昆蟲鈉離子通道的研究進(jìn)展

吳少英, 段文波, 李 芬, 楊 磊, 王 顥, 王力奎

(海南大學(xué)三亞南繁研究院, 海南三亞 572025)

伴隨著從低等無(wú)脊椎動(dòng)物到高等脊椎動(dòng)物的進(jìn)化，昆蟲電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channel)也經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的演化，其蛋白結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動(dòng)物類似(Littleton and Ganetzky, 2000; Zakon, 2012)。相較于哺乳動(dòng)物有9個(gè)及以上的鈉離子通道基因，在目前已經(jīng)完成基因組測(cè)序的143種昆蟲中，除了蚜蟲有2個(gè)鈉離子通道基因(Ameyetal., 2015; Zuoetal., 2016; Jiangetal., 2017; 段文波等, 2020; 王顥等, 2020)外，其他昆蟲均只有1個(gè)鈉離子通道基因(Dongetal., 2014; Yinetal., 2016; Wuetal., 2017)。盡管昆蟲鈉離子通道基因數(shù)量較少，但其可通過可變剪切和RNA編輯等方式豐富其鈉離子通道的生理功能。比如去除可變剪切外顯子b后，綠盲蝽Apolyguslucorum、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和德國(guó)小蠊Blattellagermanica等昆蟲鈉離子通道在雙電極電壓鉗系統(tǒng)下的電壓信號(hào)迅速增強(qiáng)(Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。作為很多動(dòng)物源和植物源毒素以及擬除蟲菊酯類殺蟲劑等化合物的作用靶標(biāo)，昆蟲鈉離子通道的突變可導(dǎo)致靶標(biāo)敏感性顯著下降。研究表明，刪除德國(guó)小蠊鈉離子通道基因可變剪切位點(diǎn)G1111后，其對(duì)Ⅱ型擬除蟲菊酯——溴氰菊酯的敏感性顯著下降，但是對(duì)Ⅰ型擬除蟲菊酯——芐氯菊酯的敏感性并沒有改變(Duetal., 2009a)。黑腹果蠅胚胎中可變剪切f占所有剪切體的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成蟲，但在胚胎中j的出現(xiàn)率僅為10%，在成蟲中卻高達(dá)89%(Songetal., 2004)?？勺兗羟羞€可以調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮。例如，黑腹果蠅鈉離子通道可變剪切f可導(dǎo)致電壓依賴性鈉離子通道活化并使其向超極化方向偏移(Linetal., 2009)。由上述可知，昆蟲鈉離子通道可變剪切不僅影響其表達(dá)量，還可改變其電壓依賴程度。此外，RNA編輯也會(huì)改變鈉離子通道的門控特性。如德國(guó)小蠊BgNav1-1基因U至C的RNA編輯(核苷酸變化T3854C，氨基酸變化L1285P)，可導(dǎo)致鈉離子通道的激活和失活并向去極化方向偏移(Liuetal., 2004)。綜上，昆蟲鈉離子通道基因序列或者表達(dá)上的微小差別，均能引起其行為反應(yīng)的巨大差異。

神經(jīng)毒劑與昆蟲鈉離子通道相互結(jié)合位點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Catterall(1992)推測(cè)每一種通道只有一個(gè)藥劑結(jié)合位點(diǎn)。O′Reilly等(2006)以鉀離子通道晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過計(jì)算機(jī)建模，模擬家蠅Muscadomestica鈉離子通道與擬除蟲菊酯殺蟲劑相互作用的分子模型，認(rèn)為其只有一個(gè)結(jié)合區(qū)域，但在這個(gè)區(qū)域外卻發(fā)現(xiàn)了更多的突變位點(diǎn)。早在2000年Vais等曾經(jīng)預(yù)測(cè)，昆蟲鈉離子通道上存在兩個(gè)擬除蟲菊酯殺蟲劑結(jié)合位點(diǎn)(Vaisetal., 2000)。2013年董珂課題組關(guān)于埃及伊蚊Aedesaegypti鈉離子通道突變體的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)位點(diǎn)突變能導(dǎo)致鈉離子通道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化(Duetal., 2013)。雖然昆蟲鈉離子通道與不同擬除蟲菊酯藥劑有雙結(jié)合位點(diǎn)的共性，但它們對(duì)相同擬除蟲菊酯藥劑的選擇性存在差異。Wu等(2017)發(fā)現(xiàn)在蜂-螨防治過程中使用的一種擬除蟲菊酯藥劑——氟胺氰菊酯，它對(duì)狄斯瓦螨Varroadestructor等其他昆蟲毒性高，但對(duì)蜂毒性卻很低，從而引起蜂對(duì)氟胺氰菊酯的敏感性降低，這是由于熊蜂Bombusimpatiens鈉離子通道氨基酸位點(diǎn)的特異性導(dǎo)致。綜上，國(guó)內(nèi)外科研人員在過去幾十年間對(duì)鈉離子通道和擬除蟲菊酯殺蟲劑作用于鈉離子通道的分子機(jī)理研究方面已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。

因此，基于昆蟲鈉離子通道多物種適應(yīng)性進(jìn)化，進(jìn)一步探索其結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于研發(fā)安全、高效的鈉離子通道靶向型化學(xué)藥劑，并以此防治田間害蟲有重要推動(dòng)作用。

1 昆蟲鈉離子通道基因序列和結(jié)構(gòu)

