?花生根瘤菌的分離鑒定及對(duì)重金屬的抗性研究?

摘要：為篩選對(duì)多種重金屬具有較強(qiáng)抗性的根瘤菌，通過從重金屬污染農(nóng)田采集的花生根瘤中分離純化，得到34株根瘤菌，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析并構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，以及對(duì)重金屬（Cu2+、Ni2+、Cr6+、Zn2+）的抗性分析。結(jié)果顯示，34株根瘤菌中有33株屬于根瘤菌屬（Rhizobium），1株屬于中華根瘤菌屬（Ensifer）；對(duì)Cu2+具有較強(qiáng)抗性的菌株為HG6、HG13、HM13、HM23、HM52，對(duì)Ni2+具有較強(qiáng)抗性的菌株為HM13、HW23、HW45，對(duì)Cr6+具有較強(qiáng)抗性的菌株為HM14、HM21、HM23、HW2，對(duì)Zn2+的抗性較強(qiáng)的菌株為HG6、HM1、HM52、HW20；HG13對(duì)4種重金屬均具有較好抗性。

關(guān)鍵詞：花生；根瘤菌；重金屬；抗性

中圖分類號(hào)：S565.2; Q939.11+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）10-0017-06

Peanut Rhizobia： Isolation， Identification， and Characterization of Resistance to Heavy Metals

SONG Dan-ping1，WU Hang-yu2，WANG Ya-ting1，DU Yan-ling1，HU Ji3，CHEN Jing-lin4，

YU Xiu-mei4，ZHANG Yu-ting3，CUI Yong-liang2

（1. Chengdu Academy of Environmental Sciences， Chengdu 610072， PRC; 2. Sichuan Provincial Academy of Natural Resources Science， Chengdu 610015， PRC; 3. Chengdu Branch of Sichuan Provincial Academy of Natural Resources Science， Chengdu 610213， PRC; 4. College of Resources， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， PRC）

Abstract： To screen out the rhizobia with strong resistance to heavy metals， we isolated 34 strains of rhizobia from peanut nodules in the heavy metal-contaminated farmland. A phylogenetic tree was built for these strains based on the 16S rRNA gene sequences. Furthermore， the resistance of these strains to heavy metals （Cu2+， Ni2+， Cr6+， and Zn2+） was evaluated. The results showed that 33 out of the 34 strains belonged to Rhizobium and 1 strain belonged to Ensifer. Strains HG6， HG13， HM13， HM23， and HM52 demonstrated strong resistance to Cu2+. Strains HM13， HW23， and HW45 showed strong resistance to Ni2+. Strains HM14， HM21， HM23， and HW2 had strong resistance to Cr6+. Strains HG6， HM1， HM52， and HW20 showcased strong resistance to Zn2+. Strain HG13 had strong resistance to all the four heavy metals.

Key words： peanut; rhizobia; heavy metal; resistance

土地污染影響植物生長，最終可能對(duì)人類健康造成威脅[1]，且對(duì)土壤的組成、結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響[2]。農(nóng)田重金屬污染對(duì)土壤質(zhì)量、作物生長發(fā)育、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)以及人類健康造成不同程度的影響[3]，每年因重金屬污染而導(dǎo)致的糧食損失達(dá)到1 200萬t，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前，土壤重金屬污染的修復(fù)主要通過利用物理學(xué)（客土、換土、深耕翻土，等）、化學(xué)（添加改良劑）、生物學(xué)（植物、動(dòng)物、微生物）等方面的技術(shù)降低或除去環(huán)境中的重金屬污染物[5]，其中，生物學(xué)修復(fù)是一種沒有二次污染風(fēng)險(xiǎn)的修復(fù)方法[6]。

土壤重金屬污染的地方，土壤貧瘠是除重金屬脅迫外影響植物生長的最大障礙[7]，通過利用微生物與植物的共生關(guān)系，可幫助植物吸收土壤養(yǎng)分，促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)植物對(duì)土壤重金屬的富集作用[8]，

