競爭ELISA和間接ELISA方法應用于牛布魯氏菌病凈化的研究

摘 要： 旨在評價競爭ELISA方法和間接ELISA方法聯(lián)合使用在布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q“布病”）凈化中的效果，為布病防控提供技術支撐。采用本實驗室開發(fā)的動物布魯氏菌病競爭ELSIA（cELISA）抗體檢測試劑盒、牛布魯氏菌病間接ELISA（iELISA）抗體檢測試劑盒及微量法補體結合試驗（mCFT），對西北某牛場3 271份牛血清進行檢測。本研究采用cELISA初篩、iELISA確診的凈化策略，對檢測陽性牛進行淘汰，可疑牛和陰性牛在完全消毒后隔離飼養(yǎng)，并在前一次檢測后每隔1個月重新對群體采樣，進行多次連續(xù)的“檢—淘”策略，在群體的個體陽性率低于2%或全部轉陰后使用微量補體結合試驗（mCFT）進行驗證。并在群體全部轉陰后繼續(xù)檢測2個月后確定凈化結果。結果顯示，首次檢測陽性率35.36%的感染群體實施本凈化策略后，在第1個月陽性率下降至25.41%，第2個月下降至7.16%，第3個月下降為1.86%，到第4個月則實現(xiàn)了布病陽性群體的全面轉陰，mCFT驗證個體陰性率100%。此后持續(xù)檢測2個月，個體陽性率均為0，至此實現(xiàn)了感染群體的布病凈化，使得群體內近一半的牛免于撲殺，大大減少了經(jīng)濟損失。綜上發(fā)現(xiàn)，將cELISA用于布病初篩，iELISA用于布病確診的聯(lián)合使用，經(jīng)多次連續(xù)檢測并結合常規(guī)的隔離消毒措施，可以在短時間內實現(xiàn)對于布病感染群體的全面凈化。

關鍵詞： 布魯氏菌?。桓偁幟嘎?lián)免疫吸附試驗；間接酶聯(lián)吸附試驗；微量補體結合試驗；初篩；確診

中圖分類號： S852.614

文獻標志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2146-08

收稿日期：2023-07-11

基金項目：少數(shù)民族專業(yè)人才特殊培養(yǎng)計劃項目；江蘇省人獸共患病學重點實驗室資助項目（R2210）

作者簡介：趙燦奇（1984-），男，白族，云南劍川人，獸醫(yī)師，主要從事動物傳染病流行病學研究，E-mail： zhaocanqi@163.com；馮 宇（1989-），男，山東蘭山人，高級獸醫(yī)師，主要從事布魯氏菌新型診斷方法研究。E-mail： 13051530440@163.com。趙燦奇和馮宇為同等貢獻作者

*通信作者：蔣 卉，主要從事重要人獸共患病新型疫苗和診斷技術研究，E-mail： jianghui01@caas.cn

Study on Purification of Bovine Brucellosis by Competitive ELISA and Indirect ELISA

ZHAO" Canqi1，2， FENG" Yu1， L Lang1， LI" Yanjun3， WEI" Yulei4， DING" Jiabo1， CHEN" Xiang5， JIANG" Hui1*

（1.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，

China;

2.Animal Disease Prevention and Control Center of Dali Prefecture， Yunnan Province，

Dali 671005，" China;

3.

Animal Disease Prevention and Control Center of Alxa Youqi， Inner Mongolia，

Alxa Youqi 737300，

China;

4.Comprehensive Security and Technology Promotion Center

in Zongbieli Town， Alxa Zuoqi， Inner

Mongolia， Alxa Zuoqi 753421，" China;

5.Jiangsu University’s Collaborative Innovation

Center for the Prevention and Control of Important Animal Diseases and Zoonosis， Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis，

Yangzhou 225000，" China）

Abstract： The aim of this study was to evaluate the efficacy of the combination of competitive ELISA and indirect ELISA methods in the purification of brucellosis， hoping to provide technical support for the prevention and control of brucellosis. A total of 3 271 bovine serum samples from a cattle farm in the northwest of China were tested using the competitive ELISA （cELISA） antibody detection kit， the indirect ELISA （iELISA） antibody detection kit， and the micro-complement fixation test （mCFT） which developed by the writers team. This study adopted a purification strategy of cELISA for preliminary screening， iELISA for confirm diagnosis. The positive cattle were eliminating， the suspect cattle and negative cattle were respectively quarantined after disinfecting completely. After the previous detection， the group was sampled every month for multiple “Detection-Elimination” cycles. When the individual positive rate was below 2% or all negative， the results were verified using a micro-complement fixation test （mCFT）. The test were carried on for 2 months after all the bovine turned negative to ensure the successful of the purification. The results showed that， after the implementation of this purification strategy， the positive rate of the infected group with a positive rate of 35.36% decreased to 25.41% in the first month， 7.16% in the second month， and 1.86% in the third month. By the fourth month， the group had achieved a comprehensive negative conversion， and the negative rate by mCFT verification was 100%. The detection continued for 2 months， and the individual positive rate was 0. So far， the brucellosis purification of the infected group was realized， making nearly half of the cattle in the group free from culling， greatly reducing the economic loss. In conclusion， cELISA is suitable for the preliminary screening， while iELISA is suitable for confirmed diagnosis of brucellosis. The combination of two methods， through multiple consecutive tests， can achieve a comprehensive purification of brucellosis infected within a relatively short period of time.