1.1 昆蟲鈉離子通道基因鑒定、外源表達(dá)和結(jié)構(gòu)解析

Loughney等(1989)從黑腹果蠅中首次克隆出昆蟲鈉離子通道基因DmNav，由于該基因位于黑腹果蠅溫度敏感的麻痹區(qū)域(paralysis locus)，因此又將其通稱為para。DmNav與哺乳動(dòng)物鈉離子通道α亞基序列相似性極高，即高度保守(Loughneyetal., 1989; Soderlund, 2005; Dong, 2007)。隨后科學(xué)家們利用非洲爪蟾Xenopuslaevis卵母細(xì)胞對(duì)DmNav展開功能研究，這奠定了昆蟲鈉離子通道分子、功能和藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)(Fengetal., 1995; Warmkeetal., 1997)。目前，已經(jīng)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中成功表達(dá)的昆蟲鈉離子通道包括黑腹果蠅鈉離子通道DmNav(Loughneyetal., 1989)、家蠅鈉離子通道Vssc1(Smithetal., 1997)、德國(guó)小蠊B.germanica鈉離子通道BgNav(Liuetal., 2000; Tanetal., 2002)、狄斯瓦螨鈉離子通道VdNav(Duetal., 2009b)、埃及伊蚊鈉離子通道AaNav(Duetal., 2013)、西方蜜蜂Apismellifera鈉離子通道AmNav1(Badaroudineetal., 2015)、熊蜂鈉離子通道BiNav(Wuetal., 2017)、綠盲蝽鈉離子通道AlNav(Zhangetal., 2020)、褐飛虱Nilaparvatalugens鈉離子通道NlNav(Sunetal., 2020)和斑翅果蠅Drosophilasuzukii鈉離子通道DsNav(未發(fā)表)，這些昆蟲鈉離子通道均表現(xiàn)出復(fù)極化、失活、去激活和失活后恢復(fù)等主要的門控特性。上述基于雙電極電壓鉗系統(tǒng)的研究驗(yàn)證了部分昆蟲鈉離子通道可變剪切和RNA編輯的功能，解釋了昆蟲鈉離子通道部分突變位點(diǎn)與擬除蟲菊酯藥劑抗藥性的互作關(guān)系。此外，還可以利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)尚未鑒定到的昆蟲鈉離子通道展開功能研究。

冷凍電鏡開辟了離子通道三維結(jié)構(gòu)研究的先河，研究人員最初以鉀離子通道的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過計(jì)算機(jī)建模，模擬昆蟲鈉離子通道的空間結(jié)構(gòu)(O′Reillyetal., 2006)。2011年第一個(gè)原核生物鈉離子通道結(jié)構(gòu)NavAb的晶體結(jié)構(gòu)被解析，2012年《Science》雜志同一期報(bào)道了原核生物鈉離子通道NavRh失活態(tài)(inactivated state)和NavAb另外兩種失活態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)(Payandehetal., 2011; Payandehetal., 2012; Zhangetal., 2012)。2017年科學(xué)家首次從真核生物美洲大蠊Periplanetaamericana中得到鈉離子通道PaNav的結(jié)晶體-EM結(jié)構(gòu)，其包括一個(gè)與VSD1區(qū)域比鄰的保守型氨基端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)與domain Ⅲ-domain Ⅳ-linker鏈接在一起的羧基端結(jié)構(gòu)域(Shenetal., 2017)。這是昆蟲鈉離子通道里程碑式的發(fā)現(xiàn)，并為進(jìn)一步研究鈉離子通道和與之有關(guān)的鈣離子通道功能奠定了重要基礎(chǔ)。Shen等(2018)發(fā)現(xiàn)美洲大蠊PaNav與河豚毒素和蛤蚌毒素結(jié)合在選擇性濾器入口處，而與蜘蛛毒素結(jié)合在孔道結(jié)構(gòu)域之間的外側(cè)部位。隨后，Yan等(2017)采用電鏡法解析了電鰻鈉離子通道EeNav1.4的結(jié)構(gòu)，并首次揭示了其β亞基的結(jié)構(gòu)及其與α亞基的相互作用。上述這些研究表明冷凍電鏡技術(shù)不僅有助于解析昆蟲鈉離子通道多個(gè)不同狀態(tài)的構(gòu)象，還有助于闡明昆蟲鈉離子通道結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化過程。

1.2 昆蟲鈉離子通道α亞基

昆蟲鈉離子通道由一個(gè)分子量為260 kD左右的α亞基和5個(gè)輔助小亞基組成，將α亞基單獨(dú)注射入爪蟾卵母細(xì)胞中，其具有鈉離子通道活性，而另外5個(gè)輔助亞基則起到調(diào)節(jié)鈉離子通道表達(dá)或者調(diào)節(jié)鈉離子通道門控的作用(Armstrong and Bezanilla, 1997; Goldin, 2002)。鈉離子通道α亞基是跨膜糖蛋白，由domain Ⅰ, domain Ⅱ, domain Ⅲ和domain Ⅳ 4個(gè)同源性極高的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè) N端及C端組成(圖1: A)。4個(gè)結(jié)構(gòu)域相互圍繞形成中央孔洞，各個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間由接頭(linker)相互連接，形成一個(gè)四聯(lián)體，構(gòu)成鈉離子通道的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(Dong, 2007)。每個(gè)結(jié)構(gòu)域由6個(gè)疏水性跨膜螺旋體(S1-S6)組成，S1-S4構(gòu)成電壓感受模塊，S5, S6和連接S5及S6段的LOOP(P-LOOP)形成鈉離子通道的孔模塊。每個(gè)S4跨膜螺旋體包含帶正電荷的氨基酸殘基的重復(fù)基序，其次是兩個(gè)疏水殘基，構(gòu)成鈉離子通道電壓傳感器。為響應(yīng)膜去極化，S4開始向外移動(dòng)，且構(gòu)象發(fā)生變化，通道打開，導(dǎo)致鈉離子通道失活。在通道打開和關(guān)閉期間，S4和S5段由短細(xì)胞內(nèi)連接子(L45)連接(Catterall, 2000)。

