長(zhǎng)期化肥減量配施秸稈對(duì)水稻土壤微生物多樣性和功能的影響

摘要：為探究長(zhǎng)期化肥減量配施秸稈對(duì)水稻土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能的影響，以東北黑土為試驗(yàn)對(duì)象，基于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)期水稻秸稈還田和化肥減施平臺(tái)，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)化肥不同施加量［N1（173 kg/hm²）、N2（133 kg/hm²）、N3（93 kg/hm²）、N4（53 kg/hm²）、N5（0 kg/hm²）］配施水稻秸稈（所有處理秸稈還田量均為7 500 kg/hm²）土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，不同化肥施加量配施水稻秸稈顯著改變了土壤全氮、全磷和速效鉀的含量。秸稈還田下化肥施加量處理對(duì)土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)影響顯著，但對(duì)土壤真菌α多樣性指數(shù)并未產(chǎn)生顯著影響。主坐標(biāo)結(jié)果表明，秸稈還田下化肥施加量處理可對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是相對(duì)豐度最高的3個(gè)細(xì)菌門(mén)。擔(dān)子菌門(mén)、子囊菌門(mén)和壺菌門(mén)是相對(duì)豐度最高的3個(gè)真菌門(mén)?；贔APROTAX分析土壤細(xì)菌的功能，所有處理中土壤細(xì)菌的主要功能是chemoheterotrophy（20.71%）>aerobic_chemoheterotrophy（11.37%）>nitrification（7.54%）?；贔unGuild分析土壤真菌功能，所有處理中土壤真菌的主要功能是Saprotroph>Pathotroph>Symbiotroph。結(jié)構(gòu)方程表明，在秸稈還田基礎(chǔ)上氮肥的減少會(huì)使土壤中的N和P累積，但會(huì)使土壤有機(jī)質(zhì)含量增多，并通過(guò)增加土壤有機(jī)質(zhì)的含量影響土壤細(xì)菌多樣性?；侍砑恿繒?huì)改變土壤pH值而影響土壤真菌多樣性。土壤細(xì)菌多樣性與土壤全氮、硝態(tài)氮、總鉀和速效鉀含量呈正相關(guān)，而土壤真菌多樣性與速效磷、有機(jī)質(zhì)含572t9bJMg5f41x9u2hkQdsdMOWXWD8EHmC6hXfzKuN8=量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明減少氮肥施加是提高土壤微生物多樣性，改善土壤質(zhì)量的有效手段。

關(guān)鍵詞：秸稈；水稻土；高通量測(cè)序；結(jié)構(gòu)方程模型；網(wǎng)絡(luò)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S511.06 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）18-0251-10

收稿日期：2023-10-31

基金項(xiàng)目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：CZKYF2021-2-C027）。

作者簡(jiǎn)介：曾憲楠（1985—），女，黑龍江綏化人，碩士，副研究員，主要從事保護(hù)性耕作研究。E-mail：zengxiannanzxn@163.com。

水稻是主要的糧食作物，水稻全球的種植面積超過(guò)1.62億hm²，是全球半數(shù)以上人口的主食^［1-2］，也是我國(guó)主要的糧食作物^［3］。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和為了滿(mǎn)足人口對(duì)糧食的最基本需求，需要提高水稻產(chǎn)量。追求產(chǎn)量增加導(dǎo)致人們過(guò)度施用化肥，我國(guó)已成為世界上最大的化肥消費(fèi)國(guó)^［4］。長(zhǎng)期大量、單純地使用化肥導(dǎo)致溫室氣體排放增加^［5-6］，引起氮磷水污染^［7］，土壤退化^［8］，降低化肥使用效率，影響作物產(chǎn)量^［9］，農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅。保障國(guó)家糧食安全，推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展，保持土壤肥力的前提下，化肥的合理施用已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)。

