48份小麥品種(系)抗條銹病和條銹病基因的分子標(biāo)記檢測(cè)及其抗性評(píng)價(jià)

摘要：為明確寧夏小麥品種（系）對(duì)小麥條銹病和赤霉病的抗病水平，采用與已知抗病基因緊密連鎖的特異性標(biāo)記法對(duì)48份小麥材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，并對(duì)供試小麥品種（系）進(jìn)行系譜分析。通過對(duì)抗條銹病和抗赤霉病典型代表基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr30和Fhb1進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其在寧夏小麥中的分布頻率進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在48份參試品種（系）中，分別含有Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr30抗性基因的小麥材料有41、15、5、16、20、45、26份，占供試材料的85％、31％、1％、33％、41％、93％、54％；在所測(cè)的小麥品系中有42份供試材料攜帶Fhb1基因，占供試材料的87％。本研究，通過選用中國(guó)寧夏48份典型小麥品種（系）進(jìn)行抗條銹病和赤霉病的分子標(biāo)記檢測(cè)，為作物育種和遺傳研究提供有效遺傳信息。

關(guān)鍵詞：小麥；條銹病；分子標(biāo)記；基因檢測(cè)；種質(zhì)資源；抗性評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S435.121.4⁺2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）18-0154-06

收稿日期：2023-10-31

基金項(xiàng)目：華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才項(xiàng)目（編號(hào)：NCCIR2021RC-6）。

作者簡(jiǎn)介：刁文達(dá)（1999—），男，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，從事玉米、小麥抗病性研究。E-mail：d16632233175@163.com。

通信作者：亢 玲，從事小麥抗病性研究，E-mail：kangling1005@163.com；閆曉翠，講師，主要從事玉米、小麥抗病遺傳育種，E-mail：yxc1234jy@163.com。

小麥（Triticum aestivum L.）是我國(guó)重要的糧食作物，對(duì)我國(guó)糧食的供給作出了重大貢獻(xiàn)^［1］。而小麥條銹病是世界上影響范圍zsx+9fWw+SUeXo6v7PRE8RA8MXn+BRvdZJ3QSgZwCrI=較大的小麥病害之一，也是寧夏小麥產(chǎn)區(qū)主要病害之一，每年都會(huì)對(duì)寧夏小麥的產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失，因此對(duì)寧夏小麥產(chǎn)區(qū)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，并為小麥抗病育種提供一些參考價(jià)值。小麥條銹病是一種由小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tririci）引起的氣傳性真菌類病害，它的變異類型較多，分布范圍較廣，可降低感病品種的籽粒數(shù)量和品質(zhì)，進(jìn)而使產(chǎn)量減少40%^［2-4］。小麥條銹病病原體可在種植季節(jié)的大部分生長(zhǎng)階段都感染小麥植株，主要是降低小麥的光合效率，進(jìn)而導(dǎo)致植物有機(jī)物的合成減少。此外，赤霉病隨氣候的變化也對(duì)小麥的產(chǎn)量造成了嚴(yán)重影響。至目前為止，小麥赤霉病常發(fā)區(qū)已擴(kuò)展到我國(guó)黃淮海南部麥區(qū)，且西北麥區(qū)也已日益加重，該病害已成為我國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)常發(fā)性的重大小麥病害。已有研究人員發(fā)現(xiàn)，來源于望水白的Fhb1是目前抗性最高且應(yīng)用廣泛的抗赤霉病基因。利用已知分子標(biāo)記對(duì)抗赤霉病基因Fhb1進(jìn)行快速檢測(cè)，從而篩選出獲得小麥抗赤霉病的種質(zhì)資源，為小麥抗赤霉病育種選擇提供依據(jù)，但當(dāng)前抗病資源匱乏、抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄是我國(guó)小麥在抗病育種中面臨的主要問題^［5-6］。要解決以上問題，必須發(fā)掘新的抗病種質(zhì)，挖掘新的抗病基因，才能豐富其遺傳多樣性^［7］。然而，噴施農(nóng)藥對(duì)小麥條銹病和赤霉病進(jìn)行防治，盡管能夠達(dá)到一定的控制效果，但它的成本昂貴，而且還會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成影響，而使用抗銹品種是減少各種作物病害損害的最經(jīng)濟(jì)和有效的方法^［8-9］。

