掌葉大黃4個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的分子克隆及脅迫表達(dá)

趙霞 李元敏 李依民 胡曉晨 高靜 顏永剛 張崗

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.017

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.017

收稿日期：2023-01-05? 修回日期：2023-03-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（82104334，81973430）；咸陽市中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才（L2022CXNLRC009）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)科創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019-QN01）。

第一作者：趙? 霞，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由帉W(xué)。E-mail：2443284316@qq.com

李元敏，并列第一作者，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由帉W(xué)。E-mail：1272151264@qq.com

通信作者：張? 崗，男，教授，研究方向?yàn)榉肿由帉W(xué)。E-mail：jay_gumling2003@aliyun.com

李依民，女，副教授，研究方向?yàn)榉肿由帉W(xué)。E-mail：2051058@sntcm.edu.cn

摘? 要? 旨在克隆獲得? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5、? RpMYB6基因ORF，并對(duì)其理化特性、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、不同組織表達(dá)、激素與非生物脅迫下的表達(dá)等展開分析。研究結(jié)果表明，? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5、? RpMYB6依次編碼333、275、293、291個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量分別為34.781、30.525、31.243、33.313 ku，4個(gè)RpMYBs蛋白均為親水性蛋白并具有較高的熱穩(wěn)定性，除? RpMYB2外其余3個(gè)基因結(jié)構(gòu)主要為? α-螺旋和無規(guī)則卷曲，且均定位于細(xì)胞核。由蛋白結(jié)構(gòu)域和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，? RpMYB2、? RpMYB5含有1個(gè)HTH-MYB結(jié)構(gòu)域，? RpMYB3、? RpMYB6含有2個(gè)HTH-MYB結(jié)構(gòu)域，且不同MYB轉(zhuǎn)錄因子包含的保守元件數(shù)量及種類存在差異，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示? RpMYB2、? RpMYB5屬于R1-MYB亞家族，? RpMYB3、? RpMYB6屬于R2R3-MYB亞家族，與其結(jié)構(gòu)域分類一致。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，根中? RpMYB2、? RpMYB6轉(zhuǎn)錄本豐度最高，?? RpMYB3、? RpMYB5基因分別在葉片、葉柄中高表達(dá)。經(jīng)200 μmol·L-1脫落酸 （abscisic acid， ABA）處理，? RpMYB5于24 h達(dá)峰值；200 μmol·L-1茉莉酸甲酯 （methyl jasmonate， MeJA）誘導(dǎo)?? RpMYB6 表達(dá)，表達(dá)量隨時(shí)間推移呈逐漸上升趨勢(shì)且于24 h最高（為0 h的10.30倍），抑制? RpMYB3表達(dá)；200 μmol·L-1水楊酸 （salicylic acid， SA）誘導(dǎo)? RpMYB6表達(dá)最為明顯，3 h表達(dá)量上調(diào)至? 0 h的21.84 倍。 RpMYBs 在非生物脅迫處理下表達(dá)也各有差異，? RpMYB2受高溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，? RpMYB3在損傷、高溫脅迫下表達(dá)下調(diào)，? RpMYB5在損傷脅迫下表達(dá)受抑制，? RpMYB6響應(yīng)高溫、鹽脅迫。

關(guān)鍵詞? 掌葉大黃；MYB；表達(dá)分析；脅迫；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，通常通過與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中的相關(guān)順式作用元件相互作用，參與基因表達(dá)調(diào)控［1］。在眾多的轉(zhuǎn)錄因子中，MYB存在于所有真核生物中，功能多樣且廣泛參與到植物生長(zhǎng)、發(fā)育、防御及次生代謝調(diào)控等生理過程。 ZmMYBC1是植物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的MYB轉(zhuǎn)錄因子［2］，與玉米花青素的生物合成密切相關(guān)。近年來，越來越多的植物MYB家族成員相繼被報(bào)道，如擬南芥［3］、過路黃［4］、辣椒［5］中分別鑒定出197、51、172個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子。

