?模擬胃液環(huán)境下谷維素清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺的作用?

摘要：為降低人體內(nèi)亞硝胺類化合物含量，采用模擬胃液結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用的方法研究谷維素清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺的作用。結(jié)果表明：在模擬胃液條件下，谷維素能有效清除亞硝酸鈉，且亞硝酸鈉的清除率與谷維素液添加量呈正相關(guān)關(guān)系；在膳食樣品中添加谷維素能有效降低N-亞硝基-N-乙基苯胺、N-亞硝基二乙基胺、N-亞硝基吡咯烷的含量，其阻斷率分別為100%、100%和24.4%。谷維素在模擬胃液條件下能通過降低亞硝酸鈉含量減少內(nèi)源性亞硝胺合成的反應(yīng)底物，從而阻斷亞硝胺的合成。

關(guān)鍵詞：谷維素；亞硝胺；亞硝酸鈉；模擬胃液；液質(zhì)聯(lián)用

中圖分類號：TS 201.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）10-0087-05

Oryzanol Clears Sodium Nitrite and Blocks the Synthesis of Nitrosamine in

Simulated Gastric Fluid

YU Feng-xiang1，CHEN Xu2，CHEN Zu-wu2，ZENG Si-jing3

（1. Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic， Changsha 410127， PRC; 2. Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 3. Longhui Market Supervision and Management Inspection and Testing Center， Shaoyang 422299， PRC）

Abstract： To reduce the content of nitrosamines in the human body， this study employed liquid chromatography-mass spectrometry to explore the performance of oryzanol in clearing sodium nitrite and blocking the synthesis of nitrosamine in simulated gastric fluid. The results showed that in simulated gastric fluid， oryzanol cleared sodium nitrite， and the removal rate was in a positive correlation with the oryzanol addition amount. Adding oryzanol in the diet reduced the content of N-nitroso-N-ethylaniline， N-nitroso-diethylamine， and N-nitroso-pyrrolidine， with the blocking rates of 100%， 100%， and 24.4%， respectively. In simulated gastric fluid， oryzanol can reduce the substrate of endogenous nitrosamine synthesis by reducing the content of sodium nitrite， thus blocking the synthesis of nitrosamine.

Key words： oryzanol; nitrosamine; sodium nitrite; simulated gastric fluid; liquid chromatography-mass spectrometry

亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)廣泛存在于食物中，這些物質(zhì)攝入人體后，在胃液的作用下容易產(chǎn)生致癌的亞硝基化合物——亞硝胺[1-2]。亞硝胺是一種強(qiáng)烈的化學(xué)致癌物質(zhì)，長期攝入含有高濃度亞硝胺的食品可能會增加胃癌、食道癌等的患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，大部分國家和地區(qū)除了對亞硝胺類化合物本身進(jìn)行管控外，還對亞硝胺可生成物有限量要求。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、“在導(dǎo)致內(nèi)源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽”等列為2A類致癌物；我國GB2762—2022標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定肉及肉制品、水產(chǎn)動物及其制品中N-二甲基亞硝胺（NDMA）限量分別為不超過3、4 μg/kg；美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定肉制品中總揮發(fā)性亞硝胺限量為10 μg/kg[3]；俄羅斯國家規(guī)定生食品和煙熏食品中N-亞硝胺含量不得超過2、4 μg/kg[4]。

減少NO2-及NO3-的攝入是減少內(nèi)源性亞硝胺形成的關(guān)鍵一步。

目前，主要通過控制食品加工條件、加入抗氧化物質(zhì)（維生素C[5]、維生素E[6]、花色苷[7]、生姜抗氧化物[8]、大黃[9]等）等方法阻斷亞硝胺的合成。為簡化樣品處理流程，解決亞硝胺類物質(zhì)因熱穩(wěn)定性差而不易檢測的難題，學(xué)術(shù)界普遍采用液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用改良法、液質(zhì)聯(lián)用等方法對其進(jìn)行分析檢測，但都存在檢測時(shí)間長、過程繁瑣等問題，具有較大的優(yōu)化空間[10-11]。