自20世紀(jì)50年代條銹病廣泛流行以來，我國(guó)對(duì)該病的流行和管理進(jìn)行了廣泛的研究。小麥的病害防治對(duì)于小麥的產(chǎn)量來說至關(guān)重要，迄今，在國(guó)際上以Yr系統(tǒng)正式命名的主效抗條銹病基因共有84個(gè)位點(diǎn)，即Yr1～Yr84^［10-11］；其中大多數(shù)在小麥的所有生長(zhǎng)階段對(duì)葉銹病都有效，在苗期很容易被識(shí)別，這被稱為全生育期抗性（all stage resistance，簡(jiǎn)稱ASR），這種類型的抗性通常由1個(gè)在幼苗期開始表達(dá)的單一基因控制（幼苗抗性）。然而，一些Lr基因通常在成株期階段表達(dá)，這種類型的抗性被稱為成株植物抗性（adult plant resistance，簡(jiǎn)稱APR），進(jìn)一步分為小種?；禺愋院头切》N?；禺愋?種類型^［12-13］。由于小麥的抗病基因?qū)ζ贩N小種的?；院軓?qiáng)，在生產(chǎn)上使用的抗病基因很容易隨著毒力的頻繁變化而失去抗性^［14-16］。由于小麥可以在不同的地理和氣候條件下種植，銹病病原體在不同的環(huán)境條件下也展現(xiàn)了增強(qiáng)的適應(yīng)能力。如果氣候條件適合銹病，并在大面積內(nèi)種植單一抗性小麥品種，這些品種便可以產(chǎn)生抗性。

本研究利用分子標(biāo)記檢測(cè)和系譜分析方法對(duì)48份供試材料進(jìn)行抗病基因篩選，其目的是通過分子標(biāo)記診斷和家系分析來鑒定小麥品種（系）和改良種質(zhì)的抗性。了解這些小麥品種（系）的抗性，挖掘新的抗性種質(zhì)資源，對(duì)我國(guó)小麥抗銹性育種的篩選具有重要價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

48份供試寧夏小麥材料（表1）（感條銹病的對(duì)照品種Avocet S、感赤霉病對(duì)照品種Tatara以及含有已知抗赤霉病基因的品種Yr27），由寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所提供。已知條銹病抗性基因陽性對(duì)照材料包括Yr5（T.spelta Album）、Avocet S^*6/Yr9、Avocet S^*6/Yr10/6、Avocet S^*6/Yr15/6、Avocet S^*6/Yr18、Avocet S^*6/Yr26、Yr30（Opata85）、Avocet S；鄭州5389作為陰性對(duì)照材料；赤霉病以Tatara品種為陽性對(duì)照、鄭州5389為陰性對(duì)照。條銹病和赤霉病分子標(biāo)記檢測(cè)于2022—2023年間在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)華北作物種質(zhì)資源研究與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 小麥基因組DNA的提取與分子檢測(cè)

將供試小麥材料種植于育苗盤內(nèi)，以營(yíng)養(yǎng)土和蛭石3∶1的比例進(jìn)行種植，播種20～25粒/盆飽滿的種子，覆土，在底部澆水，使其吸收并直至土壤濕潤(rùn)移出，放到22～25 ℃室內(nèi)培養(yǎng)6～8 d，待用。待幼苗長(zhǎng)到3葉期時(shí)用CTAB法提取基因組DNA^［17］，然后進(jìn)行Yr基因檢測(cè)，用于檢測(cè)分子標(biāo)記引物，該引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成（表2）。

1.3 PCR擴(kuò)增

選取國(guó)際上主效抗條銹病基因Yr5^［18］、Yr9^［19］、Yr10^［20］、Yr15^［21］、Yr18^［22］、Yr26^［23］、Yr30^［24］以及抗赤霉病基因Fhb1^［25］共8個(gè)緊密連鎖分子標(biāo)記，對(duì)所供試的48份小麥材料進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μL；10 μmol/L上游特異引物 0.5 μL，終濃度為0.1～0.3 μmol/L；10 μmol/L下游特異引物0.5 μL，終濃度為0.1～0.3 μmol/L；模板DNA 2 μL；補(bǔ)水至20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 15 s，退火55～62 ℃ 15 s，延伸 72 ℃ 15 s，35次循環(huán)；延伸72 ℃ 5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 已知抗條銹病基因分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