我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，具有豐富的農(nóng)作物秸稈資源，每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)出量將近7億t^［10-11］。農(nóng)作物秸稈富含農(nóng)作物生長(zhǎng)所需的主要營(yíng)養(yǎng)元素，秸稈還田可改良土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力^［12-13］。已有學(xué)者對(duì)化肥減量配施秸稈進(jìn)行研究。吳立鵬等研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)施化肥比較，秸稈還田與減量氮肥配施使稻田土壤有機(jī)碳、可溶性有機(jī)碳含量增加^［14］。對(duì)于小麥產(chǎn)量，與常規(guī)施化肥比較，秸稈還田與減量氮肥配施對(duì)小麥產(chǎn)量無(wú)負(fù)面影響^［15］。秸稈還田與減量氮肥配施是減少化肥用量的一種有效措施。

土壤中微生物種類(lèi)豐富且數(shù)量眾多，在土壤生態(tài)功能，尤其是元素循環(huán)過(guò)程中扮演著重要角色，對(duì)植物的健康起到重要作用^［16-17］。土壤微生物對(duì)環(huán)境變化較為敏感，微生物群落的改變從一定程度上反映了土壤生態(tài)功能變化。因此，研究長(zhǎng)期化肥減施配秸稈還田對(duì)土壤微生物群落的影響，對(duì)評(píng)價(jià)秸稈還田和配施化肥對(duì)土壤生態(tài)的影響以及尋找環(huán)境友好型的農(nóng)業(yè)措施具有重要的指導(dǎo)意義。已有的研究發(fā)現(xiàn)使用化肥減施和秸稈還田會(huì)顯著改變土壤微生物學(xué)特性。Huang等的研究表明，秸稈與化肥減量配施可以提高紫色土土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的amoA基因多樣性^［18］。楊濱娟等研究秸稈還田與不同比例化肥配施對(duì)稻田土壤根際微生物的影響，發(fā)現(xiàn)秸稈還田處理能夠增加固氮菌的數(shù)量^［19］?？梢?jiàn)不同農(nóng)作物的秸稈、不同的土壤類(lèi)型對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響不一致。

黑土具有土質(zhì)肥沃、保肥、適宜農(nóng)作物生長(zhǎng)等良好的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件，黑龍江省位于我國(guó)黑土帶上，已成為我國(guó)重要的商品糧生產(chǎn)基地，也是我國(guó)糧食安全的“壓艙石”^［20］。對(duì)水稻秸稈還田的研究較多，以往的研究主要集中探討了秸稈還田對(duì)作物產(chǎn)量^［21-22］或土壤理化性質(zhì)的影響^［23-24］，但是關(guān)于水稻秸稈還田與化肥減量配施后，東北黑土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的研究較少。為此，以東北黑土為對(duì)象，基于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)期水稻秸稈還田和化肥減施平臺(tái)，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，研究水稻秸稈與化肥減量配施對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響及與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，以期為寒地稻田合理施肥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2017年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)（45°49′N(xiāo)，126°48′E，海拔117 m）進(jìn)行。該地區(qū)屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，冬夏季節(jié)短，年平均氣溫為4.5 ℃，年平均氣溫≥10 ℃有效積溫2 700 ℃以上，作物年生長(zhǎng)周期約為155 d，年平均降水量為569.1 mm，降水主要集中在6—9月。供試土壤類(lèi)型為黑土。0～20 cm土層土壤養(yǎng)分含量如下：土壤有機(jī)質(zhì)含量為26.50 g/kg，全氮含量為2.01 g/kg，有效氮含量為79.56 mg/kg，有效磷含量為55.84 mg/kg，速效鉀含量為168.42 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

供試水稻品種：龍稻21（培育單位為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所）；供試秸稈為單季水稻殘?bào)w，生長(zhǎng)周期完成后，冬季不留茬。秋季收獲水稻，將試驗(yàn)區(qū)所有秸稈搬出區(qū)外，人工粉碎成約5 cm，秸稈按照不同處理用量，均勻拋撒，翻埋殘茬秸稈，越冬；翌年春季泡田后使用攪漿平地機(jī)平整土地，插秧。田間管理措施同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理一致。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共有5個(gè)氮肥施入量，分別為N1（173 kg/hm²）、N2（133 kg/hm²）、N3（93 kg/hm²）、N4（53 kg/hm²）、N5（0 kg/hm²）（表1）。所有處理秸稈還田量均為7 500 kg/hm²。所有處理的磷、鉀施入量分別為純磷46 kg/hm²，純鉀75 kg/hm²（依據(jù)當(dāng)?shù)厥┓史椒坝昧浚?/p>

