人工濕地各組分氮素削減定量及功能基因分析

關(guān)鍵詞：人工濕地；氮同位素；微生物群落；氮代謝；功能基因《2022中國生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》顯示湖泊（水庫）等重要水域的氮含量超標(biāo)。水體中氮含量過高，將不利于水生態(tài)健康發(fā)展，所以亟需對(duì)受污染水體進(jìn)行高效脫氮，提高水質(zhì)。包頭南海湖是我國西北部寒旱區(qū)的代表性湖泊之一，近年自然環(huán)境和人為活動(dòng)常導(dǎo)致污染加重，對(duì)南海湖進(jìn)行全年水質(zhì)監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示TN和NH;-N濃度分別高達(dá)5.95mg·L-1和2.39mg·L-1，并且隨季節(jié)變化幅度較大，夏秋季濃度較高。

人工濕地（CWs）是天然濕地的工程模擬，具有良好的水體生態(tài)修復(fù)能力，是一種成本低、生態(tài)友好型水處理技術(shù)。目前，CWs在廢水的二級(jí)和三級(jí)處理中得到廣泛應(yīng)用，主要包括工業(yè)廢水、河湖水和農(nóng)業(yè)廢水。其中人工濕地系統(tǒng)的氮素去除性能受到多種因素的影響，如植物及基質(zhì)類型、微生物群落結(jié)構(gòu)等。植物在脫氮過程中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)對(duì)人工濕地系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)也有較大影響，是影響工藝運(yùn)行的重要因素之一。而基質(zhì)不僅是濕地植物生長(zhǎng)的介質(zhì)，又是微生物附著的載體，其本身還可吸附污染物，成為保障人工濕地系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效脫氮的關(guān)鍵。由于組成有差異，各類型人工濕地各組分對(duì)人工濕地的氮去除貢獻(xiàn)度尚不明晰。

近年來，新興的穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，氮穩(wěn)定同位素已被用于生物氮循環(huán)的示蹤研究。基于此，本研究采集南海湖原水，通過對(duì)比不同基質(zhì)組成的有植物、無植物人工濕地系統(tǒng)，通過探究其對(duì)氮素的去除效果優(yōu)選人工濕地組成。并通過向最優(yōu)組中投加N同位素進(jìn)行氮示蹤，實(shí)現(xiàn)對(duì)人工濕地脫氮效果的準(zhǔn)確定量及各組分氮的去除貢獻(xiàn)率量化；利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落多樣性進(jìn)行探究，研究人工濕地中微生物對(duì)反硝化過程的影響，旨在闡明人工濕地對(duì)地表水體氮素削減機(jī)制，為人工濕地設(shè)計(jì)及功能的優(yōu)化提供理論支撐。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)裝置與運(yùn)行

由于垂直下行流人工濕地占地面積小，滲透速率快且在脫氮方面優(yōu)勢(shì)顯著，因此本實(shí)驗(yàn)采用白色聚乙烯圓柱桶裝置構(gòu)建高為0.6m，內(nèi)徑15cm，體積為3.38L規(guī)模的垂直流人工濕地系統(tǒng)（圖1）。水樣取自包頭南海湖。在基質(zhì)選擇上，查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)和實(shí)際應(yīng)用案例，并考慮實(shí)用性和使用壽命等因素，選用了3種材料，分別為陶粒（粒徑2～4mm）、煤渣（粒徑2～5mm）和沸石（粒徑3～5mm），這些基質(zhì)具有儲(chǔ)量多，成本低，且吸附能力強(qiáng)，對(duì)環(huán)境無害等優(yōu)點(diǎn)，滿足實(shí)驗(yàn)需求。基質(zhì)層上表面覆蓋防止基質(zhì)流失和便于植物定植的生態(tài)席墊（厚度為5mm）。為模擬流態(tài)水動(dòng)力環(huán)境，在盛放試驗(yàn)用水的塑料桶內(nèi)安裝同一規(guī)格的微型蠕動(dòng)水泵（流量為10L·h-1）。

實(shí)驗(yàn)所選用的基質(zhì)煤渣購置于網(wǎng)絡(luò)商家，沸石購置于河南同德環(huán)?？萍加邢薰荆樟Ｙ徶糜陟柫x市水處理藥劑公司?？紤]到南海濕地中水生植物大部分是蘆葦，且蘆葦有較高的脫氮效率，因此選用蘆葦作為實(shí)驗(yàn)植物。