大大提高了土壤重金屬污染的凈化效率，具有很高的利用和研究價(jià)值。利用植物與微生物特殊的生態(tài)系統(tǒng)地位[9]，使用“豆科植物-根瘤菌”共生體系修復(fù)土壤重金屬污染是近年來土壤修復(fù)領(lǐng)域關(guān)注熱點(diǎn)之一[10-11]。張志權(quán)等[12]發(fā)現(xiàn)尾礦上的銀合歡根瘤菌的共生體系在吸收土壤中的重金屬Pb時(shí)具有明顯優(yōu)越性，80%的重金屬Pb都積累在銀合歡的根系和莖里；樊妙春[13]通過在鉛鋅礦上種植刺槐對(duì)當(dāng)?shù)刂亟饘傥廴就寥肋M(jìn)行修復(fù)，發(fā)現(xiàn)刺槐根系存在的根瘤菌對(duì)Cu、Zn和Cd有抗性，有利于刺槐對(duì)重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)；宋修勇[14]發(fā)現(xiàn)，天藍(lán)苜蓿同時(shí)接種根瘤菌和促生菌時(shí)，生物量顯著提高，促進(jìn)其對(duì)Cu和Zn的吸收。李蕾等[15]通過研究篩選出了對(duì)Pb、Cr具有較強(qiáng)抗性的花生品種濰花八號(hào)；葛一陳[16]發(fā)現(xiàn)花生的根莖葉對(duì)Cd有較強(qiáng)的富集能力，且花生粕餅中的重金屬含量能通過萃取降到國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)以下。但目前對(duì)花生根瘤菌的重金屬抗性研究較少，花生根瘤菌在重金屬污染土壤修復(fù)方面的應(yīng)用潛力有待發(fā)掘。

本研究通過從重金屬污染土壤中的花生根瘤中分離純化出花生根瘤菌，研究重金屬污染農(nóng)田土壤中花生根瘤菌的多樣性，測定花生根瘤菌的重金屬抗性，篩選出具有重金屬抗性的花生根瘤菌，為實(shí)現(xiàn)重金屬污染農(nóng)田土壤修復(fù)提供可利用的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 重金屬標(biāo)準(zhǔn)液 稱取CuCl2·2H2O 5.37 g，

NiSO4·6H2O 8.96 g，K2Cr2O7 5.66 g，ZnSO4·7 H2O

8.85 g。將上述藥品分別溶解在200 mL蒸餾水中，得到Cu2+、Ni2+、Cr6+、Zn2+含量分別為10 000 mg/L的重金屬標(biāo)準(zhǔn)液。

1.1.2 YMA培養(yǎng)基 甘露醇1.0 g/L，酵母粉1.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，pH值7.0～7.2，121～126 ℃濕熱滅菌30 min[17]。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，恒溫震蕩搖床，酒精燈，離心機(jī)，分光光度計(jì)，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，接種環(huán)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生根瘤的采集 2021年8月在位于廣漢、綿竹、溫江的典型重金屬污染農(nóng)田（土壤Cd背景值為0.35 mg/L以上）種植的花生中以五點(diǎn)取樣法采集圓潤飽滿的花生根瘤，共采集17個(gè)樣點(diǎn)，將采集的根瘤密封在無菌自封袋中，回到實(shí)驗(yàn)室分離花生根瘤菌。

1.2.2 花生根瘤菌的分離與純化 （1）在收集到的花生根瘤中挑選出大小合適且圓潤飽滿的根瘤，用清水洗去根瘤表面泥土后浸入95%的酒精，用無菌水沖洗5次。

（2）將表面滅菌后的根瘤放入離心管，用玻璃棒將根瘤搗碎，將同一采樣點(diǎn)的樣品混合，接種環(huán)沾取汁液用平板劃線法接種在含有剛果紅的YMA平板培養(yǎng)基上，在28 ℃下倒置培養(yǎng)1 d，將上述操作得到的菌種重復(fù)接種培養(yǎng)3～5次，得到形態(tài)單一的菌落。

