牛肉中磷酸腺苷含量的測(cè)定方法

牛肉的品質(zhì)及變化與能量物質(zhì)及伴隨產(chǎn)生的產(chǎn)物相關(guān)，宰后早期肉品經(jīng)過(guò)無(wú)氧酵解、肌原纖維蛋白降解（肉的成熟）過(guò)程，磷酸腺苷含量及代謝效率會(huì)對(duì)牛肉品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷酸腺苷水平不足時(shí)，會(huì)引發(fā)線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而使肌肉中的纖維蛋白含量減少，這將直接影響牛肉的嫩度和質(zhì)地。因此，通過(guò)測(cè)定屠宰后牛肉中磷酸腺苷含量及相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化水平差異，對(duì)于進(jìn)一步確定牛肉品質(zhì)差異具有重要意義。

磷酸腺苷包括三種主要形式，分別是三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）以及一磷酸腺苷（AMP）。肉產(chǎn)品中磷酸腺苷的分析方法主要有酶學(xué)法、色譜法和液質(zhì)聯(lián)用等，而樣品前處理的結(jié)果會(huì)對(duì)分析指標(biāo)、成本、效率產(chǎn)生直接影響。應(yīng)用色譜法對(duì)牛肉中的磷酸腺苷進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于牛肉等生物樣品具有基質(zhì)復(fù)雜、干擾物多、待測(cè)物濃度低等缺點(diǎn)，因此需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，以去除潛在的干擾物質(zhì)并富集待測(cè)組分，確保后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。因此，如何在復(fù)雜的牛肉基質(zhì)中快速、準(zhǔn)確地分離出磷酸腺苷并進(jìn)行高效分析，成為當(dāng)前研究的重要課題。

QuEChERS方法是一種應(yīng)用廣泛的樣品前處理技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠和安全的特點(diǎn)。使用QuEChERS方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，主要涉及萃取劑、脫水劑和凈化劑的選擇。硫酸鎂和硫酸鈉常用作脫水劑，可以顯著降低水相，促進(jìn)樣品在有機(jī)相中的分布和兩相的分層，從而有效地將水分從有機(jī)相中吸附出來(lái)，使目標(biāo)化合物更純凈。在農(nóng)藥多重殘留的分析中，常用的萃取劑有丙酮、乙腈和乙酸乙酯等。常用的吸附劑有乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）等，針對(duì)不同類型的雜質(zhì)具有各自獨(dú)特的清除效果。其中，PSA含有伯胺和仲胺，具有較強(qiáng)的結(jié)合能力和良好的選擇性，能有效去除樣品中的極性雜質(zhì)和有機(jī)酸，特別是在去除碳水化合物和脂類物質(zhì)時(shí)表現(xiàn)出色。C18則側(cè)重于去除樣品中的非極性物質(zhì)和油脂，適用于脂溶性化合物較多的樣品，去除脂類雜質(zhì)效果顯著，能使目標(biāo)分析物的純度大幅提升。隨著方法的不斷改進(jìn)以及新材料的開發(fā)，QuEChERS可以針對(duì)不同樣品使用不同的萃取劑、脫水劑、凈化劑，但目前采用QuEChERS進(jìn)行磷酸腺苷的測(cè)定未見相關(guān)報(bào)道。

石墨烯（Graphene）是一種新型二維納米材料，具有較高的比表面積，能提供大量的表面吸附位點(diǎn)，有助于從復(fù)雜樣品基質(zhì)中高效提取目標(biāo)化合物。同時(shí)，石墨烯擁有豐富的π電子體系，能與含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物發(fā)生強(qiáng)烈的π-π堆積作用，從而增強(qiáng)對(duì)這類物質(zhì)的吸附能力。因此，石墨烯可以作為一種理想的吸附劑。本研究基于QuEChERS方法，以石墨烯為凈化劑，建立QuEChERS-Graphene-UPLC法測(cè)定牛肉中磷酸腺苷含量。研究結(jié)果可應(yīng)用于牛肉中磷酸腺苷分離富集及檢測(cè)，輔助進(jìn)行牛肉肉質(zhì)評(píng)定。