圖1 非蚜蟲類昆蟲(A)和蚜蟲(B)電壓門控鈉離子通道的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(改自Jiang et al., 2017)

每個(gè)同源結(jié)構(gòu)域的S4跨膜區(qū)都含有一個(gè)保守元件，其含有帶正電荷的精氨酸或賴氨酸重復(fù)基序(repeated motif)，這些氨基酸分別由2個(gè)中性氨基酸隔開，形成通道的電壓敏感元件，即電壓感受器。當(dāng)細(xì)胞去極化時(shí)，這些正電荷能檢測(cè)膜電場(chǎng)，導(dǎo)致鈉離子通道4個(gè)結(jié)構(gòu)域的S4跨膜片段向膜外移動(dòng)，帶動(dòng)S1, S2和S3移動(dòng)，引起鈉離子通道構(gòu)象變化，從而實(shí)現(xiàn)跨膜口和通道的開啟。通道開放伴隨著大量鈉離子內(nèi)流，進(jìn)而產(chǎn)生門控電流(gating current)，數(shù)毫秒后，S4往后移動(dòng)，帶動(dòng)S1, S2和S3恢復(fù)原位，激活閘門和離子通道關(guān)閉。S5和S6兩個(gè)跨膜區(qū)參與形成鈉離子通道親水孔道，即4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域的8個(gè)S5和S6跨膜片段共同圍繞形成細(xì)胞親水孔道(Dongetal., 2014)。

鈉離子通道結(jié)構(gòu)域P-LOOP環(huán)上分別有D, E, K和A 4個(gè)氨基酸殘基，它們決定了鈉離子通道的選擇性，昆蟲鈉離子通道domain Ⅲ和Ⅳ之間還存在一個(gè)失活閥門MFM(Met-Phe-Met)，DEKA和MFM是判斷普通昆蟲鈉離子通道α亞基的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(Dongetal., 2014)。哺乳動(dòng)物鈉離子通道中失活閥門是IFM，IFM快失活基序可與domain Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)域中6-TM的S4-S5 linker和S6作用，導(dǎo)致鈉離子通道快速失活，推測(cè)其可能限制了鈉離子通道的開放構(gòu)象，從而發(fā)揮作用(Yanetal., 2017; Panetal., 2018)。由上述可知，昆蟲鈉離子通道失活閥門MFM與哺乳動(dòng)物鈉離子通道IFM起類似作用。

半翅目蚜蟲類鈉離子通道結(jié)構(gòu)較為特殊，其分別由分子量為130 kD和 110 kD左右的兩個(gè)α亞基組成(圖1: B)，且選擇性過濾器內(nèi)圈關(guān)鍵氨基酸并非常見的DEKA，而是DENS，其外圈關(guān)鍵氨基酸也并非其他生物常見的EEQD，而是EEED。蚜蟲鈉離子通道domain Ⅲ和Ⅳ間存在MFM元件，其在昆蟲中十分保守，是失活門控關(guān)鍵氨基酸(Ameyetal., 2015; Zuoetal., 2016; Jiangetal., 2017; 段文波等, 2020; 王顥等, 2020)。電生理數(shù)據(jù)顯示當(dāng)黑腹果蠅鈉離子通道的“DEKA”被“DENS”取代后，其對(duì)河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)的敏感性降低，這與蚜蟲對(duì)TTX不敏感的生物測(cè)定結(jié)果一致，推測(cè)與其鈉離子通道選擇性過濾器DENS相關(guān)，且可能是進(jìn)化或遺傳漂變產(chǎn)生的結(jié)果(Ameyetal., 2015)。而哺乳動(dòng)物鈉離子通道可分為TTX敏感型和TTX不敏感型兩大類，其中前一類型分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)廣于后一類型(Ogata and Tatebayashi, 1993)。