1.1.1人工濕地系統(tǒng)氮素去除效果分析

每組人工濕地只填充兩種基質(zhì)，并各設(shè)一組無植物人工濕地，探究植物對(duì)脫氮的影響。因此共設(shè)6組實(shí)驗(yàn)，分為有植物實(shí)驗(yàn)組陶粒+煤渣（TMZ）、陶粒+沸石（TFZ）、沸石+煤渣（FMZ），和無植物對(duì)照組（陶粒+煤渣（TM）、陶粒+沸石（TF）、沸石+煤渣（FM）。各類基質(zhì)填充厚度為15cm，總厚度均為30cm，水力停留時(shí)間為24h。實(shí)驗(yàn)期間，每5d在出水口取100mL水樣過0.45um濾膜后，立即進(jìn)行NH4-N、N02-N、N03-N和TN濃度的測(cè)定。

1.1.2N示蹤對(duì)人工濕地系統(tǒng)各組分的N03去除量化

選用氮去除效果最佳的人工濕地繼續(xù)開展各組分的N03去除量化研究。準(zhǔn)確稱量N同位素標(biāo)記的硝酸鉀447.06mg（N為64mg）加入蓄水箱中，實(shí)驗(yàn)進(jìn)水體積為2.5L，攪拌均勻后加入實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)。設(shè)置系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)間為15d，分別在第5、10、15天對(duì)人工濕地植物、上層基質(zhì)、下層基質(zhì)和出水口進(jìn)行破壞性采樣。植物樣品放入冰箱0℃冷藏保存，水樣和基質(zhì)樣品放人冰箱-20℃冷凍保存，所有樣品于實(shí)驗(yàn)第16天用冰袋泡沫箱保存送往科學(xué)指南針天津辦事處進(jìn)行氮同位素含量檢測(cè)。

1.2分析方法

TN和NH-N分別采用過硫酸鉀紫外分光光度法和納氏試劑分光光度法測(cè)定；N02-N和N03-N測(cè)定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法。

1.3高通量測(cè)序

為探究反應(yīng)系統(tǒng)中微生物群落變化，分別采集系統(tǒng)中上、下兩層基質(zhì)及植物根部樣品。有植物人工濕地系統(tǒng)，基質(zhì)樣品煤渣、陶粒依次標(biāo)號(hào)為A、B；植物根部樣品分別為C。無植物人工濕地系統(tǒng)，基質(zhì)樣品煤渣、陶粒依次標(biāo)號(hào)為A、B。進(jìn)行2次重復(fù)采樣，共采集10個(gè)樣品，將離心、抽濾后的樣品放置于-80℃條件下干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行16SrDNA高通量測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)選擇通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG -3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因中的V3-V4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件參數(shù)為：95℃預(yù)變性溫度下保持3min；95℃變性溫度下保持30s，55℃退火溫度下保持30s，72℃延伸溫度下保持45s，進(jìn)行27次循環(huán)擴(kuò)增；72℃下終止延伸10min，10℃至反應(yīng)結(jié)束，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用美國AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)定量分析，之后構(gòu)建MiSeq文庫，利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，將所得序列通過OTUs（運(yùn)算分類單位）以97%的相似度進(jìn)行聚類，本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序工作由測(cè)序公司完成。