1. 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司Acquity；高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 5810R；電子天平（精度0.0001g），METTLER公司AE240；多管渦旋混合儀，杭州奧盛儀器有限公司MTV-100。

1.2 材料

對(duì)照品：5’-三磷酸腺苷二鈉鹽（含量＞98%）、5’-二磷酸腺苷鈉鹽（含量＞98%）、5’-磷酸腺苷二鈉鹽（含量＞98%），日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；高氯酸、氨水、醋酸銨等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（農(nóng)殘級(jí)），F(xiàn)isher美國(guó)；0.22μm水系、有機(jī)過(guò)濾膜及0.22μm針筒式濾膜過(guò)濾器，天津津騰公司。

2. 實(shí)驗(yàn)與方法

2.1 樣品前處理

精確稱量新鮮牛肉樣品5g（精確至0.001g），搗碎研磨后置于50mL離心管中，分為2份，每管添加15mL的6%冷高氯酸。采用渦旋振蕩（1200rpm，10min）對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后完全浸泡10min，4500r/min冷凍離心10min，吸取2mL上清液進(jìn)一步純化。

2.2 純化

從有機(jī)相中提取約2mL上清液，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，分別在各管中加入不同量的石墨烯（A：空白；B：10mg石墨烯；C：25mg石墨烯）。渦旋振蕩（1200rpm，10min），然后完全浸泡10min，4500r/min冷凍離心10min。取上清液用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾至樣品瓶?jī)?nèi)，供超高效液相色譜分析。

2.3 色譜條件

采用水質(zhì)UPLC HSS T3柱（2.1×150mm，1.8μm）進(jìn)行分析，流速0.30mL/min、柱溫25℃、注樣量10μL。流動(dòng)相A：磷酸二氫銨水溶液，流動(dòng)相B：乙腈-0.05mmol/L磷酸二氫銨水溶液（10：90），梯度洗脫。

2.4 定性與定量鑒定

分別準(zhǔn)確稱量ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，放入10mL測(cè)量瓶中，用4℃超純水溶解，配制成濃度為1.0mg/mL的對(duì)照原液。將對(duì)照原液稀釋至20、10、5、2、0.5μg/L，隨后注入5個(gè)濃度梯度的控制溶液。以待測(cè)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸分析，得到ATP、ADP和AMP之間的線性關(guān)系。每個(gè)樣品測(cè)量6次（n=6），計(jì)算各個(gè)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著。

3. 結(jié)果與討論

3.1 石墨烯處理效果比較

牛肉樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪和其他有機(jī)物，可能會(huì)干擾目標(biāo)化合物的檢測(cè)，采用吸附劑可以去除樣品中的雜質(zhì)，從而提高檢測(cè)水平。本研究基于QuEChERS方法，采用石墨烯作為吸附劑進(jìn)行前處理，結(jié)果如圖1所示，能顯著提高牛肉基質(zhì)中雜質(zhì)的純化效果，有效降低背景干擾和基線噪聲，使基線大大穩(wěn)定。

石墨烯具有比表面積大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐酸堿等性質(zhì)，與其他常用填料（如C18、多壁碳納米管）相比，其用量和洗脫液體積少，但目標(biāo)物回收率高。本研究發(fā)現(xiàn)，10mg石墨烯即可達(dá)到較好的純化效果，相同的結(jié)果在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)。例如，同等量的C18不足以吸附目標(biāo)物，容易發(fā)生穿透現(xiàn)象，因此所需的吸附劑量大大高于石墨烯。有人研究了石墨烯和石墨化炭黑（GCB）對(duì)于黃瓜中色素的吸附效果，結(jié)果表明，相比于GCB，石墨烯在去除色素方面具有更高的效率。目前利用石墨烯對(duì)肉類樣品進(jìn)行前處理的研究較少，本研究結(jié)果顯示，石墨烯對(duì)牛肉樣品中雜質(zhì)的純化效果較好，且用量少于傳統(tǒng)吸附劑，在后續(xù)研究中將采用10mg石墨烯作為吸附劑，進(jìn)一步考察方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限等。

