CD44通過(guò)影響豬流行性腹瀉病毒復(fù)制調(diào)節(jié)鈉氫交換體3活性

摘 要： 本研究旨在研究CD44（cluster of differentiation 44）對(duì)感染豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）的豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）中鈉氫交換體3（NHE3）表達(dá)及膜轉(zhuǎn)移的影響。以IPEC-J2為細(xì)胞模型，通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒調(diào)控IPEC-J2中CD44的表達(dá)，采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)感染PEDV后不同時(shí)間點(diǎn)IPEC-J2細(xì)胞中PEDV N和NHE3表達(dá)量變化，采用火焰原子吸收法檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度變化。

以IPEC-J2為細(xì)胞模型，采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)感染PEDV后不同時(shí)間點(diǎn)IPEC-J2細(xì)胞中NHE3和PEDV N表達(dá)量變化；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒調(diào)控IPEC-J2中CD44表達(dá)后，采用TCID50和Western blot檢測(cè)PEDV感染后不同時(shí)間點(diǎn)PEDV復(fù)制水平和NHE3蛋白表達(dá)變化，采用火焰原子吸收法檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度變化。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PEDV感染后IPEC-J2細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，24～48 h內(nèi)上升顯著（Plt;0.05），而PEDV N蛋白表達(dá)水平在12～48 h內(nèi)則呈顯著下降趨勢(shì)（Plt;0.05）。此外，CD44重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果顯示，與PEDV感染組相比，過(guò)表達(dá)CD44后感染PEDV組細(xì)胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.05），而干擾CD44后感染PEDV組細(xì)胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表達(dá)水平則顯著上升（Plt;0.05）。以上結(jié)果表明，高表達(dá)CD44具有抑制PEDV復(fù)制的作用，干擾CD44后PEDV復(fù)制增多。同時(shí)，為研究PEDV感染情況下，CD44是否參與了IPEC-J2細(xì)胞中NHE3表達(dá)的調(diào)節(jié)，采用Western blot、RT-qPCR和火焰原子吸收法檢測(cè)了調(diào)節(jié)CD44后膜NHE3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度采用Western blot和火焰原子吸收法檢測(cè)了調(diào)節(jié)CD44后膜NHE3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CD44顯著促進(jìn)了膜NHE3蛋白的表達(dá)和活性（Plt;0.05），細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度逐漸恢復(fù)正常水平。相反，干擾CD44顯著降低了膜NHE3蛋白的表達(dá)和活性（Plt;0.05），細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度呈現(xiàn)失衡狀態(tài)。結(jié)果提示，CD44可能是緩解PEDV引發(fā)仔豬腹瀉的潛在治療靶點(diǎn)，它通過(guò)抑制IPEC-J2細(xì)胞中PEDV的復(fù)制來(lái)增加轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜上的NHE3數(shù)量，從而維持細(xì)胞內(nèi)外Na+運(yùn)轉(zhuǎn)平衡。

關(guān)鍵詞： CD44；豬流行性腹瀉病毒；鈉氫交換體3；鈉離子

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2176-10

收稿日期：中文收稿日期2023-08-08

基金項(xiàng)目：中央高?；緲I(yè)務(wù)基金資助項(xiàng)目（XDJK2020RC001）；重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CYS19137）

作者簡(jiǎn)介：中文作者簡(jiǎn)介王 靜（1999-），女，四川平昌人，碩士生，主要從事動(dòng)物病原微生物與免疫研究，E-mail： 2860235766@qq.com；張淑娟（1998-），女，重慶云陽(yáng)人，碩士生，主要從事動(dòng)物病原微生物與免疫研究，E-mail： 3466396106@qq.com。王靜與張淑娟為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：中文通信作者張興翠，主要從事動(dòng)物病原微生物與免疫研究，E-mail： zhangxc923@163.com；宋振輝，主要從事動(dòng)物病原微生物與免疫研究，E-mail： szh7678@126.com