1.4數(shù)據(jù)分析與計(jì)算

為量化人工濕地中各組分N去除，需對(duì)人工濕地各組分樣品中N含量進(jìn)行計(jì)算。

2結(jié)果與討論

2.1人工濕地系統(tǒng)對(duì)TN的去除

各人工濕地系統(tǒng)中TN的起始濃度均為4.59mg·L-1，6組人工濕地出水中TN濃度隨時(shí)間變化如圖2所示。6組人工濕地對(duì)TN的去除效果存在著顯著差別，含植物的人工濕地在兩個(gè)周期中TN的含量均有顯著降低；未種植植物的人工濕地中TN含量則表現(xiàn)為先升高后降低。經(jīng)過各組人工濕地系統(tǒng)的凈化后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中的TN濃度分別下降至（2.70±0.12）、（3.71±0.11）、（3.09±0.12）、（3.47±0.14）、（3.07±0.13）、（3.27±0.11）mg·L-1。有植物組中陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)TN的去除效果最好，去除率為41.18%+2.61%，無植物組中是陶粒+沸石人工濕地系統(tǒng)對(duì)TN的去除效果最好，去除率為28.76%±2.40%。有植物的人工濕地系統(tǒng)比無植物的人工濕地系統(tǒng)具有更高的TN去除率，說明植物對(duì)TN的去除性能影響較大。一方面由于人工濕地系統(tǒng)上層基質(zhì)中存在植物的一些細(xì)小根系，植物根系本身可以吸附一些氮素污染，同時(shí)也可以附著微生物并提供氧氣，有利于微生物的生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)微生物對(duì)氮素的去除；另一方面植物可促進(jìn)基質(zhì)的氮吸附作用，植物的根系可以改善基質(zhì)的孔隙結(jié)構(gòu)，幫助基質(zhì)緩解堵塞，更利于基質(zhì)對(duì)南海原水中氮素的吸收。因此植物的加入提高了人工濕地整體的氮去除性能。

2.2人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除

6組人工濕地出水中NH4-N濃度隨時(shí)間變化如圖3所示。各人工濕地均能高效凈化南海湖的含氮污染物。各人工濕地系統(tǒng)出水中NH4-N都有下降的趨勢(shì)，整個(gè)過程有植物組NH;-N的濃度低于無植物組。實(shí)驗(yàn)29d后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中的NH4-N濃度從初始的2.28mg·L-1分別下降到（1.13±0.06）、（1.20±0.07）、（1.27±0.06）、（1.58±0.05）、（1.32±0.08）、（1.38±0.07）mg·L-1。結(jié)果顯示，有植物組中陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除效果最好，去除率為50.44%+2.63%，而無植物組中沸石+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除效果最好，去除率為42.11%±3.51%；同時(shí)在陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)中植物的作用在NH4-N的去除中體現(xiàn)最明顯。植物對(duì)NH4-N的去除作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面，植物可以直接吸收NH4N。另一方面，植物也有分泌氧氣的作用，可以將空氣中的氧氣傳遞至根部區(qū)域，南海湖原水在人工濕地中，表層溶解氧充足，在好氧的環(huán)境中，硝化反應(yīng)條件適宜，將NH4-N轉(zhuǎn)化為N02-N和N03-N。此外，通過無植物組的人工濕地出水中NH4-N的29d變化結(jié)果可知，基質(zhì)對(duì)NH4-N的吸附作用也是一種重要的氮去除方式。因此在本研究中，NH4-N的去除主要依賴于基質(zhì)的吸附、植物的吸收與硝化反應(yīng)。

2.3人工濕地系統(tǒng)對(duì)N03-N的去除

6組人工濕地出水中N03-N濃度隨時(shí)間變化如圖4所示。各人工濕地系統(tǒng)中N03-N的起始濃度平均為2.59mg·L-1，經(jīng)各組人工濕地系統(tǒng)的凈化后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中N03-N的濃度分別為（1.53±0.06）、（1.84±0.05）、（1.76±0.05）、（2.07±0.07）、（2.09+0.08）、（1.83±0.06）mg·L-1之間。并且運(yùn)行29d后，有植物組陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)N03-N的去除效果最好，去除率為40.93%+2.32%，而無植物組中陶粒+沸石人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除效果最好，去除率為29.34%±2.33%。3種有植物的人工濕地對(duì)N03-N的去除率均高于無植物的，即植物在人工濕地系統(tǒng)中對(duì)N03-N的去除起到重要作用。植物在N03-N去除過程中主要表現(xiàn)為植物的直接吸收。含植物的人工濕地，特別是具有發(fā)達(dá)根系的植物，可以吸收水中更多的N03-N以供其生長(zhǎng)發(fā)育。此外，人工濕地植物根部可以富集微生物，具有根際效應(yīng)，能夠產(chǎn)生氧氣和分泌物，并被微生物用于生長(zhǎng)繁殖。植物可以通過影響微生物的活性而對(duì)人工濕地中氮污染物的去除效果產(chǎn)生影響。在有植物的人工濕地系統(tǒng)中，特別是在植物根系中，有較多的微生物和較強(qiáng)的生物活性；而不含栽種植物的人工濕地系統(tǒng)因?yàn)橹参锏娜笔В环矫?，基質(zhì)缺乏反硝化所需的微生物、酶等；另一方面，基質(zhì)中缺乏有氧與無氧的過渡環(huán)境，導(dǎo)致底物中N03-N的持續(xù)積累，致使底物中N03-N的濃度非但沒有下降，反而升高。