1.4 樣本采集

于2023年水稻收獲期進(jìn)行土壤樣品采集。用土鉆在每個(gè)小區(qū)按照S型隨機(jī)采集5點(diǎn)，采集0～20 cm土層土壤，5點(diǎn)混合為1個(gè)復(fù)合樣品。去除土壤中的石塊和植物殘茬，用2 mm的篩子篩土。一部分土壤樣品經(jīng)風(fēng)干后用于測(cè)定土壤的理化性質(zhì)。另一部分樣品在-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于微生物DNA的提取和群落分析。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

全氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定，堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，銨態(tài)氮含量采用KCl浸提蒸餾-凱氏定氮法測(cè)定，硝態(tài)氮含量采用酚二磺酸法測(cè)定，土壤總有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀法測(cè)定，總磷含量采用鉬銻抗分光光度法測(cè)定，速效磷含量采用Olsen法測(cè)定，速效鉀含量采用火焰光度法測(cè)定，pH值采用電位法測(cè)定^［25］。

1.5.2 微生物測(cè)序

使用Mobio12888 power soil extraction kit提取土壤總DNA。本研究通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)土壤細(xì)菌16S rRNA基因片段序列，引物是16S rRNA基因V4區(qū)的通用引物515F（正向引物：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（反向引物，5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。真菌使用ITS rDNA上的ITS1-ITS2可變區(qū)ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 和ITS2 （5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′）。每個(gè)樣品含有特有的6 bp條形碼序列被添加到引物中，用于區(qū)分多個(gè)樣品。PCR反應(yīng)體系共25 μL：含有 2.5 μL TransStart Buffer、2 μL dNTP、1 μL 正向/反向引物 （10 ng/μL）和1 μL DNA（30 ng/μL）模版，17.5 μL去離子水。 PCR條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，并使用AxyPrep DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。每個(gè)樣品分別進(jìn)行3個(gè)PCR重復(fù)，然后等量合并3個(gè)PCR樣品，并在Illumina Miseq v3平臺(tái) （2×300 bp） 上進(jìn)行PE300雙端測(cè)序。

1.5.3 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

使用北京百邁克生物信息云平臺(tái)上的QIIME1（版本1.81）軟件對(duì)原始序列進(jìn)行分析。

原始序列按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾：去除平均得分<20或長(zhǎng)度<200 bp的原始序列。 使用 PEAR軟件（版本0.9.8）對(duì)雙端測(cè)序序列進(jìn)行拼合。使用Usearch軟件（版本7.1）去除嵌合體。使用UPARSE軟件以 97% 的相似度生成操作分類(lèi)單位 （OTU）并對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)眯哦乳撝禐?.7，細(xì)菌比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為SILVA（v.3.2），真菌比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為UNITE（v.8.2）。所有序列按照單個(gè)樣本的最低序列數(shù)對(duì)序列進(jìn)行歸一化后進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基于OTU表計(jì)算所有樣品的α多樣性指數(shù)和β多樣性指數(shù)（主坐標(biāo)分析），使用R軟件（v.3.2.5）的Vegan軟件包計(jì)算。采用FAPROTAX功能預(yù)測(cè)分析環(huán)境樣品中細(xì)菌分為80多個(gè)功能分組（如硝酸鹽呼吸、產(chǎn)甲烷、發(fā)酵、植物病原等）。采用FunGuild功能預(yù)測(cè)將環(huán)境樣品中真菌分為病理營(yíng)養(yǎng)型（pathotroph）、共生營(yíng)養(yǎng)型（symbiotroph）、腐生營(yíng)養(yǎng)型（saprotroph） 3個(gè)營(yíng)養(yǎng)型。利用Spearman相關(guān)方法分析了土壤微生物與養(yǎng)分含量之間的關(guān)系，并構(gòu)建相關(guān)矩陣。利用通徑系數(shù)（也稱(chēng)為結(jié)構(gòu)方程模型）分析了N添加、微生物多樣性、土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。使用AMOS 22.0（IBM Corporation，美國(guó)）軟件對(duì)SEM進(jìn)行分析。使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。分別使用Kolmogorov-Smirnov和Levene檢驗(yàn)分析了數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和異方差特征。使用Origin 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)期化肥減量配施秸稈對(duì)水稻土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