γ-谷維素具有清除自由基、抗氧化、降血脂、降血糖、抑制癌細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)中樞及心臟自主神經(jīng)等功能，但其對亞硝胺的阻斷效果及機(jī)理研究尚未見報(bào)道。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在蔬菜腌制時(shí)加入谷維素，會降低產(chǎn)品亞硝酸鈉含量[12]。筆者通過模擬胃液環(huán)境結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，研究谷維素清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺的效果，為人體內(nèi)源性亞硝胺合成的阻斷技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要試劑材料有亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）、乙酸鋅溶液（220 g/L）、飽和硼砂溶液（50 g/L）、氨緩沖溶液（pH值9.6～9.7）、20%鹽酸、對氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）、95%食用酒精、醋酸、甲醇（色譜純）、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5 μg/mL）、粉狀活性炭。亞硝酸納標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，優(yōu)級純，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；谷維素（≥99.9%，瑞威爾生物科技有限公司）；模擬胃液（pH值1.5±0.1，廣州臻萃質(zhì)檢技術(shù)服務(wù)有限公司）；亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品包括N-亞硝基二甲基胺（NDMA）、N-亞硝基二乙基胺（NDEA）、N-亞硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亞硝基哌啶（NPIP）、N-亞硝基-N-甲基苯胺（NMPhA）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亞硝基二苯基胺（NDPhA）、N-亞硝基二丙基胺（NDPA）、N-亞硝基二丁基胺（NDBA）、N-亞硝基吡咯烷（NPYR）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）和N-亞硝基二芐胺（NDBzA），均購自美國O2si公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 Infinity II-6470液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MSMS，安捷倫科技有限公司），ZORBAX SB-CN液相色譜柱（21 mm×100 mm，1.8 μm；安捷倫科技有限公司），UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)[翱藝儀器（上海）有限公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 谷維素液的制備 為使谷維素更好地溶解于胃液體系，后續(xù)應(yīng)用于食品加工，需將其配制成穩(wěn)定的溶液。谷維素不溶于水，以52%普通食用白酒、75%乙醇、無水酒精、食用油、醋酸、食醋、95%食用酒精（玉米酒精）進(jìn)行試驗(yàn)，研究制備谷維素液的最適配方。

1.3.2 亞硝胺的液質(zhì)聯(lián)用檢測 （1）對照品溶液配制：精密量取12種亞硝胺混標(biāo)（均為100 mg/mL）0.25 mL于25 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋，并定容至25mL，搖勻即配得濃度均為1 mg/mL的溶液。（2）加標(biāo)供試品溶液配制：稱取樣品1.00±0.05 g于玻璃比色管中，加入12種亞硝胺0.2 mL，加入2 mL甲醇，渦旋30 s，靜置2 min，取上層溶液，過濾膜上機(jī)測試。（3）上機(jī)條件：柱溫40℃，進(jìn)樣量5 μL，流速0.4 mL/min，流動相A為含0.1%甲醇和5 mmol/L乙酸銨的水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫條件如表1所示。

1.3.3 谷維素對亞硝酸鈉的清除率檢測 于25 mL比色管中加入模擬胃液10 mL，分別加入谷維素液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，再加入5

μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)液2 mL，37℃水浴120 min取出，

加入0.4%對氨基苯磺酸2 mL，混勻，靜置5 min后，各加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液1.0 mL，靜置15 min，加水至刻度混勻。用0.45 μm濾膜過濾，在538 nm下測定吸光度Ai?？瞻渍{(diào)零：以去離子水代替谷維素液和亞硝酸鈉標(biāo)液。不加谷維素液的樣品吸光度記為A0；對照為不加亞硝酸標(biāo)準(zhǔn)液的樣品，以扣除谷維素自身可能帶來的吸光度誤差，對照吸光度記為A0i。根據(jù)公式（1）計(jì)算亞硝酸鈉清除率（R）。