2.4人工濕地系統(tǒng)對(duì)N02-N的去除

6組人工濕地出水中N02-N濃度隨時(shí)間變化如圖5所示。各人工濕地系統(tǒng)對(duì)N02-N的去除均表現(xiàn)出了較好的效果。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，人工濕地系統(tǒng)進(jìn)水的N02-N初始濃度為0.15～0.16mg·L-1，人工濕地系統(tǒng)運(yùn)行29d后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中N02-N的濃度分別降低到（0.039±0.003）、（0.053±0.004）、（0.041±0.003）、（0.061±0.004）、（0.064±0.005）、（0.058±0.003）mg·L-1，去除率均達(dá)到58%以上，最高可達(dá)76.31%。從圖5中可以看出，相較于其他氮素指標(biāo)的去除，有植物的陶粒+煤渣組并未在N02-N的去除方面與無植物組拉開差距，這可能是因?yàn)镹02-N在人工濕地環(huán)境中的轉(zhuǎn)化和去除過程相對(duì)復(fù)雜。N02-N屬于一種相對(duì)不穩(wěn)定的化合物，容易轉(zhuǎn)化為其他更穩(wěn)定的形態(tài)，如N03-N或NH4N。這些轉(zhuǎn)化過程可能受到人工濕地環(huán)境中多方面因素的影響，包括pH值、溫度、基質(zhì)孔隙大小、微生物活性等。因此，植物的存在可能對(duì)這些轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生一定的影響，但這種影響比較微弱。此外，在0～9d的時(shí)間內(nèi)，與陶粒+煤渣組相比，陶粒+沸石、沸石+煤渣基質(zhì)的有植物組N02-N的去除效果對(duì)比無植物組有顯著差異。說明含有沸石的基質(zhì)組合更能促進(jìn)人工濕地N02-N的去除，由于沸石的表面結(jié)構(gòu)較粗糙且多孔，在水中有利于離子的吸附與交換且不改變晶體結(jié)構(gòu)。同時(shí)具有更大比表面積，為微生物提供了更多的依附場(chǎng)所和活動(dòng)空間。但是隨著吸附的污染物越多，基質(zhì)出現(xiàn)明顯堵塞，去除率下降，導(dǎo)致出水N02-N濃度逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5N同位素在人工濕地中的絕對(duì)豐度質(zhì)量

為進(jìn)一步研究人工濕地系統(tǒng)中各組分對(duì)N03-N的去除貢獻(xiàn)度，采用陶粒+煤渣組人工濕地進(jìn)行氮同位素標(biāo)記定量實(shí)驗(yàn)，選擇煤渣作為上層基質(zhì)，陶粒作為下層基質(zhì)。基質(zhì)和植物中氮含量、原子百分比（AT%）和同位素N的絕對(duì)豐度分別列于表1。其中，氮含量指的是基質(zhì)和植物中氮元素占整體物質(zhì)含量的百分比。由表1可知，植物根際的氮含量為0.57%，上層基質(zhì)和下層基質(zhì)氮含量分別為0.18%和0.13%，植物根際氮含量遠(yuǎn)高于基質(zhì)。原因是基質(zhì)本身只通過吸附作用去除氮，而植物能利用基質(zhì)中的氮元素合成自身的物質(zhì)；此外，基質(zhì)本體含量高也致使其氮含量占比低于植物。

i5N同位素的絕對(duì)豐度是指一種物質(zhì)中N同位素的凈含量，它是根據(jù)含氮量和原子百分比進(jìn)行計(jì)算的。根據(jù)AT%數(shù)值及N03-N濃度，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)原水N的絕對(duì)豐度，見圖6。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，原水中的N的絕對(duì)豐度是0.396mg·L-1，經(jīng)過5d的處理后，N的絕對(duì)豐度降至0.230mg·L-1；15d后降到0.134mg·L-1，此時(shí)人工濕地對(duì)N的去除率達(dá)到了66.16%．也再次反映出該人工濕地良好的氮去除效果。植物和基質(zhì)中N的絕對(duì)豐度如表1所示：在上層基質(zhì)中，單位質(zhì)量的基質(zhì)中N濃度最高，其絕對(duì)豐度可達(dá)8.64x10-3mg·g-1，單位質(zhì)量基質(zhì)的吸附量也最大；下層基質(zhì)中，N的含量最小，絕對(duì)豐度為6.31x10-3mg·g-1，它的吸附能力是最小的。植物中N的絕對(duì)豐度達(dá)到55.29mg·g-1，明顯高于基質(zhì)，說明單位質(zhì)量植物對(duì)氮的吸收量較大。

