響應(yīng)面法優(yōu)化葛仙米多糖提取工藝研究

本文采用超聲波協(xié)助酶法，對葛仙米類植物多糖進(jìn)行了研究，同時(shí)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了葛仙米多糖的提取工藝，以期為葛仙米及其多糖成分的深入研究和開發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1. 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 葡萄糖含量測定

在100mL容量瓶中加入10mg葡萄糖粉末，再加入蒸餾水至刻度線下1cm，靜置1min，然后用膠頭滴管緩慢補(bǔ)加蒸餾水，定容至刻度線，充分搖勻，靜置，得到0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL定量瓶中，并分別加入蒸餾水定容至2mL，同時(shí)直接加蒸餾水2mL于定量瓶中作為空白對照組。再加入5%苯酚溶液1mL，輕微振搖，使其與葡萄糖溶液混勻；用移液管吸取7mL濃硫酸，并將其沿試管壁緩慢加入，振搖，放置15min，冷卻至室溫。

利用紫外可見分光光度計(jì)，在490nm波長下測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并進(jìn)行空白對照，繪制x軸為葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL），y軸為吸光度（A）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

在490nm處測定的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的吸光度數(shù)值如表1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.0179x-0.0924，R2=0.9921，具體如圖1所示。葛仙米多糖的質(zhì)量濃度可依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。葛仙米多糖得率的計(jì)算公式如（1）所示。

（1）

該公式中，P為葛仙米多糖得率；C為溶液中葛仙米多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為溶液的體積（mL）；F為多糖的稀釋倍數(shù)；m為多糖樣品的質(zhì)量（mg）。

1.3 葛仙米多糖含量測定

量取200mL蒸餾水，與事先粉碎并篩好的葛仙米粉末混合置于250mL具塞錐形瓶中。將事先稱取的不同質(zhì)量的纖維素酶分別放置于20mL小燒杯中，依次加入少量蒸餾水，攪拌均勻。將溶液pH調(diào)為5，放入水浴鍋中50℃酶解30min。在改變超聲時(shí)間和超聲溫度的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對不同超聲時(shí)間和超聲溫度條件下得到的樣品進(jìn)行編號，以作區(qū)分，并冷卻至室溫。利用離心機(jī)將液體與葛仙米固體顆粒進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)速為8000r/15min，待機(jī)器完全停止后取出上清液。吸取1mL上清液放入小燒杯中，稀釋至6倍。將稀釋后的葛仙米多糖樣品用移液管移取至1-10mL定量瓶中，先后分別加入5%的苯酚溶液1mL。用移液管移取濃硫酸7mL，并將其沿瓶壁緩慢加入定量瓶中；用膠頭滴管移取少量蒸餾水定容至刻度線，振蕩搖勻，靜置15min，冷卻至室溫。通過紫外分光光度計(jì)測定葛仙米多糖溶液的吸光度，并將測出的數(shù)值帶入式（1）中，計(jì)算出葛仙米多糖得率。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 纖維素酶的添加量。稱取粉碎后的葛仙米干品，放入250mL具塞錐形瓶中，量取200mL蒸餾水加入其中。固定超聲溫度為90℃、超聲時(shí)間為60min，控制纖維素酶的添加量，分別加入10、15、20、25、30mg于錐形瓶中，并根據(jù)所測吸光度得出相對情況下的葛仙米多糖得率。以纖維素酶的添加量（x）和葛仙米多糖得率（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以直觀確定最佳條件。

1.4.2 超聲時(shí)間。稱取粉碎后的葛仙米干品，放入250mL具塞錐形瓶中，量取200mL蒸餾水加入其中。固定超聲溫度為90℃、纖維素酶的添加量為20mg，控制超聲時(shí)間，分別設(shè)置為30、60、90、120、150min，并根據(jù)所測吸光度得出相對情況下的葛仙米多糖得率。以超聲時(shí)間（x）和葛仙米多糖得率（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以直觀確定最佳條件。