（3）用接種環(huán)將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到鏡片上，用《微生物分類學(xué)》[18]中對(duì)細(xì)菌的鑒定方法對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，觀察并記錄，將從廣漢樣點(diǎn)采集的根瘤中分離得到的根瘤菌種編為HG序號(hào)，綿竹的編為HM序號(hào)，溫江的編為HW序號(hào)。將純化完成的形態(tài)單一的菌種保種于YMA斜面培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后冷藏；同時(shí)接種到液體YMA培養(yǎng)基中獲得新鮮的菌懸液，將0.9 mL菌懸液與0.9 mL60%的甘油混勻冷凍保存。

1.2.3 花生根瘤菌的分子鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析 （1）根瘤菌DNA提取。將根瘤菌菌株接種于YMA液體培養(yǎng)基中，放于28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)得到菌懸液；在4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min得到菌體；用500 μL 1xTE緩沖液洗滌3次；加入800 μL GUTC緩沖液，混勻后室溫靜置30 min，加入50～60 μL硅藻土，混勻后室溫吸附15 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清液；再加入500 μL GUTC緩沖液，混勻，室溫放置10 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入500 μL1xTE緩沖液洗滌，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，重復(fù)3次；再用600 μL 70%乙醇洗滌一次，12 000 r/min離心1 min，棄上清液；最后用600 μL 70%乙醇洗滌一次，12 000 r/min離心1 min，棄上清液；在37 ℃下真空干燥沉淀物讓乙醇揮發(fā)完全；用超純水懸浮沉淀物，并于55～60 ℃下保溫10 min，離心提取上清液，放置-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

（2）16S rRNA基因的檢測和分析。以總DNA為模板擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR擴(kuò)增引物是27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。在95 ℃下預(yù)變性5 min，溫度不變?cè)僮冃? min，溫度降至56 ℃退火30 s，72 ℃下延伸1 min，循環(huán)30次，最后在72 ℃下延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送往生工生物工程（成都）有限公司測序，基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)相似性分析，并用MEGA7.0鄰接法構(gòu)建16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定花生根瘤菌的進(jìn)化地位。

1.2.4 根瘤菌的重金屬抗性測定 配置相同的YMA液體培養(yǎng)基，在5 mL培養(yǎng)基試管中分別加入不同濃度梯度直到菌株死亡的Cr6+、Cu2+、Ni2+、Zn2+重金屬溶液，其中Cu2+、Ni2+濃度梯度設(shè)置為從0 mg/L開始以10 mg/L為梯度遞增，Cr6+濃度梯度設(shè)置成從0 mg/L開始以4 mg/L為梯度遞增，Zn2+濃度梯度設(shè)置為從0 mg/L開始以20 mg/L為梯度遞增；將篩選的菌株液以1∶100的比例接種到培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)2 d后用分光光度計(jì)測定OD600，與加重金屬但不加菌的培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照，以此確定菌株的生長狀況（OD600≥0.1視為可生長），分析獲得重金屬對(duì)菌株的最低抑制濃度（菌株生長受到明顯抑制時(shí)的最低重金屬濃度）和最低致死濃度（導(dǎo)致菌株死亡時(shí)的最低重金屬濃度），并根據(jù)結(jié)果篩選出對(duì)重金屬抗性較強(qiáng)的優(yōu)勢菌株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理采用Excel office 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異的分析，用軟件?MEGA作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生根瘤菌的分離純化

從17個(gè)樣點(diǎn)采集的根瘤中共獲得34個(gè)根瘤菌菌株，其中來自廣漢的有9個(gè)菌株（HG1～HG9）、綿竹12個(gè)菌株（HM1～HM12）、溫江13個(gè)菌株（HW1～HW13）。分離得到菌株經(jīng)培養(yǎng)所形成的菌落均為乳白色不透明圓形，邊緣整齊，微微有凸起，表面濕潤有光澤，為革蘭氏陰性菌，桿狀且無芽孢。