48份供試材料是來自于寧夏小麥主產(chǎn)區(qū)，所有供試材料可能攜帶的基因均列在表3。以感病材料Acocet S為陽性對(duì)照，對(duì)其供試材料的抗條銹病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr30已知標(biāo)記檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示：以Avocet S為陽性對(duì)照，在寧春32號(hào)、寧春33號(hào)和寧春35號(hào)等41份材料中，均可以擴(kuò)增出100 bp的目的條帶，表明這些材料中可能含有Yr5這個(gè)基因；Avocet S^*6/Yr9為陽性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在15份小麥材料可以擴(kuò)增出1 500 bp的抗條銹病基因Yr9目的條帶（圖1），說明這些供試材料中均攜帶有Yr9；寧春33號(hào)、34號(hào)、35號(hào)、36號(hào)和寧春39號(hào)5份材料中鑒定出含有Yr10，且目的條帶為543 bp的條帶；以Avocet S^*6/Yr15為陽性對(duì)照，在寧春32號(hào)、隴春7號(hào)和春山4號(hào)等16份供試材料中，可以擴(kuò)增出與Yr15緊密連鎖的目的條帶190 bp，表明在這些材料中均攜帶有Yr15抗病基因；用Avocet S*6/Yr18為陽性對(duì)照，在寧春32號(hào)、33號(hào)和寧春44號(hào)等20份小麥材料中，均可以擴(kuò)增出150 bp的Yr18目的條帶（圖2），這表明這21份供試小麥材料中含有Yr18抗病基因；同理，以AvocetS*6/Yr26為陽性對(duì)照，在春山1號(hào)、索諾拉64和隴春7號(hào)等45份材料，均攜帶有抗條銹病基因Yr26（圖3）；索諾拉64、隴春7號(hào)和寧春44號(hào)等26份材料，均含有抗條銹病基因Yr30（圖4）。此外，分別對(duì)這8個(gè)已知廣譜抗條銹病基因在所有供試小麥材料中進(jìn)行占比分析，結(jié)果表明：其攜帶有抗條銹病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr30，分別占供試材料的85％、31％、1％、33％、41％、93％、54％。

2.2 抗赤霉病基因Fhb1的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

對(duì)48份供試小麥品種（系）進(jìn)一步利用抗赤霉病基因Fhb1的特異功能連鎖SSR標(biāo)記Xbarc147進(jìn)行檢測(cè)，且以Tatara（攜帶Fhb1）為陽性對(duì)照；結(jié)果表明（圖5），48份供試小麥材料中可成功擴(kuò)增出與Fhb1目的條帶（122 bp）相一致的材料有42份（如寧春34號(hào)、35號(hào)和寧春44號(hào)等），且占比達(dá)到87％。這表明在寧夏小麥材料中普遍攜帶有抗赤霉病基因，且對(duì)赤霉病有一定的抗性，為抗赤霉病遺傳育種的研究提供良好的供試材料。

3 討論

分子標(biāo)記為基因檢測(cè)提供了一種更有效和更經(jīng)濟(jì)的方法^［26］。本研究使用已知抗病基因緊密連鎖標(biāo)記來檢測(cè)8個(gè)已知抗病基因在48份寧夏小麥種質(zhì)資源上的分布情況。結(jié)果顯示，在同一供試材料中可能均攜帶有2個(gè)以上抗病基因存在，其寧春38號(hào)中攜帶有抗條銹病基因Yr5和Yr15，該品種由永T2945與永1265（Veer后代）雜交，經(jīng)寧夏永寧縣

小麥育繁所育成，其具有良好的抗條銹病。至今，在國(guó)內(nèi)外Yr5和Yr15仍然是少有的幾乎對(duì)所有條銹病菌表現(xiàn)出廣譜抗性^［27-28］，且普遍應(yīng)用于西北（四川）和西南（寧夏）麥區(qū)的小麥育種中。Bastian材料中攜帶有抗葉銹病基因Lr26和抗赤霉病基因Fhb1，表明Bastian對(duì)葉銹病和赤霉病具有良好的抗性。寧春40號(hào)品種同時(shí)攜帶Yr5、Yr15、Yr26、Fhb1，該品種是寧夏大學(xué)以中寧58912和永1712進(jìn)行雜交，采用雜交系譜法選育優(yōu)良單株，系統(tǒng)選育而成，高抗銹病。

目前我國(guó)在小麥21條染色體上已經(jīng)定位超過250個(gè)抗性位點(diǎn)^［29-30］，其中Fhb1是世界上公認(rèn)的主效基因，這個(gè)基因已經(jīng)被克隆，這為利用該基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇提供了便利。本研究通過對(duì)48個(gè)供試小麥材料的遺傳分析，結(jié)果表明，這些標(biāo)記物穩(wěn)定，可用于基因檢測(cè)。在所有攜帶有抗條銹病基因分Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26和Yr30中，Yr26占比最大，說明Yr26作為抗銹病源仍廣泛用于生產(chǎn)品種中。但我們應(yīng)合理利用不同類型的抗性基因，發(fā)掘優(yōu)良抗源，為小麥抗病育種及病害精準(zhǔn)防控提供參考。

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