CD44 Regulates Na+/H+ Exchanger 3 Activity by Influencing Porcine Epidemic Diarrhea Virus Replication

WANG" Jing1， ZHANG" Shujuan1， HU" Xia1， LIU" Xiangyang2， ZHANG" Xingcui1*， SONG" Zhenhui1*

（1.College of Veterinary Medicine， Southwest University， Chongqing 402460， China;

2.College of Animal Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China）

Abstract：" This study aimed to investigate the effect of CD44 （cluster of differentiation 44） on the expression and membrane transfer of Na+/H+ exchanger 3 （NHE3） in porcine intestinal epithelial cells （IPEC-J2） infected with porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）. Using IPEC-J2 as the cell model， the expression of CD44 in IPEC-J2 was regulated by transfecting plasmids， the expression of PEDV N and NHE3 in IPEC-J2 cells at different time points after infection with PEDV was detected by RT-qPCR and Western blot， and the changes of Na+ concentration inside and outside IPEC-J2 cells were detected by flame atomic absorption spectrometry.

Using IPEC-J2 as the cell model， the expression of NHE3 and PEDV N in IPEC-J2 cells at different time points after infection with PEDV was detected by RT-qPCR and Western blot. After the transfection plasmid regulated the expression of CD44 in IPEC-J2， TCID50 and Western blot were used to detect the changes of PEDV replication level and NHE3 protein expression at different time points after PEDV infection， and the changes of Na+ concentration inside and outside IPEC-J2 cells were detected by flame atomic absorption method.

Transcriptome data and cell experimental results showed that compared with the control group， the expression level of CD44 protein and mRNA expression in IPEC-J2 cells after PEDV infection showed an upward trend， and increased significantly within 24-48 h （Plt;0.05）， while the expression level of PEDV N protein decreased significantly within 12-48 h （Plt;0.05）. In addition， the results of CD44 recombinant plasmid transfection experiments showed that the viral titer and PEDV N protein expression levels in cells infected with PEDV group after overexpression of CD44 were significantly reduced （Plt;0.05）， while the viral titer and PEDV N protein expression levels in cells infected with PEDV group after interference with CD44 were significantly increased （Plt;0.05）. These results showed that overexpression of CD44 had the effect of inhibiting PEDV replication， and PEDV replication increased after interfering with CD44. At the same time， in order to investigate whether CD44 participated in the regulation of NHE3 expression in IPEC-J2 cells under PEDV infection， Western blot and flame atomic absorption spectrometry were used to detect the expression level of surface NHE3 protein and the concentration of Na+ inside and outside the cell after regulating CD44. The results showed that overexpression of CD44 significantly promoted the expression of surface NHE3 protein and enhanced its activity （Plt;0.05）， and the concentration of Na+ inside and outside the cell gradually returned to normal levels. In contrast， interference with CD44 significantly reduced the expression and activity of surface NHE3 protein （Plt;0.05）， and the concentration of Na+ inside and outside cells was higher than normal， showing an imbalance. The results suggest that CD44 may be a potential therapeutic target for alleviating PEDV-induced piglet diarrhea， and it increases the amount of NHE3 transferred to the plasma membrane by inhibiting the replication of PEDV in IPEC-J2 cells， thereby maintaining the balance of intracellular and extracellular Na+.

Key words： CD44; porcine epidemic diarrhea virus; NHE3; Na+

*Corresponding authors：ZHANG Xingcui， E-mail： zhangxc923@163.com; SONG Zhenhui， E-mail： szh7678@126.com