1.3 昆蟲鈉離子通道輔助亞基

昆蟲TipE蛋白和TipE同源蛋白(TEH1-4)作為輔助亞基，在調(diào)控鈉離子通道表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。二者均由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、連接兩個(gè)跨膜區(qū)的細(xì)胞外連接肽和細(xì)胞內(nèi)N端及C端氨基酸殘基構(gòu)成。不同昆蟲TipE蛋白和TEH蛋白在調(diào)控鈉離子通道門控性質(zhì)時(shí)既有相似之處，也存在差異。研究表明多種昆蟲的TipE和TEH1-2均可以促進(jìn)鈉離子通道α亞基的表達(dá)，進(jìn)而參與其動(dòng)力學(xué)和電壓門控的調(diào)節(jié)(Fengetal., 1995; Warmkeetal., 1997; Leeetal., 2000; Duetal., 2013)。將黑腹果蠅的DmNav9-1, DmNav22和DmNav26分別與TipE和TEH1-4共表達(dá)，結(jié)果表明TipE, TEH1和TEH2均能促進(jìn)鈉離子通道的表達(dá)，其中TipE可使其向超級(jí)化方向移動(dòng)，而TEH1則使鈉離子通道的激活、快速失活和慢失活都往超級(jí)化方向移動(dòng)；反之，TEH3和TEH4產(chǎn)生的外向電流對(duì)鈉離子通道的表達(dá)有抑制作用，它們是否也參與其他離子通道的門控調(diào)控仍需做進(jìn)一步探究(Wangetal., 2013, 2015)。有研究指出美洲大蠊TipE與黑腹果蠅鈉離子通道α亞基共表達(dá)所產(chǎn)生的電流比黑腹果蠅鈉離子通道α亞基與TipE共表達(dá)產(chǎn)生的電流大，但美洲大蠊TipE與α亞基共表達(dá)卻沒有電流出現(xiàn)(Bourdinetal., 2015)。TipE和TEH1-4在不同組織中的表達(dá)模式也存在差異，其中TEH1只在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，而TipE和TEH2-4除在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)外，還在其他組織，如脂肪體、馬氏小管、腸道、唾液腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和體壁肌肉中表達(dá)(Derstetal., 2006)。

目前人類鈉離子通道NaV1.4 α亞基與β1亞基的相互作用已經(jīng)通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法得到解析(圖2)，人類鈉離子通道NaV1.4 α亞基與β1亞基的結(jié)合部位位于Domain Ⅲ區(qū)域。NaV1.4 α亞基Domain Ⅲ與Domain Ⅳ區(qū)域的電壓傳感器是完全重疊的，但是Domain Ⅰ或Domain Ⅱ卻沒有表現(xiàn)出此類特性。通過模擬其空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)人鈉離子通道NaV1.4 α亞基與細(xì)菌NaChBac的Domain Ⅲ結(jié)構(gòu)高度相似(Molinaroloetal., 2018)。因此，哺乳動(dòng)物晶體結(jié)構(gòu)的解析對(duì)昆蟲輔助亞基功能研究有重要借鑒意義。

圖2 鈉離子通道NaV1.4 α/β1亞基互作結(jié)構(gòu)模型(引自Molinarolo et al., 2018)

2 昆蟲鈉離子通道可變剪切和RNA編輯

哺乳動(dòng)物有9個(gè)不同的鈉離子通道α亞基，它們?cè)诓煌愋图?xì)胞、組織和發(fā)育階段表達(dá)，且在特定細(xì)胞中行使獨(dú)特的生理功能(Catterall, 2000; Goldinetal., 2000; Yu and Catterall, 2003)。而絕大部分昆蟲只有1個(gè)或者2個(gè)鈉離子通道基因，其如何能用數(shù)量甚少的鈉離子通道基因行使復(fù)雜的生理功能仍是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)與難點(diǎn)。研究表明綠盲蝽和黑腹果蠅等昆蟲的鈉離子通道存在大量的可變剪切和RNA編輯(Loughneyetal., 1989; Thackeray and Ganetzky, 1994, 1995; Hanrahanetal., 2000; Reenanetal., 2000; Olsonetal., 2008; Zhangetal., 2020)，這些可變剪切和RNA編輯有助于鈉離子通道行使門控通道和藥理學(xué)功能。

2.1 昆蟲鈉離子通道可變剪切

可變剪切(alternative splicing)是一種基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，可增加mRNA的多樣性。昆蟲不同組織部位和不同發(fā)育階段可以產(chǎn)生多個(gè)不同的可變剪切轉(zhuǎn)錄本，從而增加鈉離子通道基因的多樣性，使其呈現(xiàn)出相似、差異或者互斥的功能，進(jìn)而導(dǎo)致鈉離子通道門控和藥理學(xué)性質(zhì)等方面的差異(Tanetal., 2002)。