（1）

1.3.4 谷維素對膳食亞硝胺的阻斷率檢測 參考中國居民膳食寶塔及《中國居民膳食指南》，按表2設(shè)計(jì)食譜。稱取200 g經(jīng)料理機(jī)均質(zhì)后的混合物，添加200 mL模擬胃液，試驗(yàn)組添加0.02%谷維素，混勻。把混合物放在震蕩保溫箱里，37℃保溫2 h；準(zhǔn)確稱取1.00±0.05 g樣品于玻璃比色管中，加入2 mL甲醇，渦旋30 s，靜置2 min，上層溶液用濾膜過濾，再用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測亞硝胺物質(zhì)種類和含量。根據(jù)公式（2）計(jì)算阻斷率（C）。

（2）

式中：ρ0為不加谷維素液的樣品中亞硝胺的質(zhì)量濃度（ng/mL），ρi為加入谷維素的樣品中亞硝胺的質(zhì)量濃度（ng/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Matlab 2014、SPSS 17.0和Excel 2010軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷維素液的制備結(jié)果

常溫下，谷維素在52%普通食用白酒、75%乙醇、無水酒精、食用油、醋酸、食醋、95%食用酒精（玉米酒精）中的溶解度極??；加熱后，可溶于無水酒精、食用油、醋酸、95%食用酒精。若濃度過高，溶解后加入其他試劑或泡菜液中，會析出白色絮狀物質(zhì)。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，取0.5 g谷維素，加入95%食用酒精15 mL溶解，加入85 mL沸水繼續(xù)煮沸，冷卻定容至100 mL。該方法制備的谷維素液可形成穩(wěn)定的米湯狀液體，離心不沉淀，存放1個月狀態(tài)良好，且滿足食品加工要求。

2.2 模擬胃液條件下谷維素對亞硝酸鈉的清除率

由圖1可知，整體而言，亞硝酸鈉的清除率隨著谷維素液添加量增加而提高，說明谷維素在模擬胃液條件下能有效清除亞硝酸鈉，減少內(nèi)源性亞硝胺合成的底物。

2.3 模擬胃液條件下谷維素對膳食亞硝胺合成的阻斷率

2.3.1 膳食中亞硝胺種類 由表3可知，膳食中亞硝胺物質(zhì)主要有NEPhA、NDMA、NMEA、NDEA、NDBA、NPYR，亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖2所示，樣品離子流如圖3所示，MRM定量離子圖如圖4所示。GB 2762—2022標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定N-亞硝基二甲基胺（NDMA）在肉及制品、水產(chǎn)動物及其制品中的限量分別為3.0、4.0 μg/kg，參考這一數(shù)值，推測膳食樣品N-亞硝基吡咯烷（NPYR）含量存在安全風(fēng)險(xiǎn)。

2.3.2 谷維素對膳食亞硝胺的阻斷率 由表4可知，添加谷維素主要影響了膳食中NEPhA、NDEA、NPYR的含量。NEPhA、NDEA在空白對照樣品中的含量分別為1.6 ng/g和0.2 ng/g，而添加谷維素的樣品中未檢出該種亞硝胺，阻斷率為100%；空白對照樣品中的NPYR含量為8.6 ng/g，試驗(yàn)組中NPYR含量為6.5 ng/g，阻斷率為24.4%。添加谷維素對NDMA、NMEA、NDBA的阻斷效果不明顯，其原因有待進(jìn)一步分析。

3 結(jié)論

在模擬胃液條件下，谷維素能有效清除食品中的亞硝酸鈉，且亞硝酸鈉的清除率與谷維素液添加量呈正相關(guān)關(guān)系。此外，谷維素在模擬胃液條件下通過降低亞硝酸鈉含量減少內(nèi)源性亞硝胺合成的反應(yīng)底物，阻斷了亞硝胺合成，在膳食中添加谷維素能有效降低膳食中NEPhA、NDEA、NPYR的含量，其亞硝胺阻斷率分別為100%、100%和24.4%。

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（責(zé)任編輯：王婷）