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是一種接觸性、高死亡率的腸道傳染病，可導(dǎo)致仔豬腸細(xì)胞大量丟失，小腸絨毛萎縮，與刷狀緣結(jié)合的消化酶減少，從而引發(fā)消化吸收不良，臨床表現(xiàn)為食欲減退、嘔吐和腹瀉，嚴(yán)重時(shí)可能致命。其病原PEDV是套式病毒目、冠狀病毒科、α病毒屬的一種RNA病毒，主要感染新生仔豬，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。動(dòng)物冠狀病毒的不斷變異，加上其龐大的基因組和復(fù)雜的復(fù)制過(guò)程，增加了研究其發(fā)病機(jī)制的難度［1］。從病毒-宿主細(xì)胞蛋白入手有助于全面了解其發(fā)病機(jī)制，同時(shí)有助于確定新的治療靶點(diǎn)。NHE3表達(dá)于分化的腸上皮細(xì)胞頂膜，是腸道中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要介導(dǎo)Na+和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收［2］。在小鼠中，腸道NHE3的缺失會(huì)導(dǎo)致各種局部和全身病變，并影響微生物群的定植［3］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，PEDV感染引起的仔豬腹瀉與機(jī)體中NHE3的活性和表達(dá)下降有關(guān)，NHE3表達(dá)降低導(dǎo)致其向小腸上皮細(xì)胞質(zhì)膜的易位減少，仔豬腸道中Na+-H+交換失調(diào)，從而誘發(fā)腹瀉。同時(shí)，NHE3活性降低表現(xiàn)出對(duì)PEDV感染劑量的依賴性［4-5］。

CD44是一種非激酶細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，屬于軟骨素家族的成員，在多種細(xì)胞中高表達(dá)［6］。CD44 也是細(xì)胞黏附分子 （cell adhesion molecules，CAM） 家族的一員，可以與多種配體如乙酰透明質(zhì)酸HA、骨橋蛋白OPN、膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP等結(jié)合以激活多種信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、提高細(xì)胞存活率、介導(dǎo)細(xì)胞骨架變化，并在細(xì)胞黏附到細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 中發(fā)揮重要作用［7-10］。有研究報(bào)道CD44在小腸上皮細(xì)胞中顯著表達(dá)并且能夠維持腸道穩(wěn)態(tài)［11-12］。CD44的減少導(dǎo)致結(jié)腸縮短并引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。此外，早期研究表明，CD44對(duì)癌癥的發(fā)展具有促進(jìn)作用［13］，CD44還具有抗病毒作用［14］。CD44可以通過(guò)促進(jìn)配體蛋白的組裝和維持正常的內(nèi)皮屏障來(lái)抵抗寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）的侵襲［15］，同時(shí)還能抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV-1）p24抗原的產(chǎn)生［16］。CD44肽PD1能夠抑制登革熱病毒 （DENV） 包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域III與細(xì)胞受體的相互作用，從而產(chǎn)生抗病毒作用［17］。然而，CD44與PEDV之間的關(guān)系有待進(jìn)一步探究。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)CD44具有抗PEDV作用并介導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞中NHE3活性的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)外Na+交換。這能為闡明NHE3活性調(diào)控的分子機(jī)制提供參考，并為探索CD44作為PEDV控制措施的靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株和試劑

豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）由本實(shí)驗(yàn)室凍存，培養(yǎng)細(xì)胞所用的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗和胰蛋白酶購(gòu)自重慶衍慶生物科技有限公司。PEDV-LJX毒株和PEDV N多克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所劉光亮研究員惠贈(zèng)。NHE3兔源多抗、E-cadherin兔源多克隆抗體、CD44兔源多克隆抗體、β-actin鼠源多克隆抗體、HRP偶聯(lián)的山羊抗兔抗體和HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。RNAiso plus、5×PrimeScript RT Master Mix和TB Green Premix Ex Taq II試劑盒購(gòu)自成都微克生物技術(shù)有限公司。Western及IP細(xì)胞裂解液、膜蛋白抽提試劑盒、BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。TransIntro EL Transfection Reagent購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 轉(zhuǎn)錄組分析