通常，MYB蛋白在N端有一段高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由50～53個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)片段（R）組成［6-7］，依據(jù)包含的R結(jié)構(gòu)數(shù)目又分為4個(gè)亞類：4R-MYB，最小的MYB亞家族，相關(guān)報(bào)道較少；3R-MYB（R1R2R3-MYB），植物中家族成員較少，主要參與調(diào)控細(xì)胞周期［8-9］；R2R3-MYB，植物MYB基因編碼蛋白中最豐富的一類，在初生與次生代謝、激素應(yīng)答以及植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)等方面具有重要功能［10］；R1-MYB是植物中第二大類MYB亞家族，在細(xì)胞形態(tài)建成、染色體結(jié)構(gòu)維持、根毛形成、生物鐘調(diào)節(jié)等生命過程具有重要調(diào)控作用［11］。諸多研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控苯丙烷類次生代謝，如? McMYB4通過調(diào)節(jié)苯丙烷代謝和激素信號(hào)傳導(dǎo)，參與蘋果響應(yīng)溫度變化的非生物抗性和生長(zhǎng)［12］；白楊中? PtoMYB156參與調(diào)控苯丙烷途徑和次生細(xì)胞壁的初步形成［13］；? AtMYB4通過苯丙烷代謝途徑參與調(diào)節(jié)擬南芥中花粉壁的形成［14］。

掌葉大黃（Rheum palmatum? L.）是目前中國(guó)最為正宗、名貴的中藥材大黃屬三基源植物之一，以其干燥根、根莖為藥用，味苦、性寒，主治瀉下，清熱瀉火，涼血解毒，利濕祛黃［15］，主要分布于甘肅、青海等高海拔地區(qū)。蒽醌類是大黃的主要活性物質(zhì)，具有保肝、抗腫瘤、抗氧化等作用，其成分積累是影響大黃品質(zhì)的重要因素［16］。研究發(fā)現(xiàn)部分MYB轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控苯丙烷代謝［17］，Perassolo等［18］闡明有效抑制莽草酸途徑中苯丙氨酸解氨酶活性可改變代謝流，活化蒽醌類成分合成途徑進(jìn)而導(dǎo)致蒽醌類成分累積。但是，MYB基因家族在掌葉大黃中是否參與調(diào)控蒽醌類化合物的合成還有待研究。李元敏［19］對(duì)1 a生掌葉大黃根、根莖和葉片進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析（SRR10855670），篩選到6條組織差異性表達(dá)且包含完整開放閱讀框（ORF）的MYB轉(zhuǎn)錄因子序列。本研究通過RT-PCR克隆得到4個(gè)MYB家族成員基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、激素和非生物脅迫響應(yīng)分析，有助于深入探討MYB基因在植物防御反應(yīng)中的重要作用，為揭示大黃中蒽醌類活性成分合成與積累的調(diào)控機(jī)制及通過遺傳工程改良藥材品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材? 料

植物材料為1 a生掌葉大黃 （R. palmatum L.）及其成熟種子，2019年10月采集于甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村，陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授對(duì)其進(jìn)行鑒定。取大黃根、根莖、葉、葉柄及種子等樣品并置于液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱保存。

基于黑小斌等［20］建立的大黃無菌苗體系培育出掌葉大黃無菌苗，參考李元敏等［21］的方法進(jìn)行植物激素與非生物脅迫處理。選取生長(zhǎng)旺盛、生長(zhǎng)均勻的1月齡幼苗，激素處理組：噴施200 μmol·L-1茉莉酸甲酯 （MeJA）、200 μmol·L-1水楊酸 （SA）、200 μmol·L-1脫落酸 （ABA）；非生物脅迫處理組：包括干旱（10% PEG6000）、機(jī)械損傷（針刺葉片）、鹽（100?? mmol·L-1 NaCl）、低溫（4? ℃）、高溫（40? ℃）；此外，噴施純?nèi)軇┠M激素對(duì)照組，噴灑無菌水作為脅迫對(duì)照組；所有樣品均于處理后1、3、6、12和24? h進(jìn)行取樣，0 h為空白對(duì)照，每個(gè)處理組的每個(gè)處理時(shí)間作3個(gè)樣本重復(fù)，用液氮速凍后于-80? ℃冰箱保存。