Key words： brucellosis; competitive ELISA; indirect ELISA; micro-complement fixation test; preliminary screening; confirmed diagnose

*Corresponding author： JIANG Hui，E-mail： jianghui01@caas.cn

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q“布病”）是由布魯氏菌感染引起的人畜共患傳染病，人主要是通過直接或間接接觸患病動物或動物產品而感染［1］。近十年，全國人間布病病例數(shù)呈上升趨勢，畜間布病流行嚴重地區(qū)高達15個?。▍^(qū)），防控形勢十分嚴峻［2］。準確診斷是布病防控的關鍵環(huán)節(jié)［3］。目前布病檢測常用的血清學方法主要有虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、全乳環(huán)狀反應（MRT）、熒光偏振試驗（FPA）、補體結合試驗（CFT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等［4-5］。ELISA方法作為實驗室常用的檢測方法之一，具有操作簡單快速、高通量、結果判斷簡單等優(yōu)點。在眾多血清學檢測方法中，世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）推薦FPA、間接ELISA（iELISA）和微量法補體結合試驗（mCFT）作為確診方法，競爭ELISA（cELISA）、RBT作為初篩方法［6］。而現(xiàn)行國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術（GB/T18646—2018）》推薦RBT和iELISA初篩，SAT、CFT和cELISA確診［7］，這顯然與WOAH對診斷方法的選擇不同。在初篩與確診方法的選用策略上，本實驗室的原則與WOAH一致，認為主要檢測IgG類抗體的方法應作為確診方法，可檢測IgM抗體的方法應作為初篩方法?；谏鲜鲈瓌t，本研究的凈化策略是cELISA初篩、iELISA確診，原因是iELISA主要檢測IgG類抗體，而cELISA可同時檢測血清中特異性IgM和IgG抗體［8］。

為驗證本研究提出的“初篩—確診”方法的科學性與準確性，本研究采用動物布病cELISA抗體檢測試劑盒、牛布病iELISA抗體檢測試劑盒，對西北牛場的布病陽性群體進行布病抗體檢測，根據(jù)檢測結果對陽性群體進行“檢—淘”，最終以感染群體的凈化效果來評估此方法的可行性，旨在為當前動物布病監(jiān)測凈化提供方案與參考。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

牛血清共3 271份，收集自西北某規(guī)?；膛?。

1.2 主要試劑和儀器

動物布病競爭ELISA抗體檢測試劑盒，批號202303；牛布病間接ELISA抗體檢測試劑盒，批號202303；mCFT用補體、溶血素、抗原、多功能酶標與熒光偏振儀（TECAN SPARK CYTO）、洗板機（Ts-20）等均由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所農業(yè)農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室（北方）提供。布病陽性血清標準品（牛源，1000 ICFTU）購自英國NIBSC。

1.3 2種檢測方法靈敏度的測定

用1 mL生理鹽水將布病陽性血清標準品復溶。再用生理鹽水將血清進行1∶10、1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100等5個不同稀釋度備用，即血清抗體含量分別為100、80、40、20、10 IU·mL－1。采用cELISA、iELISA分別檢測5個不同稀釋度布病陽性血清標準品，每個稀釋度重復3次，結果取其平均值，比較各方法之間的檢測靈敏度。cELISA、iELISA按試劑盒說明書操作。各檢測方法的判定標準如下：動物布病cELISA判定標準為抑制率百分比（percent of inhibitive，PI）值≥30%時，為布病抗體陽性（+）；PI%值＜30%時，為布病抗體陰性（－）；牛布病iELISA判定標準為陽性百分比（樣品OD值/陽對照OD值*100%，即P%值）≥20%時，為牛布病抗體陽性（+）；P%值＜20%時，為牛布病抗體陰性（－）。