按照說(shuō)明書(shū)，使用RNAiso plus提取對(duì)照組和PEDV感染組仔豬小腸組織的總RNA。使用Agilent 2100評(píng)估RNA完整性，RIN值gt;7.0。此外，用5×PrimeScript RT Master Mix將裂解的RNA片段反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于合成U標(biāo)記的第二鏈DNA。用UDG酶處理U標(biāo)記的第二鏈DNA的熱不穩(wěn)定性后，通過(guò)PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物：95℃預(yù)變性3 min，98℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。最后，根據(jù)供應(yīng)商推薦的方案對(duì)Illumina Hiseq 4000（LC Bio，中國(guó)）進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序。

1.3 CD44基因過(guò)表達(dá)和干擾載體質(zhì)粒的鑒定和篩選

CD44基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-CD44和干擾質(zhì)粒pLVX-CD44-2、pLVX-CD44-4的構(gòu)建委托武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司完成。pEGFP-CD44質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ、KpnⅠ雙酶切后進(jìn)行PCR驗(yàn)證。通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFP-CD44/pLVX-CD44質(zhì)粒后的IPEC-J2細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)情況，從而驗(yàn)證過(guò)表達(dá)和干擾重組質(zhì)粒對(duì)CD44表達(dá)的調(diào)控效果，同時(shí)篩選出干擾效率最佳的CD44干擾質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 IPEC-J2細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和感染PEDV

細(xì)胞試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)組，分別為Control組、PEDV感染組、PEDV+pEGFP-CD44組和PEDV+pLVX-CD44組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將狀態(tài)良好的IPEC-J2細(xì)胞按6×105個(gè)·mL-1接種于6孔盤(pán)或60 mm盤(pán)中，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到70%～90%時(shí)使用TransIntro EL Transfection Reagent向PEDV+pEGFP-CD44組和PEDV+pLVX-CD44組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染4.0 μg pEGFP-CD44質(zhì)粒和pLVX-CD44質(zhì)粒，6 h后換成DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。24 h后向PEDV組、PEDV+pEGFP-CD44組和PEDV+pLVX-CD44組細(xì)胞接種PEDV-LJX病毒液（MOI=0.1），1.5 h后換成DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。在接毒后12、24、36、48 h收集上清液和經(jīng)Western及IP細(xì)胞裂解液處理的細(xì)胞裂解液。

1.5 Western blot檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)水平

按照Western及IP細(xì)胞裂解液和膜蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取總蛋白和膜蛋白，一部分蛋白用BCA試劑盒檢測(cè)濃度，余下蛋白加入1/5體積protein loading buffer，混勻，煮沸10 min，用于Western blot。檢測(cè)膜蛋白樣品中的鈣黏蛋白E（E-cadherin），以反映是否有效抽提出IPEC-J2細(xì)胞的膜蛋白。將蛋白質(zhì)樣品等量加入上樣孔中，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA 將蛋白印記濕轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醇激活的PVDF膜上。用TBST稀釋的5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST洗滌5 min×6次后，將PVDF膜與5%脫脂奶粉稀釋的一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5 min×6次，然后將PVDF膜與TBST稀釋的相應(yīng)二抗在室溫下用搖床孵育1 h，TBST洗滌5 min×6次。使用FX5成像系統(tǒng)（VILBER）獲得印跡圖像，使用Image J軟件分析灰度值。

1.6 TCID50測(cè)定上清液中病毒滴度

將Vero細(xì)胞以4×104個(gè)·0.1 mL-1的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞融合度為90%時(shí)，將收集的上清液用含10 μg·mL-1胰蛋白酶的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行10-1～10-6梯度稀釋?zhuān)瑫r(shí)創(chuàng)建空白對(duì)照組，每個(gè)梯度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2條件下孵育，每隔12 h觀察一次每個(gè)孔的細(xì)胞病變并及時(shí)記錄結(jié)果，用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。

1.7 熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞中基因表達(dá)量

使用RNAiso plus和5×PrimeScript RT Master Mix提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）擴(kuò)增并定量目的基因。20 μL反應(yīng)體系的組成：10 μL TB Green Premix Ex Taq II、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物、2 μL cDNA和5 μL無(wú)菌水。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火60℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列如表1所示?；谘h(huán)閾值（Ct）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 火焰原子吸收法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液中Na+濃度