2.6人工濕地各組分N03-N去除的貢獻(xiàn)率

人工濕地各組分N去除總量變化如表2所示，在15d后，有植物組植物、上層基質(zhì)、下次基質(zhì)以及微生物的N去除總量分別為13.49、12.51、11.04、11.59mg;而無植物各組分的N去除總量分別為11.76、9.01、15.64mg。從整個(gè)過程來看，植物的N去除總量在0～5、10～15d變化較小，而在5～10d變化較大，即對(duì)N的吸收速率呈現(xiàn)出先緩后快再緩的趨勢(shì)。由于初期是植物對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)階段，故N的吸收在初期并不顯著，適應(yīng)后則會(huì)加速對(duì)N03-N的吸收。在初期，上層基質(zhì)對(duì)N03-N的吸收發(fā)揮更重要作用。試驗(yàn)中后期，由于土壤養(yǎng)分、環(huán)境等因素的影響，植物對(duì)N的積累速度減慢，但此時(shí)的微生物已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境并逐漸發(fā)揮作用，加快對(duì)N的吸收。此外，對(duì)比有植物和無植物組發(fā)現(xiàn)，有植物組微生物中N去除總量低于無植物組，這是由于無植物組對(duì)N03-N有去除作用的只有基質(zhì)與微生物，而有植物組中植物也能吸收氮，從而為人工濕地系統(tǒng)氮素去除貢獻(xiàn)一定比例，使得微生物對(duì)N03-N去除的量減少；同時(shí)植物根系有泌氧功能，一定程度制約微生物對(duì)氮的反硝化。因此無植物組微生物的脫氮效果好于有植物組。

同時(shí)以各組分N同位素的去除總量為依據(jù)，可以得出有植物人工濕地植物、基質(zhì)和微生物組分在15d后對(duì)N03-N去除的貢獻(xiàn)率。植物的吸收和基質(zhì)的吸附對(duì)人工濕地系統(tǒng)N03-N去除的貢獻(xiàn)率分別為27.74%和48.43%，微生物對(duì)N03-N的去除貢獻(xiàn)率占23.83%。但從表2可以看出，實(shí)驗(yàn)的中后期植物與基質(zhì)對(duì)N的吸收變得緩慢，而微生物則加快了對(duì)N03-N的去除，說明在人工濕地穩(wěn)定運(yùn)行后微生物將會(huì)對(duì)人工濕地N03-N的去除起主導(dǎo)作用。

2.7植物對(duì)微生物多樣性的影響

5組樣品的微生物多樣性指數(shù)如表3所示，通過物種多樣性指數(shù)（Simpson）與豐富度指數(shù)（Chao、Ace）變化情況可知，5組樣品中的多樣性及豐富度均有較大的差異，有植物組的豐富度較無植物組有顯著提升。植物的加入使人工濕地中的微生物數(shù)量得到了增加，從而提高了人工濕地的氮凈化性能。植物能向基質(zhì)中輸送氧氣，維持底物中微生物的活力和多樣性；植物的生長(zhǎng)和代謝，凋落物和植物根系分泌物等也可以為微生物的繁殖和發(fā)育提供能量，豐富的微生物群落物種多樣性強(qiáng)化了人工濕地系統(tǒng)去除氮素的能力。