1.2? 總RNA提取及cDNA合成

采用RN38-EASYspin Plus RNA試劑盒（艾德萊，中國(guó)北京）提取大黃各樣品總RNA，K5800自動(dòng)檢測(cè)超微量分光光度計(jì)（凱奧，中國(guó)北京）測(cè)定質(zhì)量，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。按說明書操作，利用PrimeScriptTM?? RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）合成cDNA，-20 ℃保存。

1.3? 基因克隆

利用Primer Premier 5.0對(duì)篩選到的4條MYB轉(zhuǎn)錄因子序列設(shè)計(jì)跨ORF引物 （表1）。25 μL標(biāo)準(zhǔn)體系為：12.5 μL 2×Rapid Taq Master Mix、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer和1 μL cDNA，并用9.5 μL ddH2O補(bǔ)齊。PCR條件為：95? ℃ 5 min；95? ℃ 30 s，60? ℃?? 30 s，72? ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，15? ℃保溫。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。隨后用50 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增、DNA膠回收試劑盒（TianGen，中國(guó)北京）純化回收目的片段，與pUC19連接后并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽性克隆送上海生工完成測(cè)序。

1.4? 生物信息學(xué)分析

利用軟件及在線工具對(duì)掌葉大黃 RpMYBs 進(jìn)行生物信息分析預(yù)測(cè)（表2）。

1.5? 基因表達(dá)模式

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) RpMYBs 在大黃不同樣品中基因表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參基因［22］，qPCR引物序列見表1。反應(yīng)體系20 μL：包括10 μL TB Green○R? Premix Ex TaqTM? Ⅱ （TliRNaseHPlus） （2×）、Forward/Reverse Primer各0.8 μL、2 μL cDNA、0.4 μL ROX Reference Dye （50×）、6 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5? ℃ 30 s；95? ℃ 5 s，60? ℃ 30 s，60? ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；之后繪制熔解曲線，條件為95? ℃ 15 s，? 60? ℃ 1 min，95? ℃ 15 s。設(shè)置3次技術(shù)和試驗(yàn)重復(fù)，包括不加模板的對(duì)照。用Step One Plus○R Real-Time （Applied Biosystems，美國(guó)）儀器進(jìn)行qPCR檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［23］，以SPSS? 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05代表有顯著性差異。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 基因克隆

基于陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與開發(fā)課題組前期篩選到的MYB基因家族成員，本研究對(duì)其中4條包含完整開放閱讀框（ORF）的MYB轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行基因克隆研究。提取掌葉大黃全株的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物各取5 μL經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別獲得4條清晰且特異性較好的條帶 （圖1），轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與PCR產(chǎn)物大小相符且與克隆測(cè)序ORF序列吻合，基因命名為? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5、? RpMYB6 （注冊(cè)號(hào) MW269444、MW269445、MW269447、MW269448） （表3）。

2.2? 蛋白理化特性及結(jié)構(gòu)域分析

利用ProtParam分析RpMYB2、RpMYB3、RpMYB5、RpMYB6蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（表4），蛋白的分子質(zhì)量在30.525 （RpMYB3）～34.781 （RpMYB2） ku，等電點(diǎn)為6.18～9.14，

其中，RpMYB2、RpMYB3屬堿性蛋白，RpMYB5、RpMYB6屬酸性蛋白。4個(gè)MYB蛋白的平均親水性是負(fù)值，說明其均為親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，RpMYB2、RpMYB3、RpMYB5、RpMYB6均由α-螺旋（alphahelix， Hh）、延伸鏈 （extendedstrand，Ee）、β-轉(zhuǎn)角 （betaturn，Tt） 和無規(guī)卷曲 （random coil，Cc） 組成，其中，RpMYB3、RpMYB5、RpMYB6主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲構(gòu)成，而RpMYB2主要由延伸鏈和無規(guī)卷曲構(gòu)成。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其均定位于細(xì)胞核，SignalP-5.0和TMHMM在線分析表明RpMYB2屬于跨膜蛋白，其余3個(gè)均無跨膜結(jié)? 構(gòu)域。