在秸稈還田下，不同化肥施加量?jī)H對(duì)土壤全氮、全磷和速效鉀含量有顯著影響（圖1）。其中，土壤全氮含量隨著化肥施加量減少呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。土壤全磷含量隨著化肥施加量的減少呈先上升后下降趨勢(shì)，在N2處理達(dá)到最高值。土壤速效鉀含量呈現(xiàn)的規(guī)律為N4>N2>N1>N3>N5，N4與其他4個(gè)處理差異顯著。

2.2 長(zhǎng)期化肥減量配施秸稈對(duì)水稻土壤微生物α多樣性的影響

在秸稈還田下不同化肥施入量對(duì)土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)的影響顯著（表2）。Chao1指數(shù)呈現(xiàn)的規(guī)律為N4>N5>N1>N2>N3，香農(nóng)指數(shù)呈現(xiàn)的規(guī)律是N5>N4>N1>N2>N3。但是土壤真菌香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)在不同化肥施加量處理下差異并不顯著（表2）。

2.3 長(zhǎng)期化肥減量配施秸稈對(duì)水稻土壤微生物β多樣性的影響

基于Bray-Curtis距離的非度量多維排列NMDS，結(jié)果表明不同處理下土壤細(xì)菌（R²=0.19，圖2-A）和真菌群落組成（R²=0.31，圖2-B）均存在顯著差異。

2.4 長(zhǎng)期化肥減量配施秸稈對(duì)水稻土細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

細(xì)菌共有OTU數(shù)量為1 969個(gè)，N1處理特有OTU數(shù)目為123個(gè)，而N5特有種OTU數(shù)目為101個(gè)（圖3-A）。真菌共有OTU數(shù)量為360個(gè)，N1處理特有OTU數(shù)目為256個(gè)，而N5特有種OTU數(shù)目為189個(gè)（圖3-B）。通過(guò)GraPhlAn可視化結(jié)果所示，細(xì)菌門(mén)水平上節(jié)點(diǎn)大小表現(xiàn)前3位為酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）>放線菌門(mén)（Actinobacteria）>擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）（圖3-E）。真菌門(mén)水平上節(jié)點(diǎn)大小表現(xiàn)為擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）>子囊菌門(mén)（Ascomycota）>壺菌門(mén)（Chytridiomycota）（圖3-F）。細(xì)菌相對(duì)豐度屬水平前3位分別是uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae、uncultured_bacterium_f_Anaerolineaceae、Sphingomonas（圖3-C）。其中，N1處理的uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae和uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae高于其他處理組（圖3-C）。而Sphingomonas在N5處理中最高。真菌相對(duì)豐度屬水平前3位分別是Cladosporium、Mrakia、Schizothecium（圖3-D）。其中，在N3處理的Cladosporium達(dá)到最低相對(duì)豐度。在N4處理Mrakia為最低值，而Schizothecium為最高值（圖3-D）。