Lee等最先報(bào)道了黑腹果蠅鈉離子通道存在11種可變剪切外顯子，其中外顯子a, b, e, f, h, i和j位于細(xì)胞內(nèi)接頭上，4個(gè)互斥外顯子c/d和k/l位于跨膜區(qū)，這與其他昆蟲鈉離子通道結(jié)構(gòu)(Leeetal., 2002; Sonodaetal., 2008)類似。但同種昆蟲不同部位和不同發(fā)育階段產(chǎn)生的選擇性剪切類型或出現(xiàn)的頻率不同。如，黑腹果蠅鈉離子通道在胚胎中的剪切體類型是27種，而在成蟲期是29種(Olsonetal., 2008; Linetal., 2009)。外顯子j在黑腹果蠅胚胎和成蟲中出現(xiàn)的頻率分別為10%和89%，而外顯子f在胚胎中的出現(xiàn)頻率則顯著高于成蟲。黑腹果蠅、綠盲蝽和德國(guó)小蠊鈉離子通道中外顯子b的出現(xiàn)頻率分別是60%, 55%和20%(Linetal., 2009)。另外，黑腹果蠅存在外顯子c和d，而德國(guó)小蠊和西方蜜蜂中只存在外顯子c而沒有外顯子d；反之，綠盲蝽和赤擬谷盜Triboliumcastaneum則只存在外顯子d，而沒有外顯子c(Daviesetal., 2007; Zhangetal., 2020)?？勺兗羟胁粌H參與鈉離子通道的表達(dá)調(diào)控，還可改變鈉離子通道激活和失活電壓。如，不含外顯子b的黑腹果蠅、綠盲蝽和德國(guó)小蠊鈉離子通道在雙電極電壓鉗系統(tǒng)下的表達(dá)速率顯著加快(Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。研究表明，除綠盲蝽和赤擬谷盜僅含有互斥子l外，大部分昆蟲，如桃蚜Myzuspersicae等鈉離子通道均含有k/l兩個(gè)保守性很高的互斥子(Daviesetal., 2007; Zhangetal., 2020)。黑腹果蠅鈉離子通道中的互斥外顯子k和l與電流的持續(xù)性產(chǎn)生相關(guān)(Linetal., 2009)，即含有外顯子l的鈉離子通道神經(jīng)活動(dòng)比含有外顯子k的鈉離子通道更加活躍。德國(guó)小蠊與黑腹果蠅k/l同源的外顯子分別是G1/G2，除G1和G2外，其還存在一個(gè)與哺乳動(dòng)物類似的含終止密碼子的外顯子G3，或參與生物體興奮傳導(dǎo)(Songetal., 2004)。此外，家蠶Bombyxmori和褐色桔蚜Toxopteracitricid也存在外顯子a, f, h和i，但這些在所有鈉離子通道剪切體中均存在，因此不屬于可變剪切(Shaoetal., 2009; Jiangetal., 2017)。Davies等(2007)曾報(bào)道外顯子e僅存在部分雙翅目昆蟲中，后續(xù)褐色桔蚜的研究也表明此物種確實(shí)沒有外顯子e(Daviesetal., 2007; Jiangetal., 2017)。綜上，昆蟲鈉離子通道可變剪切可能出現(xiàn)在昆蟲的不同部位及發(fā)育階段，從而行使不同功能，但某個(gè)可變剪切的具體功能仍需做進(jìn)一步探究。

2.2 昆蟲鈉離子通道RNA編輯

RNA編輯是mRNA在轉(zhuǎn)錄水平上通過堿基插入、缺失或者替換從而引起氨基酸改變，擴(kuò)大了生物體遺傳信息，有利于其更好地適應(yīng)外界環(huán)境。昆蟲鈉離子通道存在兩種RNA編輯形式：一種是A至I編輯，另一種是U至C編輯。A至I編輯是腺苷A去氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤I，這種編輯方式在昆蟲中出現(xiàn)頻率很高。RNA編輯最初發(fā)現(xiàn)于錐蟲線粒體中(Benneetal., 1986)，之后在黑腹果蠅、綠盲蝽和德國(guó)小蠊等昆蟲中相繼被報(bào)道(Palladinoetal., 2000; Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。在黑腹果蠅鈉離子通道基因中已經(jīng)鑒定了11個(gè)A至I編輯位點(diǎn)，其中9個(gè)可導(dǎo)致氨基酸突變(Hanrahanetal., 2000; Palladinoetal., 2000; Reenanetal., 2000; Riederetal., 2013)。環(huán)境條件的改變能誘導(dǎo)昆蟲鈉離子通道的RNA編輯，如10～30℃的溫度變化能迅速引起果蠅鈉離子通道A至I編輯(Riederetal., 2015)。在德國(guó)小蠊中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)A至I編輯位點(diǎn)，氨基酸突變分別為K184R和I1660M，其中K184R突變能引起鈉離子通道激活向去極化方向偏移。在綠盲蝽鈉離子通道中也發(fā)現(xiàn)同樣的RNA編輯位點(diǎn)I1660M(Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。此外，昆蟲鈉離子通道還存在U至C編輯，例如F1919S位點(diǎn)編輯同時(shí)存在于黑腹果蠅和德國(guó)小蠊中，且此類編輯可產(chǎn)生持久電流(Liuetal., 2004)。RNA編輯存在組織特異性，A至I編輯通常發(fā)生于神經(jīng)節(jié)中，U至C編輯則存在卵巢和腸道中。德國(guó)小蠊4類RNA編輯K467R, Y548C, N567D 和K699R在幼蟲、蛹和成蟲不同發(fā)育階段出現(xiàn)的頻率不同，其中K467突變?yōu)?67Q或467R都能提高瞬時(shí)內(nèi)向電流(Ryanetal., 2012)。RNA編輯還能引起昆蟲神經(jīng)性興奮，并產(chǎn)生巨大的生物物理學(xué)反應(yīng)(Sunetal., 2012)。

盡管昆蟲鈉離子通道基因數(shù)量較少，但其可以通過兩種轉(zhuǎn)錄后修飾(可變剪切和RNA編輯)增加其功能多樣性，某些核苷酸的細(xì)微變化就能引起昆蟲鈉離子通道結(jié)構(gòu)與功能的改變，有的可以導(dǎo)致昆蟲生理功能缺陷(Lindsayetal., 2008)，有的能夠幫助昆蟲迅速適應(yīng)外界環(huán)境的變化(Riederetal., 2015)，還有些則能改變昆蟲鈉離子通道與外源物質(zhì)的結(jié)合能力(Songetal., 2011)。

3 幾種神經(jīng)毒劑與昆蟲鈉離子通道相互作用

3.1 神經(jīng)毒素與鈉離子通道的結(jié)合位點(diǎn)