1.4 臨床樣品的檢測

1.4.1 cELISA和iELISA檢測

按照試劑盒說明書進行操作和結果判定。

1.4.2 mCFT檢測" 根據(jù)WOAH《陸生動物疾病疫苗和診斷手冊》的方法［6］，在測定溶血素、補體、抗原最佳使用濃度的基礎上，將待檢牛血清、陽性對照血清和陰性對照血清在96孔深孔稀釋板中用生理鹽水作1∶4倍稀釋，放入水浴鍋中滅能，56℃滅能30 min。然后取96孔U型底微孔板按表1進行臨床樣品的檢測。結果判定時，陽性血清加抗原對照孔和溶血素對照孔，須完全抑制溶血；陽性血清不加抗原對照孔和其他對照孔完全溶血，試驗成立。被檢臨床血清不加抗原對照孔應完全溶血，表明反應結果符合要求，可判定被檢臨床血清加抗原檢測孔結果［9］。溶血程度＞50%判為陰性；溶血程度≤50%判為陽性。本方法檢測靈敏度為當血清中含有抗體不低于20 ICFTU·mL-1可檢測為陽性。

1.5 陽性、可疑及陰性動物的判定及凈化方法

經(jīng)cELISA初篩、iELISA檢測均為陽性的，判定為陽性動物。嚴格按照《布魯氏菌病防治技術規(guī)范》進行無害化處理；若初篩為陽性的，確診為陰性的，判定為可疑動物，應將可疑動物進行隔離消毒，禁止配種，在1個月后重新采樣檢測，cELISA和iELISA同時復檢結果陽性的判定為陽性動物；復檢結果為陰性的，判定為健康動物，對于健康動物應進行消毒后繼續(xù)觀察?？梢蓜游锖完幮詣游飸?個月后重新檢測，直至3次檢測全部轉陰后判定為凈化成功。

1.6 結果準確性的驗證

對上述檢測結果進行分析，在“檢—淘”模式多次篩選后，在個體陽性率低于2%［10］或全部轉陰后用mCFT檢測方法對iELISA確診結果進行復核。

2 結 果

2.1 2種檢測方法靈敏度測定結果

將布病陽性血清標準品（牛源）稀釋成5個不同稀釋度，用cELISA和iELISA進行檢測，確定2種檢測方法的靈敏度（表2）。結果發(fā)現(xiàn)，2種檢測方法檢測靈敏度結果一致，即布病陽性血清標準品稀釋1∶50（即20 ICFTU·mL-1）均檢測為陽性；布病陽性血清標準品稀釋1∶100（即10 ICFTU·mL-1）均檢測為陰性，即cELISA、iELISA均和mCFT檢測靈敏度一致。

2.2 cELISA初篩結果

采用cELISA抗體檢測試劑盒對840份牛血清進行檢測，cELISA檢出的陽性樣品476份，陽性率為56.67%。結果見表3。

2.3 iELISA確診結果

采用iELISA抗體檢測試劑盒對840份牛血清進行確診檢測，iELISA檢測陽性樣品297份，陽性率為35.36%。cELISA 檢測陽性樣品476份樣品完全覆蓋iELISA檢測的297份陽性樣品。結果見表3。

2.4 檢測和凈化結果

根據(jù)判定標準要求，cELISA、iELISA同時檢測陽性的，判定為抗體陽性，cELISA陽性但iELISA陰性的判定為可疑，在第1次采樣1個月后重新采樣進行檢測。在第3個月時，由于前期“檢—淘”方式已將大部分陽性動物進行處理，僅有11份樣品為陽性或可疑（7+4）。在第4個月進行檢測時場群個體已全部轉陰，為了進一步確定凈化結果，又在第5、6個月連續(xù)兩個月對全群重新檢測，結果均為陰性。至此，6個月后該場群最終實現(xiàn)布病牛群凈化。與首次相同，每次cELISA方法檢測到的陽性樣本均覆蓋了iELISA檢測的陽性樣本。具體結果如表3和圖1所示。

2.5 mCFT復核結果

在第3個月采用mCFT對檢測為陽性或可疑的11份（7+4）血清和365份陰性血清進行復核確診。7份陽性血清經(jīng)mCFT復核為陽性，4份可疑血清均為陰性；365份陰性血清樣品經(jīng)mCFT復核全部為陰性。iELISA與mCFT的結果符合率為100%。第4個月、第5個月、第6個月樣本也均為陰性。結果見表4。

3 討 論

目前我國布病防控面臨的主要問題之一就是如何實現(xiàn)快速、準確的診斷，為布病防控提供有效方法。布魯氏菌病的診斷方法分為病原學方法和血清學方法［11］，其中血清學方法目前仍是布魯氏菌病的臨床診斷和監(jiān)測的最主要檢測方法［12］。我國現(xiàn)行的動物布魯氏菌病診斷技術標準（GB/T18646—2018）規(guī)定了多種動物布魯氏菌病血清學檢測方法，