2.5 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵種

微生物隨機(jī)分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（MENA）結(jié)果顯示，土壤細(xì)菌中共有45個(gè)nodes，100個(gè)edges，modularity是0.460，graph_diameter是16.62，graph_density是0.101，clustering_coefficient是0.364，正相關(guān)68%，負(fù)相關(guān)32%（圖2-C）。其中，與周?chē)锓N聯(lián)系緊密并且主要呈正相關(guān)的主要是Proteobacteria門(mén)，主要與周?chē)锓N呈負(fù)相關(guān)的是Bacteroidetes（圖2-C）。土壤真菌中共有50個(gè)nodes，100個(gè)edges，modularity是0.473，graph_diameter是19.59，graph_density是0.082，clustering_coefficient是0.309，正相關(guān)85%，負(fù)相關(guān)15%（圖2-D）。其中，與周?chē)锓N聯(lián)系緊密并且主要呈正相關(guān)的主要是Ascomycota，主要與周?chē)锓N呈負(fù)相關(guān)的是Basidiomycota（圖2-D）。Zi-pi圖結(jié)果表示土壤細(xì)菌中有5個(gè)關(guān)鍵屬（Connectors），分別為uncultured_Acidobacteria_bacterium、uncultured_bacterium_c_OPB35_soil_group、Sphingomonas、uncultured_bacterium_o_Gaiellales、Pseudarthrobacter。其中，Pseudarthrobacter、Sphingomonas在N5處理的相對(duì)豐度最高，分別為0.85%和2.47%。土壤真菌中有5個(gè)關(guān)鍵屬（Connectors），分別為Pyrenochaetopsis、Vishniacozyma、Stenella、Ramichloridium、Hortaea。其中，Pyrenochaetopsis和Hortaea在N4處理中相對(duì)豐度最高。

2.6 微生物之功能預(yù)測(cè)

由圖4-A可知，基于FAPROTAX分析土壤細(xì)菌的功能，所有土壤中相對(duì)豐度前3位的是chemoheterotrophy、aerobic_chemoheterotrophy、nitrification。chemoheterotrophy在N5處理達(dá)到最高值20.71%。nitrification、aerobic_ammonia_oxidation等功能相對(duì)豐度在N4處理達(dá)到最高值，分別為11.37%、7.54%?；贔unGuild分析土壤真菌功能，總體上3種營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型豐度從高到低分別是嗜酸>病理營(yíng)養(yǎng)>共生營(yíng)養(yǎng)（圖4-B）。進(jìn)一步對(duì)真菌功能進(jìn)行分析，結(jié)果表明相對(duì)豐度前3位的是腐生真菌、蘭科腐生、植物病原體，且隨著化肥施加量的降低，腐生功能相對(duì)豐度先降低再升高再降低，而病原體表現(xiàn)出先升高再降低再升高的趨勢(shì)，關(guān)鍵拐點(diǎn)均為N3和N4處理（圖4-C）。

2.7 相關(guān)性分析

結(jié)構(gòu)方程結(jié)果表明，在秸稈還田基礎(chǔ)上氮肥的減少會(huì)使土壤中的N和P累積、土壤細(xì)菌和真菌的多樣性、pH值減少，但土壤有機(jī)質(zhì)含量增多，并且通過(guò)增加土壤有機(jī)質(zhì)的含量影響土壤細(xì)菌多樣性（圖5-A）。 化肥添加量會(huì)改變土壤pH值而影響土壤真菌多樣性（圖5-A）。土壤細(xì)菌多樣性與土壤全氮、硝態(tài)氮、總鉀和速效鉀含量呈正相關(guān)，而土壤真菌多樣性與速效磷、有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)（圖5-B）。

3 討論與結(jié)論

3.1 少量氮肥施加結(jié)合秸稈還田提高土壤微生物多樣性

本研究發(fā)現(xiàn)，化肥施加會(huì)顯著影響細(xì)菌α多樣性但是對(duì)真菌alpha多樣性影響不顯著（表2），并且少量添加氮肥（53 kg/hm²）和不添加氮肥（0 kg）下土壤中細(xì)菌明顯高于其他化肥添加量組（表2）。這是由于一方面適當(dāng)?shù)牡适┘邮谴龠M(jìn)微生物活動(dòng)的關(guān)鍵。少量的氮肥不僅可以為土壤中的微生物提供額外的氮源，促進(jìn)微生物的代謝活動(dòng)和生長(zhǎng)，還可以改變土壤中的生態(tài)環(huán)境，刺激一些特定類(lèi)型微生物的生長(zhǎng)和多樣性，豐富土壤微生物群落，這與之前的研究結(jié)果^［26-27］一致。有研究表明單獨(dú)添加化肥可顯著改變土壤真菌多樣性，少量添加會(huì)增加土壤真菌多樣性，而大量添加會(huì)顯著抑制土壤真菌的多樣性^［28］。本研究由于秸稈還田和化肥同時(shí)添加，秸稈的施加導(dǎo)致土壤中有機(jī)碳含量和種類(lèi)都發(fā)生了改變，反而抵消了化肥添加所導(dǎo)致的土壤養(yǎng)分之間的化學(xué)計(jì)量的改變，因此土壤真菌并未發(fā)生改變。馬玉穎等的研究結(jié)果表明，有機(jī)肥和秸稈還田會(huì)顯著提高砂姜黑土真菌多樣性^［29］。這表明土壤真菌對(duì)秸稈還田和化肥添加的響應(yīng)是不同的，這也與秸稈的質(zhì)量、土壤類(lèi)型等緊密相關(guān)^［29］。秸稈還田能夠增加土壤的有機(jī)質(zhì)含量，豐富土壤中的碳源，為微生物提供多樣的有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。秸稈還田還能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，增加團(tuán)聚體數(shù)量，增加土壤的通透性和空氣含量，為微生物提供適宜生長(zhǎng)的空間?？傊?，在秸稈還田的基礎(chǔ)上只需要少量或者不施加氮肥即可維持土壤中細(xì)菌和真菌的多樣和豐富度。