鈉離子通道是許多動(dòng)物源毒素、植物源毒素和化合物等的作用靶標(biāo)(Stevensetal., 2011)。神經(jīng)毒素是能夠影響神經(jīng)系統(tǒng)的天然或者人工化學(xué)分子，其作用于鈉離子通道的方式主要有兩種：一種是改變門控力學(xué)和電壓依賴性，另一種是侵占孔道并影響離子通透性。神經(jīng)毒素(包括天然毒素和殺蟲劑)作用于鈉離子通道的位點(diǎn)共有8種類型(圖3)：位點(diǎn)1，河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)、石房蛤毒素(saxitoxin, STX)和μ-芋螺毒素(μ-conotoxin)插入孔區(qū)，使鈉離子通道失活(Stephanetal., 1994; Narahashi, 2008; Chauetal., 2011; Shenetal., 2018)；位點(diǎn)2，蟾毒素(batrachotoxin)、藜蘆定(veratridine)和木藜蘆毒素(grayanotoxin)等毒素能抑制鈉離子通道的失活，使其保持持續(xù)激活狀態(tài)(Wang and Wang, 1998, 1999; Duetal., 2001)；位點(diǎn)3，蝎毒素(scorpion α-toxin)、?？舅?sea anemone toxin)、蜘蛛毒素(δ-atracotoxin)和黃蜂毒素(β-PMTX)能延緩或抑制鈉離子通道的失活(Rogersetal., 1996; Tejedor and Catterall, 1988; Nicholsonetal., 2004; Schiavonetal., 2010)；位點(diǎn)4，β-蝎毒素(scorpion β-toxin)、β-蜘蛛毒素(spider β-toxin)和μO-芋螺毒素(μO-conotoxin)能激活鈉離子通道，且使鈉離子通道失活(Nicholson, 2007; Billenetal., 2010; Songetal., 2011)；位點(diǎn)5，環(huán)聚醚復(fù)合物包括雙鞭甲藻毒素(brevetoxin)和雪卡毒素(ciguatoxin)等能夠抑制并改變鈉離子通道的激活(Gawleyetal., 1995; Badenetal., 2005; Perezetal., 2011)；位點(diǎn)6，δ-芋螺毒素(δ-conotoxin)等位點(diǎn)毒素延緩鈉離子通道的失活(Fainzilberetal., 1994; Shonetal., 1994)；位點(diǎn)7，擬除蟲菊酯(pyrethroid)和DDT(dichloro-diphenyl-tricgloroethane)能夠延緩或抑制通道的失活(Soderlund, 2008; Duetal., 2013; Wuetal., 2017)；位點(diǎn)8，局部麻醉劑(local anesthetic)和抗痙攣藥(anticonvulsant)等藥劑可阻斷鈉離子通道(Zhangetal., 2016)。

圖3 電壓門控鈉離子通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)(改自Stevens et al., 2011)

3.2 擬除蟲菊酯與昆蟲鈉離子通道相互作用

在農(nóng)業(yè)害蟲控制過程中，由于擬除蟲菊酯類殺蟲劑的不合理使用，抗藥性問題日益突出，其中由鈉離子通道基因突變導(dǎo)致昆蟲鈉離子通道與擬除蟲菊酯類殺蟲劑的結(jié)合親和性下降而產(chǎn)生的擊倒抗性(knockdown resistance, kdr)已成為靶標(biāo)抗性的重要機(jī)制之一(Fieldetal., 2017)。

鈉離子通道普遍存在于神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞等可興奮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，可產(chǎn)生初始動(dòng)作電位(Armstrong, 1981)。鈉離子通道的開啟和關(guān)閉受電刺激控制，在整個(gè)過程中依次呈現(xiàn)靜息狀態(tài)，激活狀態(tài)以及失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到電刺激時(shí)，鈉離子通道被激活，閥門打開，鈉離子順著電化學(xué)梯度跨膜通過并涌入細(xì)胞，但僅僅數(shù)毫秒后通道就迅速關(guān)閉。鈉離子通道的開放導(dǎo)致膜兩側(cè)電位極性改變，并引起電位差，造成細(xì)胞膜動(dòng)作電位上升(Dong, 2007)。鈉離子通道復(fù)極化(repolarization)過程包括失活(inactivation)和去激活(deactivation)，其中去激活過程中記錄的電流稱為尾電流(tail current)，鈉離子通道的失活后恢復(fù)(recovery from inactivation)指鈉離子通道閥門重新開啟并恢復(fù)到靜止?fàn)顟B(tài)(Dongetal., 2014)。鈉離子通道的主要功能是維持細(xì)胞興奮性及傳導(dǎo)，對(duì)心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)分泌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞等動(dòng)作電位的傳導(dǎo)有重要作用(Levitan and Kaczmarek, 2002)。擬除蟲菊酯藥劑可抑制昆蟲鈉離子通道的失活和去激活化，并延長(zhǎng)昆蟲鈉離子通道開放時(shí)間。擬除蟲菊酯殺蟲劑分為Ⅰ型和Ⅱ型，二者作用于昆蟲鈉離子通道的原理存在差異：Ⅰ型擬除蟲菊酯藥劑的作用原理和DDT相似，通過延長(zhǎng)鈉離子通道開放時(shí)間使動(dòng)作電位升高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞重復(fù)放電；Ⅱ型擬除蟲菊酯藥劑使動(dòng)作電位低于閾電位，不重復(fù)放電，但能擾亂神經(jīng)突觸功能(Lund and Narahashi, 1981)。雙電極電壓鉗試驗(yàn)表明，相比于Ⅱ型擬除蟲菊酯，Ⅰ型擬除蟲菊酯誘導(dǎo)鈉離子通道尾電流衰減的速度更快(Narahashietal., 1996)。擬除蟲菊酯Ⅰ型和Ⅱ型藥劑使昆蟲中毒的癥狀存在差異，這或許是兩種藥劑對(duì)昆蟲鈉離子通道尾電流動(dòng)力學(xué)響應(yīng)不同所致。