借助InterProScan與PROSITE對(duì)RpMYBs蛋白結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖2），顯示RpMYB2、RpMYB5含有1個(gè)HTH-MYB結(jié)構(gòu)域，屬于R1-MYB亞族，RpMYB3、RpMYB6是典型的R2R3-MYB，含有2個(gè)HTH-MYB結(jié)構(gòu)。

2.3? 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI和PlantTFDB數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、大豆、丹參、水稻、玉米、苦蕎麥、羊草7種植物MYB蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，篩選出相似度較高的序列，采用MEGA7軟件中的鄰接法進(jìn)行MYB蛋白分子演化分析。圖3結(jié)果表明，RpMYB2與RpMYB5被劃入R1-MYB家族，且RpMYB2與GmMYB176、RpMYB5與OsMYBS1蛋白序列相似性最高；RpMYB3與RpMYB6屬于R2R3-MYB類型的家族成員，RpMYB3與FtMYB15、RpMYB6與擬南芥S20亞家族中AtMYB62/116同源性較高，可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.4? 保守基序分析

利用在線軟件MEME對(duì)掌葉大黃4個(gè)MYB蛋白序列進(jìn)行保守基序分析（圖4）。結(jié)果表明，不同亞類的MYB基因包含的保守元件數(shù)量及種類存在差異。4個(gè)MYB序列中均包括Motif1，且存在3個(gè)均勻分布的氨基酸 （W） 殘基，可能是掌葉大黃MYB轉(zhuǎn)錄因子的特征基序，但每條序列中Motif所處位置不同，RpMYB3和RpMYB6中Motif1均位于近N端且與Motif2相鄰，而RpMYB2和RpMYB5中Motif1單獨(dú)位于序列中間區(qū)段內(nèi)。Motif3是R2R3亞族的特征基序，Motif4是R1亞族的特征基序，二者均含有6個(gè)氨基酸殘基，是最短基序。Motif2是最長(zhǎng)基序，包括48個(gè)氨基酸殘基。

2.5? 組織表達(dá)特異性

以根為參考樣本，qPCR檢測(cè)4個(gè) RpMYBs 基因在大黃根、根莖、葉片、葉柄和種子中的表達(dá)情況。從圖5可以看出，? RpMYB2在根中高表達(dá)，葉柄中低表達(dá)；? RpMYB3在種子中表達(dá)量最低，但在葉片中表達(dá)量為根中的4.39倍；相反的，? RpMYB5在葉片中的表達(dá)量?jī)H為根中的0.36倍，而在葉柄中表達(dá)量高；? RpMYB6在根中表達(dá)量最高，在其余器官中均較低。

2.6? 激素應(yīng)答分析

分析MYB基因于MeJA、SA、ABA激素處理下不同時(shí)間點(diǎn) （1、3、6、12、24 h） 的應(yīng)答情況 （圖6），以0 h（CK）為對(duì)照：? RpMYB2受SA誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，同Mock變化趨勢(shì)一致，且于24 h最高，為CK的3.57倍；MeJA處理1 h、3 h顯著上調(diào)基因表達(dá)；ABA處理1 h顯著上調(diào)，12 h、24 h受到顯著抑制。

RpMYB3受MeJA抑制表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，其中1、3、6 h與Mock相比表達(dá)量無差異，但于12 h最低，為CK的0.08倍；同樣，SA處理12 h顯著抑制基因表達(dá)；ABA處理24 h顯著上調(diào)，6 h下調(diào)表達(dá)。

RpMYB5受SA誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，24 h最高且與Mock相比無明顯變化；ABA處理也于24 h顯著上調(diào)基因表達(dá)；MeJA處理1 h顯著誘導(dǎo)。

RpMYB6受MeJA誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間推移呈逐漸上升趨勢(shì)，且于24 h最高，為CK的10.30倍；SA處理3 h顯著誘導(dǎo)表達(dá)且為CK的21.84倍，ABA處理6 h、12 h、24 h誘導(dǎo)表達(dá)，1 h抑制表達(dá)。

2.7? 非生物脅迫響應(yīng)

分析掌葉大黃無菌苗于不同脅迫處理下 RpMYBs 基因在不同時(shí)間點(diǎn) （1、3、6、12、24 h） 的響應(yīng)情況 （圖7），以0 h為對(duì)照：