上清液作為細(xì)胞外液，細(xì)胞經(jīng)Western及IP細(xì)胞裂解液裂解后，取上清作為細(xì)胞內(nèi)液。預(yù)先配制Na標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照儀器和計(jì)算機(jī)軟件的操作說(shuō)明依次打開(kāi)乙炔氣閥、儀器和計(jì)算機(jī)軟件，選擇Na元素?zé)舨⒃谟?jì)算機(jī)軟件上設(shè)置參數(shù)，Na的工作波長(zhǎng)為589 nm。點(diǎn)擊尋峰后能量平衡達(dá)到100%時(shí)，用一級(jí)水徹底沖洗點(diǎn)火器，再用標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)溶液校零。首先對(duì)質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.30和0.40 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)Na溶液稀釋液進(jìn)行測(cè)量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后測(cè)量每個(gè)樣品的吸光度（Abs），記錄數(shù)值用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism軟件，文章中的數(shù)據(jù)為三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值（）±s或平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（s）。單因素方差分析（ANOVA）用于確定多組之間的統(tǒng)計(jì)差異。*表示Plt;0.05，差異顯著；**表示Plt;0.01，***表示Plt;0.001，差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV感染后12～48 h內(nèi)，IPEC-J2細(xì)胞中CD44表達(dá)量增多，PEDV N蛋白表達(dá)水平降低

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PEDV感染組仔豬腸細(xì)胞中CD44基因表達(dá)量顯著上調(diào)（圖1A）。作者通過(guò)Western blot和RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)感染PEDV 12、24、36、48 h后IPEC-J2細(xì)胞中CD44的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PEDV感染組中CD44蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)（圖1B、C）。此外，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，PEDV N蛋白表達(dá)水平在12～48 h內(nèi)呈下降趨勢(shì)（圖1D）。在PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞后12～48 h內(nèi)，CD44表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而PEDV N蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，基于此，作者有了如下疑問(wèn)，即在IPEC-J2細(xì)胞中CD44變化是否能影響PEDV復(fù)制。

2.2 CD44重組質(zhì)粒的驗(yàn)證和篩選

pEGFP-CD44重組質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2A所示，在1 500～2 000 bp之間出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的條帶。利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pEGFP-CD44或pLVX-CD44質(zhì)粒后不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后12～72 h內(nèi)，pEGFP-CD44和pLVX-CD44質(zhì)粒在IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)均有明顯的綠色熒光（圖2B）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，pEGFP-CD44轉(zhuǎn)染組的CD44蛋白表達(dá)水平顯著上升（圖2C），pLVX-CD44-2和pLVX-CD44-4均能顯著下調(diào)CD44蛋白表達(dá)水平，且pLVX-CD44-2干擾效果優(yōu)于pLVX-CD44-4（圖2D），故后續(xù)試驗(yàn)均使用干擾質(zhì)粒pLVX-CD44-2轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞。

2.3 在IPEC-J2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD44抑制PEDV 復(fù)制，干擾CD44促進(jìn)PEDV復(fù)制

采用TCID50法測(cè)定病毒滴度，采用Western """blot檢測(cè)PEDV N蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與PEDV感染組相比，過(guò)表達(dá)CD44后感染PEDV組細(xì)胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表達(dá)水平顯著下降（圖3A、C），而干擾CD44后感染PEDV組細(xì)胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表達(dá)水平顯著上升（圖3B、D）。

2.4 PEDV感染情況下，在IPEC-J2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD44促進(jìn)NHE3總蛋白表達(dá)，干擾CD44抑制NHE3總蛋白表達(dá)

與PEDV感染組相比，在PEDV感染后12～48 h內(nèi)，過(guò)表達(dá)CD44后感染PEDV組細(xì)胞總NHE3蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)（圖4A、C），干擾CD44后感染PEDV組細(xì)胞總NHE3蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)（圖4B、D），在12～24 h內(nèi)差異顯著（Plt;0.05）。