2.8植物對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

各組人工濕地系統(tǒng)中微生物門水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖7（a）所示。各組人工濕地系統(tǒng)中基質(zhì)及植物根系上的細(xì)菌共鑒定出53個(gè)菌門。其中相對(duì)豐度前10為優(yōu)勢(shì)菌門，主要包括Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteriota（放線菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Patescibacteria（髕骨菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Acidobacteriota（酸桿菌門）和Cyanobacteria（藍(lán)藻門）。Proteobacteria的豐度最高，相關(guān)研究表明，其大部分菌門均參與氮循環(huán)途徑，在生物脫氮過程中具有至關(guān)重要的作用。對(duì)比兩組人工濕地系統(tǒng)，植物中的Bacteroidota數(shù)量明顯高于兩組基質(zhì)，Bacteroidota為異養(yǎng)細(xì)菌，能夠分解水中的碳水化合物，利用水中的N03-N，參與反硝化作用。Firmicutes是具有脫氮功能的互養(yǎng)細(xì)菌，對(duì)比5組樣品，有植物組中Firmicutes相對(duì)豐度占比均較高，故有植物人工濕地系統(tǒng)脫氮效果更佳。

各組人工濕地系統(tǒng)中微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖7（b）所示，各系統(tǒng)的群落組成存在一定的差異，主要表現(xiàn)在有植物的人工濕地系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌屬主要分布在P.seudomona.s（ 49.08%～62.69%）、P.seudarthro-bacter（4.11%～4.93%）和Malilcia（3.25%～10.78%）菌屬；無植物系統(tǒng)主要為L(zhǎng)imnobacter （40.32%～51.58%）、Nevskia （9.23%～11.57%）和Rhodobacter（3.04%～5.45%）菌屬。此外，不同于有植物系統(tǒng)，無植物系統(tǒng)兩基質(zhì)表面的微生物群落組成表現(xiàn)出明顯不同，陶粒中Saccharimonadaceae、Rhodobacter、Azoar-cus等菌屬的比例顯著提高，suiDritaiea、Rhodoferax和Sphingomonas等菌屬顯著降低。說明植物的加入使兩個(gè)基質(zhì)的微生物系統(tǒng)逐漸均質(zhì)化，使出水水質(zhì)更穩(wěn)定。植物根系和基質(zhì)附著的微生物也有明顯的不同，植物根系的優(yōu)勢(shì)菌屬豐度更大，尤其是Flavobacteri-um菌屬占比明顯高于其他兩基質(zhì)。Flavobacterium是常見的植物促生菌之一，可以溶解磷酸鹽，制造生長(zhǎng)激素，推測(cè)植物的加入提高了此類菌屬的占比，反過來又促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)氮素的循環(huán)作用，從而通過影響基質(zhì)中氮素的分布間接影響基質(zhì)所附著微生物的群落結(jié)構(gòu)。

2.9微生物氮代謝功能基因分析

通過對(duì)植物根系C、有植物組煤渣A、陶粒B和無植物組煤渣A、陶粒B’基質(zhì)樣品的微生物氮代謝基因功能的鑒定與分析，篩選出具有脫氮功能的優(yōu)勢(shì)基因。目前，國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)的氮代謝功能基因有：亞硝酸還原酶（NIR）基因nirS/nirK；硝酸還原酶（NR）基因narG/napA；一氧化氮（NO）還原酶基因norB；一氧化二氮（N20）還原酶基因nosZ；單加氧酶（AMO）基因aomA；羥胺氧化酶（HAO）基因hao；亞硝酸鹽氧化酶（NXR）基因nor等。在各系統(tǒng)中鑒定出與氮代謝相關(guān)的功能基因主要有參與反硝化過程的narG/narZ、narH/narY．nirK、nirS和參與固氮過程的nasA、nirA、nirB，如圖8所示。不論是在基質(zhì)還是植物中，nasA與nirB基因的豐度都遠(yuǎn)高于其他基因，這表明固氮過程是本實(shí)驗(yàn)人工濕地微生物氮代謝的主要途徑。此外，有植物人工濕地系統(tǒng)不同基質(zhì)表面微生物nirS基因豐度明顯高于無植物系統(tǒng)，說明植物能有效促進(jìn)人工濕地系統(tǒng)中微生物的氮代謝，主要體現(xiàn)在反硝化過程中。而另一個(gè)反硝化過程的nirK基因，其在植物根系中的基因豐度明顯高于基質(zhì)中的。植物可以通過根系分泌多種初級(jí)代謝物，例如糖和有機(jī)酸等，并釋放到水體中，或附著在基質(zhì)表面，被微生物吸收利用，這改變了根際區(qū)域微生物的結(jié)構(gòu)與多樣性，從而促進(jìn)人工濕地的反硝化速率以及反硝化基因豐度，對(duì)氮素去除的反硝化過程中微生物的作用產(chǎn)生了不容忽視的影響。但也可以看出，無植物人工濕地基質(zhì)中nirB基因豐度大于有植物系統(tǒng)，說明在人工濕地固氮過程中，植物反而產(chǎn)生了負(fù)反饋。這是由于植物可以通過光合作用產(chǎn)生氧氣，而參與固氮過程的微生物周圍氧氣濃度越高，對(duì)固氮作用的抑制程度就越大，即固氮速率與氧氣濃度成反比關(guān)系，同時(shí)也會(huì)影響基質(zhì)中固氮基因的豐度。

