酶解提取-高效液相色譜-電感藕合等離子體質(zhì)譜法測定富硒食品中的有機(jī)硒組分

作為人體必需的微量元素之一，硒的形態(tài)與其生物功能密切相關(guān)。無機(jī)硒的毒性大、活性低，多以硒酸鹽和亞硒酸鹽的形式存在；有機(jī)硒的毒性小、生物活性高，多以硒蛋白、硒代氨基酸、硒多糖以及硒核酸等形式存在。隨著人們對硒的重視程度的提高，市場上出現(xiàn)了越來越多的富硒產(chǎn)品，但是目前我國檢測硒的標(biāo)準(zhǔn)是針對總硒或無機(jī)硒，對人體有益的有機(jī)硒的檢測還暫無標(biāo)準(zhǔn)。通過文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn)，目前對有機(jī)硒形態(tài)檢測方法的研究集中在液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、ICP-MS與飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)合的方法等方面。本研究旨在通過酶解法，將食品中所含有的、以不同形式存在的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化為硒代氨基酸，利用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法對其進(jìn)行形態(tài)分離并定量，從而為市售食品有機(jī)硒的形態(tài)檢測提供參考。

1. 儀器與試劑

1.1 儀器

1260高效液相色譜-NexION 1000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國PE公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國密理博公司；Sigma4-16KS高速離心機(jī)，德國Sigma公司；ME204E、ME155DU分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；VORTEX3旋渦混勻器，德國IKA公司；恒溫水浴振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 試劑

甲醇，色譜純；三氟乙酸，分析純；乙烷磺酸，分析純；鹽酸，分析純；三羥甲基氨基甲烷，分析純；蛋白酶液：CAS9014-01-1，IUB3.2.21.14，300U/mL-400U/mL，不得含丙三醇穩(wěn)定劑；硒代胱氨酸，純度≥98%；甲基-硒代半胱氨酸，純度≥98%；硒代蛋氨酸，純度≥98%；無機(jī)硒儲備液，100mg/L。

2. 試驗(yàn)與方法

2.1 溶G26TyKA+MkpmGTLgYnbg5w==液配制

2.1.1 有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液（100mg/L）：分別精密稱取硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸10.2mg于100mL容量瓶中，用一級水定容。

2.1.2 有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液（1mg/L）：取1mL儲備液至100mL容量瓶中，用一級水定容。

2.1.3 無機(jī)硒中間液：取無機(jī)硒儲備液1mL于100mL容量瓶中，用一級水定容。

2.1.4 硒混和工作液：用0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液，得到質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100μg/L的有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液中的無機(jī)硒濃度均為20μg/L。

2.1.5 流動(dòng)相溶液（98%三氟乙酸水溶液（0.2%v/v）-2%甲醇）：取3.92mL三氟乙酸，加入1000mL一級水、40mL甲醇，一級水定容至2000mL，過0.45μm有機(jī)系濾膜，超聲脫氣10min。

2.1.6 氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取4g氫氧化鈉，用水稀釋至100mL，混勻。

2.1.7 氫氧化鈉溶液（6mol/L）：稱取24g氫氧化鈉，用水稀釋至100mL，混勻。

2.1.8 鹽酸溶液（1mol/L）：稱取8.33mL鹽酸，用水稀釋至100mL，混勻。

2.1.9 0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液：稱取19.52g的2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸和12.2g的三羥甲基氨基甲烷，用1.7L水溶解，根據(jù)室溫用6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為8.3，加水稀釋至2L。

2.1.10 蛋白酶溶液：用0.05mol/L的MES-TRIS緩沖溶液配置成為50mg/mL的蛋白酶溶液，使用前現(xiàn)配并于0℃-5℃條件下暫存。

2.2 樣品前處理

將食品可食部分經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎均勻，稱取0.2-1.0g于50mL耐120℃離心管中，準(zhǔn)確移取并加入0.05mol/L的MES-RTS緩沖液20mL，加入50mg/mL蛋白酶100uL，加蓋密封，渦旋5min混勻。于60℃水浴搖床水浴振搖10min，開蓋，加入3mol/L乙酸溶液2.5mL，控制試樣溫度保持在（60±1）℃，用1mol/L氫氧化鈉溶液或者1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)試樣pH至4.5±0.2，持續(xù)酶解2h，中間每0.5h取出搖勻1次。取出冷卻后，5000r/min離心10min，取上清液，過0.45μm有機(jī)系濾膜，待測，同時(shí)作空白試驗(yàn)。