2.5 PEDV感染情況下，在IPEC-J2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD44促進(jìn)NHE3膜蛋白表達(dá)，干擾CD44抑制NHE3膜蛋白表達(dá)

與PEDV感染組相比，在12～48 h內(nèi)，過(guò)表達(dá)"" CD44后感染PEDV組細(xì)胞膜NHE3蛋白表達(dá)水平顯著上升（圖5A、C），干擾CD44后感染PEDV組細(xì)胞膜NHE3蛋白表達(dá)水平顯著下降（圖5B、D）。

2.6 PEDV感染情況下，過(guò)表達(dá)CD44調(diào)節(jié)IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度平衡，干擾CD44導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外Na+失衡

首先創(chuàng)建了Na標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖5A可知，在0.05～0.4 μg·mL-1范圍內(nèi)的吸光度（Abs）與Na濃度具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.511 2x+0.009 2，R2=0.998 7。火焰原子吸收法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相似，單獨(dú)過(guò)表達(dá)或干擾CD44組細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度在12～48 h內(nèi)無(wú)明顯變化，且細(xì)胞內(nèi)Na+濃度始終高于細(xì)胞外Na+濃度。與對(duì)照組相比，PEDV感染組細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度均高于正常水平，且隨感染時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)（圖6B～E）。與PEDV感染組相比，過(guò)表達(dá)CD44后感染PEDV組細(xì)胞內(nèi)Na+濃度在24～48 h內(nèi)有所下降，48 h時(shí)細(xì)胞外Na+濃度接近對(duì)照組（圖6B、C）。與PEDV感染組相比，干擾CD44后感染PEDV組細(xì)胞內(nèi)Na+濃度在12～36 h內(nèi)有所上升，細(xì)胞外Na+濃度呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)且高于正常水平（圖6D、E）。綜上所述，在正常生理?xiàng)l件下，CD44的變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外Na+濃度的變化無(wú)顯著影響。但在PEDV感染情況下，過(guò)表達(dá)CD44可導(dǎo)致IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度逐漸向正常水平回降，從而使腸道滲透壓恢復(fù)平衡，干擾CD44則導(dǎo)致IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度升高，腸道滲透壓失衡。

3 討 論

CD44是一種復(fù)雜的宿主跨膜糖蛋白，在小腸細(xì)胞中廣泛分布和表達(dá)，該蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中的配體和信號(hào)受體如透明質(zhì)酸、纖連蛋白和層黏連蛋白相互作用［18-20］。此外，一些宿主跨膜蛋白已被證明與病毒復(fù)制有關(guān)，但個(gè)別跨膜蛋白是前病毒因子還是抗病毒靶蛋白還需要進(jìn)一步研究。CD44促進(jìn)腫瘤發(fā)生和病毒感染，并在某些病毒性疾病如HPV［21］和HBV［22］的發(fā)病過(guò)程中加劇損傷并促進(jìn)病毒復(fù)制，但在ZIKV［15］、HCV［23］和HIV-1［14］感染過(guò)程中，它能夠捕獲病毒并產(chǎn)生抗病毒作用。因此，CD44在宿主防御病原微生物方面的功能差異歸因于病原體種類(lèi)。