為了深入研究植物對(duì)人工濕地系統(tǒng)氮去除機(jī)理的影響，通過高通量技術(shù)獲得不同處理組的非冗余基因集，將全部基因片段與KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫內(nèi)氮代謝相關(guān)的酶基因信息進(jìn)行比對(duì)，獲得氮循環(huán)過程中相關(guān)功能酶的豐度。在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出的氮代謝相關(guān)功能酶的具體功能和名稱如表4所示。有植物和無植物人工濕地豐度前三的功能酶相同，為硝酸還原酶（EC：1.7.99.4）、亞硝酸鹽還原酶（EC：1.7.1.15）、谷氨酸脫氫酶（EC：1.4.1.2）。相比于無植物系統(tǒng)，有植物人工濕地中顯著上調(diào)了NADP依賴型（谷氨酸脫氫酶，EC：1.4.1.4）、谷氨酸合酶（鐵氧還蛋白，EC：1.4.7.1）、固氮酶（EC：1.18.6.1）、一氧化氮還原酶（細(xì)胞色素c，EC：1.7.2.5）、氰化酶（EC：4.2.1.104）、羥胺還原酶（EC：1.7.99.1）、亞硝酸鹽還原酶（EC：1.7.2.1）、氨基甲酸激酶（EC：2.7.2.2）、一氧化二氮還原酶（EC：1.7.2.4）、鐵氧還蛋白一硝酸還原酶（EC：1.7.7.2）、亞硝酸鹽還原酶（細(xì)胞色素，氨形成，EC：1.7.2.2）豐度，表明植物的加入有促進(jìn)固氮、硝化、反硝化以及異化硝酸鹽過程的作用。同時(shí)觀察到植物根系微生物中的氮代謝相關(guān)功能酶豐度與兩基質(zhì)層幾乎一致，說明功能酶在整個(gè)有植物的濕地中分布均勻，整體氮代謝作用穩(wěn)定。

3結(jié)論

（1）凈化效果最佳的組合為陶粒+煤渣，相比無植物系統(tǒng)，有植物系統(tǒng)的TN、NH;-N、N03-N和N02-N去除率分別為（41.18±2.61）%、（50.44±2.63）%、（40.93±2.32）%、（74.34±1.97）%，有植物人工濕地具有較好的氮去除效果及反硝化作用。3組有植物人工濕地系統(tǒng)對(duì)南海湖水體氮污染物的總體凈化效果排序?yàn)樘樟?煤渣gt;陶粒+沸石gt;沸石+煤渣。無植物系統(tǒng)對(duì)南海湖水體氮污染物的凈化效果依次為陶粒+沸石gt;陶粒+煤渣gt;沸石+煤渣。

（2）基質(zhì)中N絕對(duì)豐度值低于植物中的，單位質(zhì)量植物吸收氮素能力更強(qiáng)。N同位素的示蹤量化了植物、基質(zhì)和微生物對(duì)人工濕地系統(tǒng)N03-N去除的貢獻(xiàn)率分別為27.74%、48.43%和23.83%。在人工濕地建設(shè)初期，N03-N的去除主要是由上層基質(zhì)完成；穩(wěn)定運(yùn)行后，N03-N的去除主要以微生物為主。

（3）在有植物人工濕地系統(tǒng)中，參與氮循環(huán)的優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度較高，促進(jìn)系統(tǒng)的脫氮性能。此外，有植物人工濕地系統(tǒng)基質(zhì)中的nirS基因、植物根系的nirK基因豐度顯著增加，植物有效促進(jìn)了人工濕地系統(tǒng)中微生物的反硝化能力，且植物根系微生物中的氮代謝相關(guān)功能酶豐度與兩基質(zhì)層幾乎一致，即有植物的濕地中整體氮代謝效果相對(duì)穩(wěn)定。