RpMYB2受高溫脅迫誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量于24 h達(dá)峰值，且為CK的5.19倍；損傷脅迫3 h顯著誘導(dǎo)，為CK的2.44倍，1 h顯著抑制；干旱、低溫、鹽脅迫表達(dá)水平未見明顯變化。

RpMYB3受損傷脅迫抑制表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量于3 h達(dá)谷值，為CK的0.30倍；干旱和低溫處理均在24 h受到顯著抑制；相反，鹽和高溫處理均在24 h顯著誘導(dǎo)。

RpMYB5受損傷脅迫抑制表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量于24 h達(dá)谷值，為CK的0.14倍；干旱和高溫脅迫均在1 h、24 h誘導(dǎo)表達(dá)；鹽脅迫于12 h顯著抑制；低溫脅迫于3 h、6 h抑制表達(dá)。

RpMYB6受高溫脅迫誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間推移呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，且于24 h達(dá)峰值，為CK的4.68倍；受鹽、損傷脅迫抑制，均在24 h達(dá)谷值，且都為CK的0.09倍；干旱和低溫脅迫均在3 h上調(diào)表達(dá)。

3? 討? 論

MYB蛋白是植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、防御和應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因素［24］。鑒于此，對(duì)該類基因的研究不斷從模式植物向主要農(nóng)作物、藥用植物、園藝植物等方向擴(kuò)展，包括擬南芥［7］、小麥［25］、丹參［26］、棗樹［27］等。本研究利用RT-PCR技術(shù)從掌葉大黃中克隆到? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5和? RpMYB6的ORF序列，其中? RpMYB2編碼跨膜蛋白，可能介導(dǎo)細(xì)胞與外界之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并參與細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)、能量及信號(hào)的交換［28］，其余3個(gè)屬于非跨膜蛋白。4個(gè)目標(biāo)序列均具有熱穩(wěn)定性和親水性，對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均為核蛋白，推測(cè)基因主要在細(xì)胞核內(nèi)行使功能。

進(jìn)化樹分析主要用于基因家族成員分類及進(jìn)化關(guān)系研究，有助于推測(cè)親緣關(guān)系密切相關(guān)的蛋白家族成員的生物學(xué)功能。 RpMYBs 與其他7種植物MYBs的分子進(jìn)化分析表明，這些MYBs可分為兩個(gè)亞族，即R1-MYB和R2R3-MYB。其中? RpMYB2和? RpMYB5具有同源性，歸屬于R1-MYB亞族。? RpMYB2與? GmMYB176關(guān)系最近，R1-MYB轉(zhuǎn)錄因子? GmMYB176可調(diào)節(jié)大豆中異黃酮積累增加的關(guān)鍵基因? CHS8基因表達(dá)，從而促進(jìn)異黃酮生物合成［29］，推測(cè)? RpMYB2可能作用于苯丙烷類生物代謝途徑。同時(shí)? RpMYB2與? LcMYB2聚在一大支，猜測(cè)其可能具有干旱和ABA處理下促進(jìn)種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)的功能［30］。?? RpMYB5與? OsMYBS1親緣關(guān)系密切，而? OsMYBS1可抑制葡萄糖傳導(dǎo)因子HXK1的表達(dá)，使ABA活力下降，繼而促進(jìn)種子發(fā)芽及幼苗的早期發(fā)育［31］；類似地，? RpMYB3和? RpMYB6具有同源性，并且聚集在R2R3-MYB亞家族。?? RpMYB3與? FtMYB15親緣關(guān)系最近，推測(cè)其可能一定程度上參與植物花青素合成的調(diào)控［32］。? RpMYB6與擬南芥S20亞家族成員? AtMYB62和? AtMYB116聚在一支，可能通過赤霉素信號(hào)通路調(diào)節(jié)磷脅迫反應(yīng)［33］。然而，4個(gè)RpMYBs是否參與調(diào)控大黃蒽醌類化合物合成仍有待深入研究。