2.3 儀器條件

2.3.1 液相色譜條件：C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：98%三氟乙酸水溶液（0.2%v/v）-2%甲醇，等度，流速為1.0mL/min、進(jìn)樣量為100μL、柱溫為30℃。

2.3.2 ICP-MS條件：功率為1600W、采樣深度為8mm、霧化室溫度為2℃、等離子體氣流量為17mL/min、輔助氣流量為1.2mL/min、載氣流量為0.95mL/min、檢測質(zhì)荷比（m/z）為78。

3. 結(jié)果與分析

3.1 方法線性關(guān)系、檢出限和回收率

本研究建立的食品中3種硒氨基酸的檢出限均為0.04mg/kg，定量限為0.12mg/kg；在5-100μg/L之間，線性良好；相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，10倍定量限濃度的添加回收率為84.2%-116.0%。詳見表1。

3.2 前處理過程的優(yōu)化

3.2.1 色譜條件的選擇。首先選擇離子色譜柱Hamilton PRP-X100，以檸檬酸銨-甲醇為流動(dòng)相，結(jié)果硒代蛋氨酸（SeMet）的分離效果不理想，出峰時(shí)間長，存在分離度低、拖尾等情況；無機(jī)硒與硒代胱氨酸（SeCyS2）不能完全分開，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH及有機(jī)相比例仍無法改善。將流動(dòng)相更換為三氟乙酸水溶液-甲醇后，雖然可以分離，但出現(xiàn)響應(yīng)較低的情況。選用C18反相色譜柱后，分別嘗試不同的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為三氟乙酸水溶液（0.2%）-甲醇（98：2，V：V）時(shí)，各組分的分離度較高，且響應(yīng)值較高，如圖1所示。

3.2.2 前處理的優(yōu)化。為防止高溫、濃酸等極端條件導(dǎo)致有機(jī)硒向無機(jī)硒轉(zhuǎn)化，提取液選擇相對溫和的水、0.1mol/L的鹽酸、無水乙醇、0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液+蛋白酶，以此進(jìn)行對比研究。提取過程中，加入提取時(shí)間和提取溫度作為變量進(jìn)行考察。交叉實(shí)驗(yàn)證實(shí)，0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液+蛋白酶在常溫下振蕩提取120min和160min的差異不大，考慮時(shí)間成本問題，將提取時(shí)間定為120min，詳見表2。在固定時(shí)間和提取液的情況下，通過對不同溫度下不同樣品的提取效果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)在60℃時(shí)，每種產(chǎn)品的3種有機(jī)硒氨基酸提取量最大，即該溫度為最佳提取溫度，詳見表3。

酶提取效果優(yōu)于其他提取液，主要是因?yàn)樯矬w內(nèi)的大部分硒以結(jié)合蛋白的形式存在，通過蛋白酶的酶解，可以釋放出更多的硒氨基酸。最佳提取溫度的確定和實(shí)驗(yàn)中所使用酶的來源密切相關(guān)，不同來源酶的最佳活性溫度有較大差異，本研究中選用的是枯草桿菌蛋白酶，其最佳活性溫度為50℃-60℃。

綜上所述，本研究建立的高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法提取方法簡單、高效，且檢出限低、線性范圍寬、各組分分離效果好，能夠滿足富硒食品和特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸及L-甲基硒代半胱氨酸的形態(tài)檢測，同時(shí)可為市場上以添加無機(jī)硒冒充富硒食品的執(zhí)法治理提供技術(shù)支持。

作者簡介：邱險(xiǎn)輝（1983-），男，漢族，廣東梅州人，工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称芳笆秤棉r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測。

*通信作者：張秀芹（1974-），女，漢族，黑龍江雙鴨山人，正高級獸醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)槭称?、飼料、獸藥質(zhì)量安全檢測技術(shù)及應(yīng)用。