響應(yīng)面法優(yōu)化糙米總黃酮提取工藝

摘要：以胚芽糙米為材料，采用乙醇溶液提取總黃酮，先后開展單因素試驗和響應(yīng)面試驗，考察提取溫度、乙醇濃度、提取時間和液料比4個因素對糙米總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明，乙醇提取糙米總黃酮的最佳條件為液料比20∶1、乙醇濃度80%、提取溫度40 ℃和提取時間16 min，在此條件下，總黃酮得率為2.550%，與預(yù)測得率2.591%相比，相對誤差僅為1.58%。優(yōu)化后的方法比優(yōu)化前更科學(xué)準(zhǔn)確、操作簡單、高效快捷和環(huán)保廉價，適用于大批量糙米總黃酮的提取。

關(guān)鍵詞：糙米；黃酮；乙醇提取法；響應(yīng)面法

中圖分類號：TQ914.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）09-0167-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.028 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Optimization of the extraction of total flavonoids from brown rice by response surface methodology

LI Yue， CHENG Jian-feng， LUO Tong， DUAN Yi-jing

（College of Agronomy， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

Abstract： Using germ brown rice as the material， ethanol solution was used to extract total flavonoids， and single factor test and response surface test were carried out successively to investigate the influence of extraction temperature， ethanol concentration， extraction time and liquid material ratio on the extraction rate of total flavonoids from brown rice. The results showed that the best condition for ethanol extraction of total flavonoids from brown rice was the liquid material ratio of 20∶1， ethanol concentration of 80%， extraction temperature of 40 ℃ and extraction time of 16 min. Under this condition， the total flavonoids yield was 2.550%， and the relative error was only 1.58% compared with the predicted yield of 2.591%. The optimized method was more scientific， more accurate， simpler， more efficient，more environment-friendly and cheaper than before， and was suitable for large-scale extraction of total flavonoids from brown rice.

Key words： brown rice； flavonoids； ethanol extraction method； response surface methodology

食物供應(yīng)的營養(yǎng)性、功能性和安全性是21世紀(jì)生命科學(xué)、食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)和公眾營養(yǎng)共同關(guān)注的課題［1，2］。水稻是世界上種植面積第二、總產(chǎn)第一的糧食作物，中國約60%和全球30%以上的人口以稻米為主食［3］。過去，人們食用稻米的目的主要以攝取淀粉來獲取能量，但隨著生活水平的不斷提高，對自身健康越來越重視，對主食的營養(yǎng)保健功能要求越來越高，功能型水稻便應(yīng)運產(chǎn)生［4-8］。功能型水稻是一類具有特殊遺傳背景的水稻，在胚乳、胚和米糠等部分中富含某種或多種具有高效生理調(diào)節(jié)功能的活性成分，可滿足不同消費群和特殊消費群需求的專用或保健性水稻，其稻米既能滿足日糧需求，又兼有補充營養(yǎng)和調(diào)節(jié)各種人體生理代謝、輔助治療疾病及增進(jìn)人體健康等多種功能［4-8］。水稻中包含的功能性成分有功能性的蛋白質(zhì)、肽、活性多糖、油脂、維生素、黃酮類化合物、必需微量元素、自由基清除劑和必需氨基酸九大類［4，8］。因此，功能型水稻研究和開發(fā)是21世紀(jì)促進(jìn)高質(zhì)量水稻生產(chǎn)和消費的切入點，為中國21世紀(jì)的分子農(nóng)業(yè)開辟了全新和廣闊的發(fā)展空間，對“健康中國”等國家戰(zhàn)略的實施具有重要意義。