2.2 花生根瘤菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)分離純化所得34株初步判斷為根瘤菌的菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果顯示，其中33個(gè)菌株靠近根瘤菌屬（Rhizobium），1個(gè)菌株（HG16）靠近中華根瘤菌屬（Ensifer），均屬于根瘤菌目根瘤菌科。

2.3 花生根瘤菌對(duì)重金屬的抗性分析

2.3.1 花生根瘤菌種對(duì)Cu2+的抗性分析 由表1可知，Cu2+對(duì)不同菌株的最低抑制濃度在10 mg/L到40 mg/L之間，其中10 mg/L的根瘤菌菌株有17個(gè)、20 mg/L的7個(gè)、30 mg/L的8個(gè)、HG13和HM23為40 mg/L；最低致死濃度在30～60 mg/L，其中30 mg/L的有3個(gè)菌株，40～50 mg/L的菌株有27個(gè)，HM13、HW21、HW22、HW47為60 mg/L。結(jié)果表明，對(duì)Cu2+具有較強(qiáng)抗性（MIC≥30 mg/L，MLC≥50 mg/L）的根瘤菌菌株有HG6、HG13、HM13、HM23、HM52。

2.3.2 花生根瘤菌對(duì)Ni2+的抗性分析 表2顯示，Ni2+對(duì)絕大多數(shù)菌株的最低致死濃度處于30 ～50 mg/L之間，HM13、HW15、HW23、HW42、HW45對(duì)Ni2+抗性相對(duì)較高，達(dá)到60 mg/L；最低抑制濃度處于10 ～20 mg/L之間，其中64.7%的菌株最低抑制濃度為20 mg/L，而HM41的最低抑制濃度即為其最低致死濃度。結(jié)果表明，對(duì)Ni2+具有較強(qiáng)抗性（MIC=20 mg/L，MLC=60 mg/L）的菌株為HM13、HW23和HW45

2.3.3 花生根瘤菌對(duì)Cr6+的抗性分析 由表3可知，HM14在Cr6+濃度達(dá)到16 mg/L時(shí)受到明顯抑制作用，其余33個(gè)菌株的最低抑制濃度均處于4～8 mg/L之間，其中有20個(gè)菌株的最低抑制濃度為4 mg/L，占總數(shù)的59%；HG16、HW23的最低致死濃度為16 mg/L，HG20、HM1、HM21、HM23、HW2為28 mg/L，其余的27個(gè)菌株處于20～24 mg/L之間。結(jié)果表明，對(duì)Cr6+具有較強(qiáng)抗性（MIC≥16 mg/L，MLC≥24 mg/L；或MIC≥8 mg/L，MLC≥24 mg/L）的菌種有HM14、HM21、HM23和HW2。

2.3.4 花生根瘤菌對(duì)Zn2+的抗性分析 由表4可知，Zn2+對(duì)34個(gè)根瘤菌菌株的最低抑制濃度存在較大差異，HG15、HG16、HM2、HM14、HM23、HM26、HM28在100 mg/L及以下，HM52、HW20為900 mg/L，其余25種在110 ～600 mg/L之間；53.0%根瘤菌菌株在Zn2+脅迫下的最低致死濃度在100～1000 mg/L之間，HM14、HM26小于100 mg/L，其中HM14的最低致死濃度等于其最低抑制濃度；14個(gè)菌株的最低致死濃度大于1000 mg/L，HG5達(dá)到1600 mg/L。

結(jié)果顯示，對(duì)Zn2+的抗性較強(qiáng)（MIC≥600 mg/L、MLC≥1400mg/L）的根瘤菌為HG6、HM1、HM52和HW20。