3.2 色譜條件的改進(jìn)

磷酸腺苷是兩性化合物，極性較強(qiáng)，導(dǎo)致它與極性流動(dòng)相的親和力更大，與非極性固定相的作用較弱，故而在反向色譜柱上不能有效滯留或分離。為了提高磷酸腺苷在色譜分析中的分離效果，本研究對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，以磷酸二氫銨緩沖液與乙腈作為流動(dòng)相的組合，采用梯度洗脫的方式進(jìn)行分離。其中，磷酸二氫銨緩沖液是為了提供穩(wěn)定的pH環(huán)境，乙腈則通過(guò)與緩沖液的梯度洗脫，調(diào)節(jié)目標(biāo)化合物的溶解性。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相的pH=6.7時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)磷酸腺苷與樣品中其他未知物質(zhì)的良好分離，這種分離效果不僅能確保磷酸腺苷呈現(xiàn)出清晰峰形，還大大提升了定性和定量分析的準(zhǔn)確性。

3.3 方法的線性關(guān)系、定量限和檢出限

配制濃度分別為1、5、10、20、50、100μg/L的磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對(duì)三種形式的磷酸腺苷（ATP、ADP、AMP）進(jìn)行色譜檢測(cè)，評(píng)估其線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，三種磷酸腺苷在設(shè)定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，表明該方法具有高度的線性響應(yīng)能力。三種磷酸腺苷的檢測(cè)限為0.001-2.000μg/L，定量限為0.003-5.000μg/L。每個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間較短，僅需15min。動(dòng)物死亡后，ATP會(huì)迅速分解為ADP和AMP，然后進(jìn)一步分解為嘌呤核苷酸和次黃嘌84a371c517f803d134414e1e88e431999ef6fa411b3b4628376ea96fc5b89255呤核苷酸，因此較低的檢出限對(duì)于測(cè)定ATP及其代謝產(chǎn)物的含量具有重要意義，本方法能夠滿足實(shí)際檢測(cè)需求。

綜上所述，作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來(lái)源，牛肉因其低脂肪、高蛋白特性受到消費(fèi)者歡迎。研究表明，牛肉中磷酸腺苷的含量對(duì)牛肉的風(fēng)味、色澤、嫩度影響顯著，定量測(cè)定牛肉中磷酸腺苷的含量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為此，本研究基于QuEChERS方法，開發(fā)了一種超高效液相色譜（UHPLC）分析方法，以提高磷酸腺苷檢測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏性。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）采用石墨烯作為吸附劑，可有效去除牛肉樣品中的脂肪酸、氨基酸及色素等雜質(zhì)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性，而且相較于其他吸附劑，石墨烯用量少，安全可靠；（2）實(shí)驗(yàn)只有稱樣、勻漿、離心、上機(jī)4個(gè)步驟，操作簡(jiǎn)單；（3）每個(gè)樣品上機(jī)檢測(cè)時(shí)間只需要15min。因此，本方法能夠滿足大批量樣品檢測(cè)的要求，可以在牛肉樣品測(cè)定中推廣應(yīng)用，也為磷酸腺苷在其他生物樣品中的檢測(cè)提供了參考。

基金項(xiàng)目：2023年度河北北方學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（JYT2023014）。

作者簡(jiǎn)介：段曉燕（1987-），女，漢族，河北陽(yáng)原人，副研究員，碩士研究生，研究方向?yàn)樾竽翆W(xué)研究與教學(xué)管理。

*通信作者：劉宇（1987-），男，回族，陜西安康人，副研究員，博士，研究方向?yàn)榉蔷幋aRNA與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。