其中虎紅平板凝集試驗適合初篩，而國標中規(guī)定試管凝集試驗作為確診方法，但其敏感性和特異性均較差，容易造成錯檢和漏檢。其他方法如ELISA和FPA等雖然簡單快速，但受限于基層試驗能力和設備的缺乏，加之各個試劑盒的檢測標準不一致，在使用時仍需進一步驗證推廣。同時，國標中在初篩與確診方法的選擇上與國際推薦方法不同，容易造成漏檢或誤殺，用于布病凈化時往往因不能及時將陽性與可疑動物隔離出群而導致凈化失敗［13］。

在布病凈化策略上，“免疫-檢測-淘汰”的模式在國外布病凈化過程中被普遍使用，并已在多個國家證明其價值，國外的檢測方法多使用補體結合試驗和ELISA試驗等方法［14］。但是我國的凈化難度相較而言要困難許多，首先我國的動物飼養(yǎng)量巨大且流通頻繁，加之原有檢測方法和能力不足，雖然在上世紀實現(xiàn)布病疫情的控制，但近年來隨著經(jīng)濟發(fā)展，布病的感染病例數(shù)居高不下，證明了原有的凈化策略存在嚴重問題，亟需使用新的檢測手段進行場群的布病凈化［15］。

本研究根據(jù)不同檢測方法檢測抗體類型的不同，采用cELISA初篩、iELISA確診。所使用試劑盒的檢測靈敏度也被有效控制與mCFT一致，即當血清中布魯氏菌抗體含量不低于20 ICFTU·mL－1時，檢測為陽性；抗體含量低于20 ICFTU·mL－1時，檢測為陰性。因此在同一檢測靈敏度條件下，cELISA方法由于競爭法的原理可檢測更多的抗體類型，比只能檢出IgG類抗體的iELISA檢出更多陽性樣品，并能覆蓋iELISA檢測的陽性［16］。雖然cELISA方法能篩選到更多的陽性樣品，但是由于IgM抗體本身的非特異性，從而存在假陽性，因此僅cELISA檢測為陽性的判定為可疑動物［17-18］?？梢蓜游镌诒狙芯康脑俅尾蓸訖z測中大部分檢測結果顯示陰性，因此驗證了cELISA方法僅適合于作為初篩的方法，確保群體里可疑動物及時被隔離出群。

在本研究中，當兩種方法的靈敏度相同時，采用cELISA初篩和iELISA確診的組合方式檢測，當cELISA與iELISA檢測結果一致便可直接判定為陽性或陰性；當僅cELISA方法檢測為陽性，則判為可疑；全面消毒隔離30 d后再次進行采樣檢測，結果表明在實施上述凈化策略下，牛群個體陽性率從開始的35.71%持續(xù)下降，3個月后實現(xiàn)了對于群體布病的有效控制（陽性率為1.86%），4個月后實現(xiàn)布病感染群體的全面凈化，使得該群體近一半的動物能夠留存，大大降低了經(jīng)濟損失。在“檢—淘”模式下，采取嚴格的消毒措施同樣重要，對受到污染的圈舍、地面、飼養(yǎng)工具以及周邊環(huán)境進行徹底消毒［19］，是保證凈化策略取得成效的有力措施。

需要說明的是，本研究使用的新型凈化策略的核心是兩個試劑盒（競爭ELISA和間接ELISA）的靈敏度與補體結合試驗一致，且使用策略與WOAH的要求相同。如果使用其他商品化試劑盒，如其靈敏度、檢測原理和使用方法不一致，是無法使用研究中的凈化策略進行布病凈化。所以使用本研究中的策略進行布病凈化工作，需要首先評價檢測方法的靈敏度等重要參數(shù)，做好效果評價才能使用。同時，目前的凈化措施雖然可以做到全群凈化，但仍會帶來一定的經(jīng)濟損失，所以預防和控制布病流行和傳播的關鍵點還是要做好群體免疫以及加強生物安全意識和管理措施，阻止疫情的發(fā)生和傳播。

4 結 論

本研究采用與mCFT相同靈敏度的cELISA和iELISA診斷方法，按照“cELISA初篩—iELISA確診”的策略，在短時間內實現(xiàn)了對于布病嚴重流行牛群的凈化，避免了全群撲殺的重大經(jīng)濟損失。本研究所推薦的檢測方法適用于布病陽性場的全面凈化，具有可操作性和臨床使用價值。

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（編輯 編輯范子娟）