3.2 少量氮肥施加結(jié)合秸稈還田對(duì)土壤微生物組成的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在未添加氮肥的處理中含量最高，Sphingomonas在未添加氮肥（0 kg）的處理組相對(duì)豐度最高（圖3-C）。據(jù)報(bào)道Sphingomonas能夠利用多種有機(jī)污染物作為碳源和能源，如多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、染料等，從而減少這些物質(zhì)對(duì)植物和環(huán)境的危害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，這有助于糧食安全生產(chǎn)和糧食高產(chǎn)。此外，uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae隨著氮肥減施呈先下降后上升的趨勢(shì)，這表明本身土壤的硝化細(xì)菌也能夠滿(mǎn)足農(nóng)田土壤的氨氧化過(guò)程累積氮的需求。特別是，Sphingomonas既是優(yōu)勢(shì)屬也是關(guān)鍵屬。Pseudarthrobacter、Sphingomonas等關(guān)鍵屬與周?chē)锓N聯(lián)系密切，并且他們也在無(wú)氮肥添加處理中相對(duì)豐度最高。

然而，優(yōu)勢(shì)真菌在少量氮肥的處理中表現(xiàn)優(yōu)異。Cladosporium是一種致病菌，而其相對(duì)豐度在N3和N4處理中較低。而Schizothecium相對(duì)豐度在N4處理中最高，Schizothecium能夠提高植物活力、植物鮮重、根鮮重和根干重，這使得植物能夠向土壤中分泌更多促進(jìn)微生物多樣性的物質(zhì)。此外，Hortaea、Pyrenochaetopsis屬等真菌與周?chē)锓N聯(lián)系緊密，并且也在低氮肥添加處理中相對(duì)豐度最高。據(jù)報(bào)道，Hortaea能有效防治植物和真菌性土傳病害，同時(shí)可使植物葉部的細(xì)菌和真菌病害明顯減少。Pyrenochaetopsis能夠直接參與調(diào)節(jié)土壤碳循環(huán)中的土壤呼吸作用和土壤酶活性，并且對(duì)土壤難溶性碳（有機(jī)質(zhì)等）具有較強(qiáng)的溶解能力^［30］?？傊诮斩掃€田基礎(chǔ)上，減少氮肥施加量能夠調(diào)動(dòng)土壤中優(yōu)勢(shì)和關(guān)鍵物種來(lái)促進(jìn)碳氮循環(huán)、生物降解、病害防治、污染修復(fù)等。