2.3.5 對(duì)4種重金屬均具有較好抗性的菌株篩選 綜合34個(gè)菌株對(duì)4種重金屬抗性結(jié)果，HG13對(duì)4種重金屬都具有較好抗性。根據(jù)HG13在各種重金屬脅迫下的OD600值做出OD600隨重金屬濃度變化曲線如圖2所示，在Cu2+濃度為0～30 mg/L時(shí)，OD600變化幅度較小，菌株生長較為良好，在40 mg/L時(shí)生長受到抑制，在50 mg/L時(shí)到達(dá)最低致死濃度；在Ni2+脅迫下的菌株生長曲線總體下降趨勢明顯，當(dāng)Ni2+濃度到達(dá)20 mg/L時(shí)OD600數(shù)值快速降低，此時(shí)為HG13在Ni2+脅迫下的最低抑制濃度，當(dāng)Ni2+濃度為50 mg/L時(shí)HG13才無法生長，說明HG13具有較高的最低致死濃度；跟大部分根瘤菌相同，HG13在Cr6+濃度為4 mg/L時(shí)生長便遭受明顯抑制，但HG13最低致死濃度最高，達(dá)到24 mg/L，4 mg/L到20 mg/L之間OD600下降較為平緩，菌株具有較好的生長狀況和較高的對(duì)Cr6+的抗性；從曲線可以看出，HG13對(duì)Zn2+具有較強(qiáng)的抗性，OD600在Zn2+濃度到達(dá)300 mg/L和700 mg/L時(shí)分別有一次明顯的下降，其余濃度均變化較為平滑，在1 500 mg/L時(shí)達(dá)到最低致死濃度，這表明HG13在較為廣泛的Zn污染值范圍內(nèi)都能保持較好的生長。

3 討論

試驗(yàn)選用Cu2+、Cr6+、Ni2+、Zn2+4種重金屬離子對(duì)從重金屬污染土壤中分離得到的34個(gè)花生根瘤菌菌株進(jìn)行重金屬抗性試驗(yàn)，得到不同重金屬濃度下根瘤菌生長情況的相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，根瘤菌對(duì)Zn2+的抗性在4種重金屬中是最強(qiáng)的，與梁建強(qiáng)等[19]

所做的重金屬脅迫下根瘤菌存活率的試驗(yàn)結(jié)果一致；通過設(shè)置34個(gè)根瘤菌菌株對(duì)4種重金屬的抗性進(jìn)行試驗(yàn)，得到了每個(gè)菌株在不同重金屬脅迫下的最低抑制濃度和最低死亡濃度數(shù)據(jù)，篩選出對(duì)4種重金屬都存在較好抗性的菌株HG13。說明HG13更易在遭受多種重金屬污染的土壤中與花生根系形成共生體，更有利于多種重金屬污染土壤的修復(fù)工作[20]。同時(shí)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些根瘤菌在部分重金屬的高濃度環(huán)境下反而比低濃度環(huán)境中生長更加旺盛，可能是在特定的濃度下，部分重金屬對(duì)這些根瘤菌的生長有促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

從重金屬污染農(nóng)田中分離純化得到34個(gè)花生根瘤菌菌株，研究結(jié)果表明花生根瘤菌主要為Rhizobium和Ensifer。通過重金屬（Cu2+、Ni2+、Cr6+、

Zn2+）抗性試驗(yàn)，篩選出對(duì)重金屬具有較強(qiáng)抗性的菌株：對(duì)Cu2+具有較強(qiáng)抗性的菌株為HG6、HG13、HM13、HM23、HM52；對(duì)Ni2+具有較強(qiáng)抗性的菌株為HM13、HW23、HW45；對(duì)Cr6+具有較強(qiáng)抗性的菌株有HM14、HM21、HM23和HW2；對(duì)Zn2+的抗性較強(qiáng)的菌株為HG6、HM1、HM52、HW20；HG13對(duì)4種重金屬均具有較強(qiáng)的抗性，為最優(yōu)抗性菌株。

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