擬除蟲菊酯殺蟲劑在昆蟲鈉離子通道上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖4)：結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ，由結(jié)構(gòu)域Ⅱ的S4-S5連接肽、結(jié)構(gòu)域Ⅱ的跨膜螺旋S5和結(jié)構(gòu)域Ⅲ的跨膜螺旋S6組成(O′Reillyetal., 2006)；結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ，由結(jié)構(gòu)域Ⅰ的S4-S5連接肽、結(jié)構(gòu)域Ⅰ的跨膜螺旋S5和S6以及結(jié)構(gòu)域Ⅱ的跨膜螺旋S6組成(Duetal., 2013)。擬除蟲菊酯結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和Ⅱ在空間上是對(duì)稱的，但是兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合方向卻相反。溴氰菊酯在與昆蟲鈉離子通道結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ結(jié)合時(shí)，二苯醚基向細(xì)胞內(nèi)側(cè)移動(dòng)，二溴乙烯基向細(xì)胞外側(cè)移動(dòng)，而結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ正好與結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ相反(Duetal., 2015)。雖然結(jié)合位點(diǎn)I和結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ在空間上是對(duì)稱的，但是二者的功能并不完全相同，例如N3i20A(結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ：ⅢS6)突變使昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯藥劑的敏感性顯著降低，但N2i20A(結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ：ⅡS6)突變卻不產(chǎn)生類似效果(Duetal., 2015)。研究表明，家蠅和綠盲蝽鈉離子通道經(jīng)典kdr突變F1014L和super-kdr突變M918Ⅰ可賦予其對(duì)擬除蟲菊酯的抗性，且利用雙電極電壓鉗技術(shù)證實(shí)了F1014L/M918Ⅰ雙突變導(dǎo)致擬除蟲菊酯藥劑失去與綠盲蝽鈉離子通道的結(jié)合能力(Wangetal., 2020)。此外，埃及伊蚊鈉離子通道L1014位點(diǎn)存在多種形式的突變，如L1014F, L1014C, L1014W, L1014H和L1014S(Scott, 2019)。這些單突變、雙突變和多突變使昆蟲對(duì)殺蟲劑所產(chǎn)生的抗性倍數(shù)不同，且與地理分布有關(guān)。

圖4 計(jì)算機(jī)構(gòu)建的埃及伊蚊鈉離子通道的三維結(jié)構(gòu)(引自Du et al., 2013)

相較于大部分昆蟲，哺乳動(dòng)物對(duì)擬除蟲菊酯藥劑均不敏感，這是由于其鈉離子通道僅存在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ，不存在結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ?qū)е?Duetal., 2013)，且結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ(IIL45)、結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ(IL45和IS5)部分氨基酸的突變導(dǎo)致其對(duì)擬除蟲菊酯藥劑的敏感性降低(Soderlund, 2012; Oliveiraetal., 2013)。

雖然不同昆蟲鈉離子通道與擬除蟲菊酯的作用區(qū)域均位于結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ，但具體結(jié)合位點(diǎn)也存在差異。蜂類(以熊蜂為模型)鈉離子通道的研究表明，熊蜂存在V926, F1525和T841等不同于其他昆蟲的氨基酸殘基(圖5)，但這些殘基在12種蜂類中具有保守性，因此，蜂類的鈉離子通道與氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)的結(jié)合力沒有黑腹果蠅等昆蟲的強(qiáng)，這決定了熊蜂鈉離子通道對(duì)氟胺氰菊酯與其他擬除蟲菊酯的獨(dú)特選擇性，揭示了生產(chǎn)中可用氟胺氰菊酯作為蜂類殺螨劑的分子機(jī)理(Wuetal., 2017)。

圖5 溴氰菊酯(A)和氟胺氰菊酯(B)在熊蜂鈉離子通道的結(jié)合位點(diǎn)側(cè)視圖(引自Wu et al., 2017)

3.3 茚蟲威和氰氟蟲腙與昆蟲鈉離子通道相互作用

茚蟲威和氰氟蟲腙為鈉離子通道阻斷型殺蟲劑，可阻斷昆蟲中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?Caballeroetal., 2019)。茚蟲威是美國(guó)杜邦公司開發(fā)的噁二嗪類新型高效殺蟲劑，其對(duì)鱗翅目和部分同翅目及鞘翅目害蟲具有較好的殺蟲活性，經(jīng)口被攝入后可經(jīng)酯酶或酰胺酶催化并迅速代謝為N-去甲氧羰基代謝物(decarbomethoxylatedmetabolite, DCJW)(Wingetal., 2000)。氰氟蟲腙是德國(guó)巴斯夫公司與日本農(nóng)藥公司聯(lián)合推出的一種新型的縮氨基脲類殺蟲劑(Salgado and Hayashi, 2007)，對(duì)鱗翅目昆蟲效果較好。神經(jīng)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茚蟲威和氰氟蟲腙能不可逆阻斷昆蟲鈉離子通道的功能，導(dǎo)致靶標(biāo)昆蟲運(yùn)動(dòng)失調(diào)、停止取食、麻痹、死亡(Tsurubuchi and Kono, 2003; Salgado and Hayashi, 2007)。