黃酮類化合物是許多藥用植物的有效成分［9］，能降低人體血糖，治療糖尿?。?0，11］，改善血液的流動，具有降血脂、降血壓和治療心腦血管疾病的作用［12-16］，還能捕捉生物體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化自由基，具有抗氧化和抗衰老功能［17-20］。故研究和開發(fā)高黃酮含量的功能型稻米，可使人們在主食中補充黃酮，實現(xiàn)“藥食同源”和“醫(yī)食同源”，達(dá)到健康及延年益壽的效果。黃酮類化合物廣泛存在于許多植物和漿果中，但在糙米中其含量甚微，這給簡便快速、準(zhǔn)確廉價和高通量的提取測定帶來了諸多困難［21］?，F(xiàn)常用的總黃酮提取方法有酶提取法［22，23］、超聲或微波輔助酶提法［24-26］、超聲或微波輔助醇提法［27-31］和溶劑提取法［32-38］等。不同方法各有自身的優(yōu)缺點，酶提取法的酶使用成本較高，酶解后需再次調(diào)節(jié)pH、高溫滅酶，操作步驟較繁雜，不適用于生產(chǎn)領(lǐng)域的大量樣品提?。?2，23］；超聲和微波輔助醇提法提取時間相對較短，總黃酮得率高，雜質(zhì)較少，易于分離，但需大量儀器設(shè)備的投入，耗費能量資源，在大批量提取時不夠節(jié)能和經(jīng)濟(jì)［27-31］；溶劑提取法因操作簡便和經(jīng)濟(jì)節(jié)能等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于植物組織中黃酮提取，但在糙米黃酮的提取中存在耗時長、效率低和溶劑殘留等弊端［32-38］，故有必要對其進(jìn)行系統(tǒng)地優(yōu)化。為此，本試驗先圍繞提取溫度、乙醇濃度、提取時間和液料比4個關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，后以單因素優(yōu)化結(jié)果配置組合因素開展響應(yīng)面法優(yōu)化，以期尋求到一種科學(xué)可靠、操作簡便、高效快捷和節(jié)能廉價并適用于大批量提取糙米總黃酮的方法，為篩選高黃酮含量的稻種資源、研究糙米中總黃酮的代謝機(jī)制及開發(fā)高黃酮功能稻米提供切實可行的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胚芽糙米，購于上海聚香樓食品有限公司。留胚率≥94%，每100 g所含營養(yǎng)成分為蛋白質(zhì)8.9 g、脂肪2.2 g、碳水化合物76.7 g、膳食纖維3.6 mg、維生素E 0.93 mg、葉酸25 μg、鉀138 mg、鎂95 mg、鈣27 mg、鐵2.7 mg、鋅1.52 mg。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 單因素試驗 在眾多乙醇提取黃酮法［32，33，36-38］的基礎(chǔ)上，結(jié)合葉寧等［37］提取有色稻糙米中總黃酮方法，設(shè)置提取溫度、乙醇濃度、提取時間和液料比4個單因素試驗（表1）。以提取的胚芽糙米中總黃酮得率最大為標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳提取條件?？傸S酮得率（%）=稀釋倍數(shù)×總黃酮濃度（mg/mL）×提取液體積（mL）÷糙米質(zhì)量（g）÷1 000×100%。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，分別選取提取溫度、乙醇濃度、提取時間和液料比4因素3水平，通過Design Expert （version 6.0.5）設(shè)計響應(yīng)面試驗，具體設(shè)計方案見表 2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，進(jìn)行單因素方差分析和F檢驗，并在SPSS 20.0軟件中采用SSR法對平均數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較（P<0.01）。同樣，響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，再通過Design Expert軟件進(jìn)行方差分析和回歸模型的建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 糙米中乙醇提取總黃酮法的單因素試驗

由圖1a可知，總黃酮得率隨提取溫度的升高呈先增后減的變化，40 ℃下的總黃酮提取率最高（2.785%），極顯著高于50 ℃（2.372%）和60 ℃（2.378%），后兩者又極顯著高于70 ℃（2.100%），30 ℃（1.636%）下最低。這可能是一定程度的溫度升高增大了黃酮類物質(zhì)在提取劑中的溶解度，促進(jìn)其向提取劑釋放，但過高的溫度會使已提取出來的黃酮類物質(zhì)被氧化和破壞而降低總黃酮含量。故40 ℃應(yīng)為乙醇提取糙米總黃酮的最適溫度。

由圖1b可知，總黃酮得率隨乙醇濃度的升高呈先增后減的趨勢，80%乙醇濃度下的總黃酮得率最高（2.565%），顯著高于70%（2.367%），70%乙醇濃度又極顯著高于90%（1.682%）和60%（1.383%），100%乙醇濃度下最低（1.117%）。一般來說，溶劑濃度越高越有利于樣品成分的提取，但溶劑超過一定濃度后會導(dǎo)致樣品中的其他生物成分溶出，影響黃酮的溶解度，且會導(dǎo)致資源上的浪費。從提高效率和節(jié)約資源角度考慮，溶劑濃度不宜過高。因此，選擇80%作為提取糙米總黃酮的最佳乙醇濃度。

由圖1c可知，總黃酮得率在0～16 min隨提取時間延長而極顯著增加，0 min最低（1.630%），8 min為2.239%，16 min為3.018%，而16 min（3.018%）、24 min（3.069%）和32 min（2.984%）下三者無顯著差異。這一現(xiàn)象表明，一定時間內(nèi)，黃酮類物質(zhì)在溶劑中的溶出量增加，但時間過長會使黃酮類物質(zhì)氧化加劇，結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致總黃酮含量減少；且時間越長，糙米粉糊化越大，使得米粉和提取液的接觸面積減小，總黃酮提取效率降低。故可認(rèn)定16 min為乙醇提取糙米總黃酮的最優(yōu)時間。

