gòu)與空白組和模型組明顯不同，表明DHJSD對微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著的調(diào)節(jié)作用。NMDS和PCoA的結(jié)果一致，均顯示DHJSD組的β多樣性顯著增加。詳見圖2。

2.5.3" 各組大鼠腸道菌群在門、屬水平物種相對豐度上的變化" 在門水平上，各組大鼠中的擬桿菌門（Bacteroidota）為占比較多的菌門。與空白組相比，模型組中的彎曲菌門（Campylobacterota）顯著上升（Plt;0.01）。與模型組相比，DHJSD組中的擬桿菌門顯著下降（Plt;0.01），彎曲菌門顯著下降（Plt;0.05）。在屬水平上，與空白組相比，模型組中擬桿菌屬（Bacteroides）和腸桿菌屬（Enterorhabdus）顯著上升（Plt;0.05）。與模型組相比，DHJSD組中的擬桿菌屬、腸桿菌屬顯著下降（Plt;0.01）。詳見圖3。

2.5.4" 各組大鼠腸道菌群在屬水平指示物種上的變化" 篩選出在不同組別中顯著富集的微生物物種，可認(rèn)為這些物種能作為各組檢測的潛在指示物種。指示值分析結(jié)果顯示，在屬水平上，空白組、模型組、DHJSD組中顯著富集的微生物物種分別為大腸桿菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、腸桿菌屬和乳球菌屬（Lactococcus）。詳見圖4。

2.5.5" 各組大鼠腸道菌群在細(xì)菌表型上的變化" 細(xì)菌表型分析結(jié)果表明，不同實驗組間兼性厭氧菌、生物膜形成菌、潛在致病菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌、厭氧菌、含活性元件菌和革蘭氏陽性菌的相對豐度無顯著差異。詳見圖5。

3 討論

KOA歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，常見的病因包括風(fēng)寒濕邪侵襲、氣血不足等。DHJSD是一種經(jīng)典的中藥方劑，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，廣泛用于治療KOA。本研究探討DHJSD對KOA大鼠的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DHJSD能改善KOA大鼠的一般情況（如活躍性、毛發(fā)光澤度及飲食情況），并可有效改善軟骨損傷，減輕纖維化和炎癥反應(yīng);DHJSD可降低KOA大鼠的IL-1β、TNF-α水平，降低mTOR相對表達(dá)量;DHJSD通過調(diào)控腸道菌群多樣性和物種組成發(fā)揮作用，提示腸道菌群的調(diào)節(jié)是其干預(yù)KOA的重要機(jī)制。

中醫(yī)藥對腸道菌群領(lǐng)域的探討逐漸增加，其對慢性心力衰竭、血管性癡呆、慢性疲勞綜合征和孤獨癥等有顯著的調(diào)節(jié)作用[18-21]。過往研究同樣發(fā)現(xiàn)，中藥對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。吳霜等[22]的研究顯示，當(dāng)歸捻痛湯可以顯著回調(diào)KOA模型中升高的放線菌門和擬桿菌屬的豐度比例。易南星等[23]的研究表明，加味DHJSD在治療KOA大鼠時，能提高變形菌門的豐度，同時減少擬桿菌門和擬桿菌屬的比例。本研究的結(jié)果與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，進(jìn)一步體現(xiàn)了中藥在調(diào)節(jié)腸道菌群方面的潛力。在本研究中α、β多樣性分析結(jié)果提示，DHJSD可能通過增加物種豐富度和多樣性而影響更多的靶點，從而發(fā)揮其治療效果，但其中的潛在機(jī)制尚不清楚。

在本研究中，DHJSD組表現(xiàn)出最高的物種豐富度，但其菌群多樣性和均勻度稍低于模型組，表明DHJSD通過選擇性增加某些關(guān)鍵菌群的豐度而發(fā)揮作用。具體而言，DHJSD可能通過降低擬桿菌門的豐度，間接減少炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，緩解KOA的癥狀[24]。而擬桿菌門豐度的降低還可以改善腸道屏障功能，減少腸道滲透性，防止有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，從而減少全身炎癥反應(yīng)[25]。此外，副擬桿菌屬（Parabacteroides）在維生素D缺乏的KOA患者中占主導(dǎo)地位，提示其豐度的增加可能對KOA的進(jìn)展產(chǎn)生影響。這表明DHJSD可能通過調(diào)控擬桿菌門的豐度，間接改善維生素D缺乏的狀態(tài)，從而對KOA的進(jìn)展產(chǎn)生影響[26]。而本研究RT-qPCR結(jié)果顯示，DHJSD可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成，間接影響mTOR信號通路，從而發(fā)揮其治療作用。mTOR信號通路與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，下調(diào)mTOR可減少氧化應(yīng)激，保護(hù)關(guān)節(jié)細(xì)胞免受氧化損傷[27]。

在本研究中，DHJSD還顯著降低了彎曲菌門物種豐度。彎曲菌門通過降低上皮鈉粒子通道的依賴性鈉轉(zhuǎn)運(yùn)和下調(diào)緊密連接蛋白-8的表達(dá)，可導(dǎo)致鈉吸收功能障礙和腸道屏障功能損害[28]。提示DHJSD可能通過抑制彎曲菌門的生長改善腸道屏障，減少有害物質(zhì)通過腸壁進(jìn)入血液，從而促進(jìn) KOA的恢復(fù)。

此外，在屬水平方面，DHJSD顯著降低了腸桿菌屬物種豐度，該菌屬在模型組中富集最顯著。同時指示物種分析結(jié)果顯示，乳球菌屬在DHJSD組中富集最顯著，該菌屬的益生菌作用已被廣泛研究，其可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)、減少炎癥和促進(jìn)腸道健康[29]。本研究結(jié)果表明，DHJSD可以通過提高乳球菌屬物種豐度減少全身炎癥和增強(qiáng)整體代謝健康，從而對KOA等疾病產(chǎn)生有益影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DHJSD能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、改善腸道屏障功能以及影響炎癥和代謝通路，可能為KOA的治療提供一種有效的中藥方案。這些發(fā)現(xiàn)不僅拓展了中藥治療KOA的理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究其潛在機(jī)制提供了參考方向。

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〔基金項目〕湖南省自然科學(xué)基金項目（2022JJ30087，2024JJ6342）;湖南省教育廳資助科研項目（21B0377，23B0343）;湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（D2022033，C2023031）;常德市技術(shù)研發(fā)和技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)項目（CDKJJ20220357）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級科研課題（2022XYLH045，2022XYLH051）。

〔通信作者〕*楊" 卓，男，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：735517624@qq.com;段建輝，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：djh0905@sina.com。