1.4.3 超聲溫度。稱取粉碎后的葛仙米干品，放入250mL具塞錐形瓶中，量取200mL蒸餾水加入其中。固定超聲時(shí)間為60min、纖維素酶的添加量為20mg，控制超聲溫度，分別設(shè)置為80、85、90、95、100℃，并根據(jù)所測吸光度得出相對情況下的葛仙米多糖得率。以超聲溫度（x）和葛仙米多糖得率（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以直觀確定最佳條件。

1.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化葛仙米多糖提取工藝

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)研究，選取的3個(gè)考察因素分別為纖維素酶的添加量（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C），編碼水平為-1、0、1，且響應(yīng)值為葛仙米多糖得率，用以得到三oK65f7fgpog9WJbrbZ+uLw==合一水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案，如表2所示。

2. 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 纖維素酶添加量的影響。固定葛仙米多糖提取的超聲溫度為90℃、超聲時(shí)間為60min，當(dāng)添加纖維素酶10-20mg時(shí)，多糖得率不斷增加，且在20mg時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)；添加至30mg時(shí)，多糖含量逐漸減少。由此可知，添加20mg纖維素酶為提取多糖最佳條件。

2.1.2 超聲溫度的影響。固定葛仙米多糖提取的纖維素酶添加量為20mg、超聲時(shí)間為60min，在超聲溫度為80℃-95℃時(shí)，葛仙米多糖得率逐漸增加，說明溫度的升高有利于多糖的析出；在超聲溫度為95℃-100℃時(shí)，葛仙米多糖得率緩慢減少，且在95℃附近達(dá)到最高值。因此，將溫度控制在95℃左右最為適宜。

2.1.3 超聲時(shí)間的影響。固定葛仙米多糖提取的纖維素酶添加量為20mg、超聲溫度為90℃，在超聲時(shí)間為30-90min時(shí)，葛仙米多糖含量總體呈遞增狀態(tài)；在90-150min時(shí)，多糖得率逐漸下降。由此可知，在60-90min超聲時(shí)間內(nèi)，多糖得率最高，故將處理時(shí)間控制在此區(qū)間內(nèi)最為適宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及分析

在Design-Expert軟件中，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化響應(yīng)面法。輸入3個(gè)因素與編碼水平，通過不同實(shí)驗(yàn)得到葛仙米多糖得率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示，響應(yīng)面模型結(jié)果方差分析如表4所示。

利用Design-Expert軟件對表3中因素水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，可以得到纖維素酶的添加量（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）對響應(yīng)值葛仙米多糖得率（Y）的回歸方程為：Y=5.48+0.36A+0.68B+0.59C-0.25AB-0.22AC+0.45BC-1.25A2-0.78B2-0.55C2。從表4數(shù)據(jù)可知，葛仙米多糖模型為0.00052，P值小于0.05，說明模型顯著；A2、B2的值分別為0.0002、0.0029，小于0.01，說明其關(guān)系較顯著；模型中相關(guān)系數(shù)R2=0.7780，Radj=0.9030，小于0.2，說明模型較好，實(shí)際誤差較小，試驗(yàn)的3個(gè)因素能夠反映與葛仙米多糖得率間的關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適宜的葛仙米多糖提取工藝條件為：纖維素酶20mg、超聲溫度96℃、超聲時(shí)間84min，此條件下的葛仙米多糖得率為5.9%。

基金項(xiàng)目：2023年湖北省高等學(xué)校實(shí)驗(yàn)室研究項(xiàng)目“基于生態(tài)校園下中藥學(xué)專業(yè)實(shí)踐教學(xué)平臺的構(gòu)建——以武漢生物工程學(xué)院為例”（HBSY2023-093）；2023年校級教學(xué)改革研究立項(xiàng)“基于生態(tài)校園下醫(yī)藥學(xué)院專業(yè)實(shí)踐教學(xué)新體系的構(gòu)建”（2023J49）。

作者簡介：游林紅（1973-），女，漢族，湖北武漢人，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镆志兴幉挠行С煞值奶崛?、分離、鑒定等。

*通信作者：黃帥（1985-），男，漢族，湖北武漢人，副教授，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源的開發(fā)與利用。