NHE3在胃腸道的頂膜中高度表達(dá)，并且在Na+依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中具有重要的調(diào)控作用。在正常生理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上的NHE3蛋白數(shù)量增多，NHE3的活性增加，依靠Na+-K+-ATP酶提供能量，使Na+和H+按等比例交替轉(zhuǎn)運(yùn)，從而維持Na+在細(xì)胞內(nèi)外的動(dòng)態(tài)平衡。作者的初步研究表明，PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞后12～48 h內(nèi)，PEDV N蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，而CD44蛋白的表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，因此作者推測(cè)CD44可能在PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮抗病毒作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證CD44與PEDV之間的關(guān)系，構(gòu)建了CD44過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-CD44和CD44干擾質(zhì)粒pLVX-CD44，用于研究調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞中CD44表達(dá)對(duì)PEDV復(fù)制的影響。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CD44能夠抑制PEDV在IPEC-J2細(xì)胞中的復(fù)制水平，而干擾CD44后PEDV在IPEC-J2細(xì)胞中的復(fù)制水平上升。因此，CD44可能是一種抗PEDV蛋白。課組先前的研究表明，PEDV引發(fā)的腹瀉與仔豬腸道組織細(xì)胞中NHE3的流動(dòng)性和表達(dá)量降低有關(guān)［4］。NHE3的一個(gè)重要生物學(xué)作用是維持細(xì)胞膜兩側(cè)的Na+濃度梯度，有助于維持腸道滲透壓平衡。CD44可以抑制PEDV復(fù)制，但PEDV復(fù)制被CD44抑制后NHE3活性及細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度的變化尚不清楚。后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，過(guò)表達(dá)CD44后抑制PEDV復(fù)制，PEDV病毒載量處于較低水平，機(jī)體通過(guò)上調(diào)NHE3蛋白表達(dá)，代償性維持細(xì)胞內(nèi)外Na+運(yùn)轉(zhuǎn)平衡。而在CD44干擾條件下，PEDV的復(fù)制不能被抑制，PEDV病毒載量處于較高水平，導(dǎo)致細(xì)胞中NHE3蛋白下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度嚴(yán)重失調(diào)。

4 結(jié) 論

CD44通過(guò)影響PEDV復(fù)制水平來(lái)調(diào)控膜NHE3表達(dá)，NHE3在細(xì)胞膜上的表達(dá)又與細(xì)胞內(nèi)外Na+交換相關(guān)。因此，可以CD44為靶標(biāo)抑制PEDV復(fù)制，使NHE3向質(zhì)膜的移動(dòng)數(shù)量增多，Na+轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)，維持細(xì)胞內(nèi)外Na+濃度平衡，從而緩解仔豬腹瀉癥狀。綜上所述，CD44可能是潛在的抗PEDV靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ YUAN L X， FUNG T S， HE J W， et al. Modulation of viral replication， apoptosis and antiviral response by induction and mutual regulation of EGR and AP-1 family genes during coronavirus infection［J］. Emerg Microbes Infect， 2022， 11（1）：1717-1729.

［2］ NIKOLOVSKA K， SEIDLER U E， STOCK C. The role of plasma membrane sodium/hydrogen exchangers in gastrointestinal functions： proliferation and differentiation， fluid/electrolyte transport and barrier integrity［J］. Front Physiol， 2022， 13：899286.

［3］ XUE J X， DOMINGUEZ RIEG J A， THOMAS L， et al. Intestine-specific NHE3 deletion in adulthood causes microbial dysbiosis［J］. Front Cell Infect Microbiol， 2022， 12：896309.

［4］ SONG Z H， YAN T， RAN L， et al. Reduced activity of intestinal surface Na+/H+ exchanger NHE3 is a key factor for induction of diarrhea after PEDV infection in neonatal piglets［J］. Virology， 2021， 563：64-73.

［5］ NIU Z， ZHANG Y L， KAN Z F， et al. Decreased NHE3 activity in intestinal epithelial cells in TGEV and PEDV-induced piglet diarrhea［J］. Vet Microbiol， 2021， 263：109263.

［6］ LIU K L， MCCUE W M， YANG C W， et al. Combinatorial synthesis of a hyaluronan based polysaccharide library for enhanced CD44 binding［J］. Carbohydr Polym， 2023， 300：120255.

［7］ HASSN MESRATI M， SYAFRUDDIN S E， MOHTAR M A， et al. CD44：a multifunctional mediator of cancer progression［J］. Biomolecules， 2021， 11（12）：1850.

［8］ HO N T， LIN S W， LEE Y R， et al. Osteopontin splicing isoforms contribute to endometriotic proliferation， migration， and epithelial-mesenchymal transition in endometrial epithelial cells［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（23）：15328.