研究人員在對(duì)茚蟲威產(chǎn)生抗性的小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和番茄潛麥蛾Tutaabsoluta種群中檢測(cè)到了鈉離子通道F1845Y和V1848I突變(Wangetal., 2016; Roditakisetal., 2017)，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)兩個(gè)位點(diǎn)突變后的鈉離子通道，發(fā)現(xiàn)其與茚蟲威的結(jié)合能力顯著降低(Jiangetal., 2015)。Samantsidis等(2019)通過CRISPR/Cas9 技術(shù)在黑腹果蠅體內(nèi)構(gòu)建了F1845Y或V1848I突變品系，攜帶2個(gè)突變位點(diǎn)的黑腹果蠅均對(duì)茚蟲威產(chǎn)生抗性。Gao等(2014)曾經(jīng)報(bào)道了對(duì)茚蟲威產(chǎn)生抗性的田間品系鈉離子通道出現(xiàn)了L1014P突變，但該研究?jī)H局限于domain Ⅱ，而尚未對(duì)domain Ⅳ進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)，因此，其對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑產(chǎn)生的交互抗性可能與L1014P突變有關(guān)。

麻醉劑也是一種鈉離子通道阻斷劑。人類鈉離子通道NaV1.4 α亞基可與部分麻醉劑相互結(jié)合，并引起多個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變。在德國(guó)小蠊BgNav1-1中找到與人類鈉離子通道NaV1.4相對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)W377A/S, V1016K, F1463A/L, T1511A, T1760A和L1801A/C，并進(jìn)行點(diǎn)突變，再通過爪蟾卵母細(xì)胞驗(yàn)證以上突變體的作用，結(jié)果表明這些點(diǎn)突變均能影響B(tài)gNav1-1與茚蟲威或者氰氟蟲腙的結(jié)合。此研究首次揭示了茚蟲威和氰氟蟲腙的分子選擇性殺蟲機(jī)制，并有助于研發(fā)靶向鈉離子通道內(nèi)孔的神經(jīng)阻斷劑(Zhangetal., 2016)。

綜上，昆蟲鈉離子通道與其阻斷劑互作機(jī)制的研究仍然非常有限，但目前田間農(nóng)業(yè)昆蟲對(duì)茚蟲威和氰氟蟲腙的抗性倍數(shù)逐年增加和突變位點(diǎn)的日益增多，今后應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)該方面的深入研究。

4 小結(jié)與展望

自32年前首個(gè)昆蟲鈉離子通道基因被克隆以來(lái)，人們對(duì)昆蟲鈉離子通道的電生理學(xué)、藥理學(xué)和分子生物學(xué)認(rèn)識(shí)取得了重大進(jìn)展。昆蟲鈉離子通道在爪蟾卵母細(xì)胞中的成功表達(dá)及其結(jié)晶體的獲得對(duì)該蛋白的功能研究起著重要的推動(dòng)作用。盡管昆蟲鈉離子通道數(shù)量很少，但其可通過可變剪切和RNA編輯產(chǎn)生很多變異體(variants)，從而豐富了昆蟲鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和功能，但可變剪切和RNA編輯在昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用仍需繼續(xù)探索。

雖然毒理學(xué)家已經(jīng)探明了昆蟲鈉離子通道的基本結(jié)構(gòu)和毒素結(jié)合區(qū)域，但是現(xiàn)階段的研究仍然存在諸多問題。例如，近期的研究發(fā)現(xiàn)桃蚜、麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavenae、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi、褐色桔蚜等半翅目昆蟲具有兩個(gè)獨(dú)立且完整的鈉離子通道基因：第1個(gè)鈉離子通道基因具有其他昆蟲鈉離子通道domain Ⅰ和domain Ⅱ的基本結(jié)構(gòu)，第2個(gè)鈉離子通道基因則具有其他昆蟲鈉離子通道domain Ⅲ和domain Ⅳ的基本結(jié)構(gòu)(Ameyetal., 2015; Zuoetal., 2016; Jiangetal., 2017; 段文波等, 2020; 王顥等, 2020)，且大部分選擇性剪切均發(fā)生在第2個(gè)鈉離子通道基因上。但到目前為止，蚜蟲鈉離子通道還未在爪蟾卵母細(xì)胞中得以成功表達(dá)，其具體功能仍需做進(jìn)一步探索。昆蟲鈉離子通道輔助亞基的突變是否影響其與神經(jīng)毒劑的結(jié)合或者影響其發(fā)育仍尚未知曉，但目前已經(jīng)有昆蟲鈉離子通道的晶體結(jié)構(gòu)被解析，且真核生物鈉離子通道結(jié)構(gòu)最高分辨率已經(jīng)達(dá)到0.26 nm(Shenetal., 2018)，這些研究結(jié)果都為后續(xù)鈉離子通道的功能研究及作用機(jī)理解析提供了有價(jià)值的參考。

綜上，近年來(lái)神經(jīng)毒劑與鈉離子通道互作引起了毒理學(xué)家的濃厚興趣，這一領(lǐng)域的深入研究將極大地加深對(duì)神經(jīng)毒劑與害蟲耐藥性互作分子機(jī)制的認(rèn)知，有助于進(jìn)一步解析各種神經(jīng)毒素和殺蟲劑與昆蟲鈉離子通道互作的分子機(jī)制，并推動(dòng)更高效、安全新型殺蟲劑的研發(fā)。