3.3 少量氮肥施加結(jié)合秸稈還田促進(jìn)土壤養(yǎng)分的累積

在秸稈還田的基礎(chǔ)上，土壤中總氮、堿解氮含量隨著氮肥的減施呈波動(dòng)上升，而硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量波動(dòng)下降。這可能是由于少量的氮肥會(huì)促進(jìn)土壤的固氮作用，大量的氮肥反而會(huì)起抑制作用。一部分氮會(huì)被土壤團(tuán)聚體或有機(jī)質(zhì)吸附，降低氮的流失速率，從而增加土壤的氮含量；少量的氮肥可以促進(jìn)土壤中氮循環(huán)過(guò)程，增強(qiáng)土壤中氮的微生物分解作用，本研究中硝化細(xì)菌的豐度在少量施加氮肥處理中也明顯增多（圖3），這些微生物能夠分解秸稈，氮有效性通過(guò)優(yōu)先改變秸稈碳同化微生物群落介導(dǎo)土壤有機(jī)質(zhì)的啟動(dòng)效應(yīng)。此外，少量的氮肥可能導(dǎo)致土壤pH值的變化，使土壤中的氮更容易形成穩(wěn)定的化合物，不容易流失，從而增加土壤氮含量^［31］。

在秸稈還田基礎(chǔ)上，在少量施加氮肥的處理中土壤有效鉀含量和土壤pH值達(dá)到最高值。這是由于秸稈還田可改善土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤的有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤的質(zhì)地，這有助于提高土壤的保水保肥能力，有利于磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。同時(shí)，有機(jī)質(zhì)含量與土壤中鉀含量顯著相關(guān)（圖5），一方面秸稈還田通過(guò)增加大團(tuán)聚體中的土壤腐殖酸來(lái)提高對(duì)鉀的吸附；另一方面，秸稈的摻入能夠在一定程度上提高土壤中磷鉀的有效性，使其更易被植物吸收^［32］。

施用少量氮肥可以為作物生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物對(duì)磷和鉀的吸收，提高植物對(duì)這些養(yǎng)分的利用效率，有助于土壤中磷鉀的累積。此外，施加少量的氮肥可促進(jìn)微生物活動(dòng)，土壤中的微生物會(huì)參與分解釋放出養(yǎng)分，包括磷和鉀，將這些養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為植物可吸收的形式。本試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌主要通過(guò)調(diào)節(jié)土壤中鉀含量，而真菌主要通過(guò)調(diào)節(jié)磷含量來(lái)改善土壤質(zhì)量（圖5）?？傊诮斩掃€田的基礎(chǔ)上應(yīng)當(dāng)注意適量施用氮肥，避免過(guò)量氮肥造成負(fù)面影響，以實(shí)現(xiàn)土壤養(yǎng)分、pH值的合理調(diào)控。

綜上所述，在秸稈還田基礎(chǔ)上，少量化肥或者不使用化肥能夠提高土壤細(xì)菌和真菌的多樣性和微生物之間的聯(lián)系，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)屬和關(guān)鍵屬發(fā)揮降解污染、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、氮素循環(huán)等功能，提高土壤磷鉀的含量。因此，減少氮肥施加是提高土壤微生物多樣性，改善土壤質(zhì)量的有效手段。本試驗(yàn)結(jié)果可為秸稈還田替代化肥技術(shù)的應(yīng)用提供技術(shù)支持，為化肥減施的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，東北黑土區(qū)水稻秸稈條件下，不同化肥添加量對(duì)土壤微生物多樣性的影響并不一致。不同化肥添加量對(duì)土壤細(xì)菌α多樣性的影響要顯著高于真菌α多樣性，但均顯著改變了土壤細(xì)菌和真菌β多樣性。不同化肥施加量顯著改變了土壤全氮、全磷、有效鉀的含量，但是對(duì)其他理化性質(zhì)影響不顯著。不同化肥添加量并不會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢(shì)菌發(fā)生改變，但會(huì)顯著改變其相對(duì)豐度，細(xì)菌門(mén)中酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度最高；真菌門(mén)中擔(dān)子菌門(mén)、子囊菌門(mén)和壺菌門(mén)相對(duì)豐度最高。土壤細(xì)菌群落組成和多樣性主要受到土壤全氮、硝態(tài)氮、總鉀和速效鉀含量的影響，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性主要受到土壤pH值的影響。綜上，化肥減施下秸稈還田會(huì)改變土壤微生物的結(jié)構(gòu)和多樣性，而常規(guī)水稻秸稈還田可以提高土壤微生物的多樣性，對(duì)保護(hù)土壤的健康和穩(wěn)定具有積極意義。

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