由圖1d可知，總黃酮得率隨液料比的升高呈極顯著降低趨勢，20∶1液料比下的總黃酮提取率最高（2.865%），極顯著高于30∶1（1.905%），30∶1又極顯著高于40∶1（1.354%），再又極顯著高于50∶1（1.032%），60∶1（0.648%）液料比下最低。造成上述現(xiàn)象的原因可能是，較高的液料比導(dǎo)致樣品中的其他生物成分溶出，擠占了糙米中黃酮的溶出量或影響檢測結(jié)果，且會導(dǎo)致乙醇試劑的浪費。因此，選擇20∶1作為乙醇提取糙米總黃酮的最適液料比。

2.2 糙米中乙醇提取總黃酮法的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken原理對糙米總黃酮的乙醇提取法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗（表2），結(jié)果見表3。通過Design Expert軟件處理數(shù)據(jù)，將響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，可得回歸模型為Y＝1.85 + 0.059 8A - 0.062 5B+0.027 5C-0.446 0D+0.152 0AB-0.041 7AC+0.096 8AD - 0.082 2BC - 0.024 0CD - 0.174 7A2 -

0.003 2B2+0.134 1C2+0.101 6D2。

2.2.2 方差分析及回歸模型的建立 由表4可知，該模型P<0.000 1，回歸模型方程的R2＝0.905 0>0.9，說明模型影響顯著，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了很好的擬合，試驗方法可靠。模型失擬不顯著，說明模型可以用于實際值的預(yù)測。一次項中液料比P<0.000 1，達(dá)極顯著水平；交互項中只有乙醇濃度及液料比的交互影響顯著，其余項影響均不顯著；二次項中，A2項和C2項影響顯著。依據(jù)系數(shù)估計值及各因素P值，可知各因素對糙米總黃酮得率的影響大小順序依次為液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間。剔除影響不顯著的交互項及二次項，可得優(yōu)化模型方程為Y=1.85+0.446 0D-0.198 7BD-0.174 7A2+0.134 1C2。

2.2.3 響應(yīng)面分析及工藝優(yōu)化 交互項中只有乙醇濃度及液料比的交互影響顯著，因此根據(jù)回歸模型繪制出BD 交互項影響的響應(yīng)面及等高線（圖2）。由圖2可知，當(dāng)固定液料比后，總黃酮得率隨乙醇濃度的升高而逐漸增大，隨液料比的增大則逐漸減小。

通過Design Expert軟件分析可知，乙醇提取糙米總黃酮的最佳試驗條件為提取溫度37.80 ℃、乙醇濃度80%、提取時間32 min和液料比20∶1。為了高效便捷地進(jìn)行試驗操作，調(diào)整為提取溫度40 ℃、乙醇濃度80%、提取時間16 min和液料比20∶1，在此條件下平行試驗3次，測得平均總黃酮得率為2.550%，與預(yù)測得率2.591%相比，相對誤差僅為1.58%，說明該模型與實際情況擬合好，即模型可靠。

[2.6][總黃酮得率//%][2.4][2.2][2.0][1.8][1.6][1.4][1.2][90][85][80][70][75][B.乙醇濃度//%][40∶1][35∶1][30∶1][25∶1][20∶1][D.液料比]

固定水平：溫度40 ℃，提取時間24 min

3 討論與結(jié)論

溶劑提取法是利用目標(biāo)成分在不同溶劑中溶解度的差異而對物質(zhì)進(jìn)行分離的一種提取方法，其在食品、醫(yī)藥及保健品領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用［28，39，40］。但此方法因提取材料不同而導(dǎo)致普適性較差，迫使科技人員需根據(jù)自己的測定對象和測定目的進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。因糙米中的總黃酮含量較少，缺乏相關(guān)研究，而且乙醇提取糙米中總黃酮的方法更是極少有人關(guān)注，偶爾涉及黃酮提取時大多是直接采用黃酮在其他材料中的提取方法，是否科學(xué)、可靠和準(zhǔn)確均有待于探究。

3.1 提取溫度

黃酮的提取溫度與提取材料有著密切的關(guān)系，這可能與提取材料的理化性質(zhì)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，胡柚皮［41］、費約果葉［42］和黑米“紫糯 1 號”［37］的黃酮最佳提取溫度為50 ℃；黑桑葉［43］、旋覆花［44］、金銀忍冬果［45］和柑橘［46］的最佳提取溫度均為60 ℃；辣木葉［47］和脫脂草果干粉［48］的最佳提取溫度均為61 ℃；馬蘭［49］、馬鈴薯皮［50］、脫脂火龍果種子［51］和桑葚［52］的最適提取溫度均為70 ℃；銀杏葉［53］和苦蕎的［54］的最適提取溫度均為80 ℃；文冠果［55］、青稞葉［56］、靈菊七葉［57］和米糠［58］的最適提取溫度分別為84、90、92 ℃和94.9 ℃。本研究優(yōu)化的最佳提取溫度為40 ℃，比報道結(jié)果均偏低，這可能是因為以往方法中優(yōu)化材料主要為纖維素等惰性物質(zhì)，而本研究的糙米中70%以上為淀粉，溫度高于53 ℃會顯著糊化，阻止溶劑滲入內(nèi)部，使得提取劑與其接觸面積減小，從而大大降低提取效率，故糙米中黃酮的提取需要相對較低的溫度。提取溫度較低，還有利于節(jié)約能源。