［9］ ZHOU Y， HE M. GSN synergies with actin-related transfer molecular chain to promote invasion and metastasis of HCC［J］. Clin Transl Oncol， 2023， 25（2）：482-490.

［10］ OUHTIT A， RIZEQ B， SALEH H A， et al. Novel CD44-downstream signaling pathways mediating breast tumor invasion［J］. Int J Biol Sci， 2018， 14（13）：1782-1790.

［11］ LIU A J， PAN Q， WANG S Y， et al. Identification of chicken CD44 as a novel B lymphocyte receptor for infectious bursal disease virus［J］. J Virol， 2022， 96（6）：e0011322.

［12］ WALTER R J， SONNENTAG S J， MUNOZ-SAGREDO L， et al. Wnt signaling is boosted during intestinal regeneration by a CD44-positive feedback loop［J］. Cell Death Dis， 2022， 13（2）：168.

［13］ JAISWAL A， SINGH R. Loss of epidermal homeostasis underlies the development of squamous cell carcinoma［J］. Stem Cell Rev Rep， 2023， 19（3）：667-679.

［14］ MURAKAMI T， ONO A. Roles of virion-incorporated CD162 （PSGL-1）， CD43， and CD44 in HIV-1 infection of T cells［J］. Viruses， 2021， 13（10）：1935.

［15］ PUERTA-GUARDO H， TABATA T， PETITT M， et al. Zika virus nonstructural protein 1 disrupts glycosaminoglycans and causes permeability in developing human placentas［J］. J Infect Dis， 2020， 221（2）：313-324.

［16］ MAHAJAN K， ROJEKAR S， DESAI D， et al. Layer-by-layer assembled nanostructured lipid carriers for CD-44 receptor-based targeting in HIV-infected macrophages for efficient HIV-1 inhibition［J］. AAPS PharmSciTech， 2021， 22（5）：171.

［17］ RECALDE-REYES D P， RODRGUEZ-SALAZAR C A， CASTAO-OSORIO J C， et al. PD1 CD44 antiviral peptide as an inhibitor of the protein-protein interaction in dengue virus invasion［J］. Peptides， 2022， 153：170797.

［18］ CHEN H T， FANG Z， SONG M D， et al. Mitochondrial targeted hierarchical drug delivery system based on HA-modified liposomes for cancer therapy［J］. Eur J Med Chem， 2022， 241：114648.

［19］ KOKORETSIS D， MANIAKI E K， KYRIAKOPOULOU K， et al. Hyaluronan as \"Agent Smith\" in cancer extracellular matrix pathobiology： Regulatory roles in immune response， cancer progression and targeting［J］. IUBMB Life， 2022， 74（10）：943-954.

［20］ DALIMOT J J， KLEI T R L， BEUGER B M， et al. Malaria-associated adhesion molecule activation facilitates the destruction of uninfected red blood cells［J］. Blood Adv， 2022， 6（21）：5798-5810.

［21］ SUWIWAT S， TUNGSINMUNLONG K， SIRIAUNGKUL S. Expression of CD44v6 and RCAS1 in uterine cervical carcinoma infected with human papillomavirus and its effect on cell proliferation and differentiation［J］. Asian Pac J Cancer Prev， 2022， 23（7）：2431-2439.

［22］ XIAO Y W， CAO J N， ZHANG Z， et al. Hepatitis B virus pregenomic RNA reflecting viral replication in distal non-tumor tissues as a determinant of the stemness and recurrence of hepatocellular carcinoma［J］. Front Microbiol， 2022， 13：830741.

［23］ ZHONG L， LIU Y Y， XU L， et al. Exploring the relationship of hyaluronic acid molecular weight and active targeting efficiency for designing hyaluronic acid-modified nanoparticles［J］. Asian J Pharm Sci， 2019， 14（5）：521-530.

（編輯 白永平）