3.2 乙醇濃度

不同植物材料中總黃酮提取時的乙醇濃度差別較小，一般都在50%～80%，如對旋覆花［44］、雪蓮［59］和靈菊七葉［57］提取時分別采用50%、54%和55%的乙醇溶液，對黑桑葉［43］、苦蕎麥［54］和白芍［60］分別選用59.92%、60.00%和62.93%的乙醇溶液，對費約果葉［42］、辣木葉［47］、脫脂草果干粉［48］、馬鈴薯皮［50］和銀杏葉［53］提取時均采用70%乙醇溶液，對金銀忍冬果［45］、米糠［58］和馬蘭［49］提取時分別采用71%、74%和75%乙醇溶液，對脫脂火龍果種子［51］、桑葚［52］和文冠果花［55］提取時均采用80%乙醇溶液，當(dāng)然也有少數(shù)例外的，如青稞葉采用30%乙醇溶液［56］、糙米選用40%乙醇溶液［30］、柑橘選用90%乙醇溶液［46］。本試驗優(yōu)化的乙醇濃度為80%，屬正常范圍，偏高的原因可能與提取溫度40 ℃明顯低于其他研究有關(guān)，低溫下需要更高濃度的乙醇來協(xié)助較短時間內(nèi)的黃酮提取。

3.3 提取時間

不同植物材料中乙醇提取總黃酮的提取時間參差不齊，但大部分集中在60～300 min ［41-56，59，60］，尤其是90～150 min［37， 41，42，46-50，52-54，56］；當(dāng)然也有較短時間的提取，如靈菊七葉［57］為30 min、米糠［58］為41.6 min和脫脂火龍果種子［51］為45 min。本試驗優(yōu)化的提取時間只需16 min，遠(yuǎn)低于以往文獻(xiàn)中的報道，這可能與糙米中主要成分為淀粉有關(guān)，而非其他文獻(xiàn)中的材料所含主要物質(zhì)為纖維素或木質(zhì)素等惰性物質(zhì)，且對黃酮的固持力較大，使其黃酮的提取效率較低，所需時間更長。同時，還可能與乙醇濃度偏高有關(guān)，有利于糙米黃酮溶出，使得黃酮的提取效率更高，導(dǎo)致提取時間更短。

3.4 液料比

不同植物材料中乙醇提取黃酮的液料比相差較大。研究表明，提取苦蕎麥［54］和胡柚皮［41］總黃酮采用最適液料比4∶1和5∶1，提取銀杏葉［53］、旋覆花［44］和金銀忍冬果［45］總黃酮時分別采用液料比10∶1、 15∶1和18.6∶1，提取黑桑葉［43］、柑橘［46］、脫脂草果干粉［48］和馬鈴薯皮［50］的總黃酮時均采用液料比20∶1，提取白芍［60］總黃酮時的最佳液料比為24.86∶1，葉寧等［37］和李俠等［30］提取糙米總黃酮的最優(yōu)液料比分別為25∶1和30∶1，提取費約果葉［42］和馬蘭［45］總黃酮時均采用液料比30∶1，提取文冠果花［55］、靈菊七葉［57］、辣木葉［43］、雪蓮［59］和青稞葉［50］總黃酮時分別采用液料比37∶1、50∶1、51∶1、54∶1和60∶1。本結(jié)果優(yōu)化的液料比為20∶1，相對偏小，可能因為糙米米粉中主要為淀粉，相比其他材料中的主要成分纖維素和脂質(zhì)等物質(zhì)來說，淀粉對黃酮的溶出阻礙更小，更易提取出來。液料比較小，還可節(jié)約試劑和試驗成本，降低溶劑殘留，適用于大批量樣品的提取和測定。

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收稿日期：2023-02-13

基金項目：國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（202210410004）；江西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202010410005）

作者簡介：李 悅（2001-），女，江西安福人，研究方向為水稻品質(zhì)改良，（電話）13879666811（電子信箱）Lily2406942646@163.com；通信作者，

程建峰（1972-），男，江西橫峰人，教授，博士，主要從事功能植物與代謝研究，（電話）15879196148（電子信箱）jfcheng@jxau.edu.cn。

李 悅，程建峰，羅 彤，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化糙米總黃酮提取工藝［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（9）：167-172，215．