基因結(jié)構(gòu)是決定基因功能的前提。分析RpMYBs蛋白結(jié)構(gòu)域和保守基序發(fā)現(xiàn)，同一亞家族含有相似的結(jié)構(gòu)域和保守基序。R1-MYB類蛋白中所含Motif數(shù)量與分布不同，表明R1-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的空間位置保守性相對(duì)較低。而R2R3-MYB類蛋白中Motif類型和分布情況均較為相似，表明其在R2R3-MYB中的分布不具有隨機(jī)性，但具有較高的保守性，推測(cè)其在植物體內(nèi)發(fā)揮核心調(diào)控功能。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族雖在序列特征上相對(duì)保守，但在不同物種不同器官中功能呈現(xiàn)多樣化。擬南芥中? AtMYB33、? AtMYB65和? AtMYB101可促進(jìn)花藥和花粉發(fā)育［34］。? MoMYB53于葉中高表達(dá)，參與調(diào)控巴戟天子葉中黃酮醇的合成［35］。本研究采用SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，測(cè)定 RpMYBs基因在1 a生掌葉大黃不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，揭示? RpMYB2、? RpMYB6在根中高表達(dá)特性，推測(cè)可能通過調(diào)控大黃藥用部位根的生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝進(jìn)而影響大黃藥材品質(zhì)；? RpMYB3、? RpMYB5分別在葉片、葉柄中高表達(dá)，可能在地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。葉片直接暴露于大氣中，受到陽光和溫差變化的影響大，根深埋地下，受到土壤微生態(tài)顯著影響，這勢(shì)必導(dǎo)致MYB基因在表達(dá)水平做出響應(yīng)，從而可能在植物適應(yīng)環(huán)境和介導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物合成方面發(fā)揮重要作用。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，如調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育，影響代謝產(chǎn)物的合成和影響激素信號(hào)等［36］。擬南芥? AtMYB41通過促進(jìn)ABA積累參與植物脅迫反應(yīng)［37］。? CaMYB306通過調(diào)控MDA和H2O2含量、ROS清除酶活性及抗性相關(guān)基因的表達(dá)，負(fù)調(diào)控辣椒對(duì)低溫的響應(yīng)［38］。? MYB96既能通過CBFs途徑參與低溫反應(yīng)，又能通過ABA的信號(hào)通路調(diào)節(jié)其抗旱性［39］。本研究結(jié)果表明4個(gè)大黃 RpMYBs響應(yīng)激素和非生物脅迫ABA處理導(dǎo)致? RpMYB2表達(dá)下調(diào)，而高溫脅迫下24 h時(shí)顯著誘導(dǎo)其表達(dá)，說明? RpMYB2可能通過ABA信號(hào)通路參與高溫脅迫應(yīng)答。MeJA處理? RpMYB6顯著上調(diào)表達(dá)，且受低溫、高溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。MeJA是植物CBF/DREB1冷脅迫響應(yīng)途徑的早期關(guān)鍵信號(hào)［24］，而 RpMYB4［20］在MeJA和低溫脅迫處理下均下調(diào)表達(dá)，可能參與MeJA負(fù)調(diào)控凍害脅迫的耐受過程。? RpMYB2和? RpMYB4可能響應(yīng)冷脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更好地維持大黃生存，同時(shí)也為激素和冷信號(hào)通路互相協(xié)調(diào)傳遞和響應(yīng)寒冷信號(hào)的作用機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。? RpMYB3受MeJA應(yīng)答和高溫脅迫響應(yīng)表達(dá)趨勢(shì)一致，均在12 h達(dá)谷值后緩慢恢復(fù)，可能通過MeJA信號(hào)傳遞正調(diào)控高溫脅迫應(yīng)答。? RpMYB5可能通過ABA和SA信號(hào)途徑共同負(fù)調(diào)控大黃的機(jī)械損傷脅迫防御。 RpMYBs 基因響應(yīng)激素和非生物脅迫差異表達(dá)，表明它們可能通過參與多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)影響掌葉大黃的生理? 代謝。

4? 結(jié)? 論

基于掌葉大黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)掌葉大黃MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因克隆、生物信息學(xué)研究，并合理預(yù)測(cè)了其在掌葉大黃中的部分功能，為進(jìn)一步揭示 RpMYBs 基因功能探究其生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為掌葉大黃蒽醌類成分合成調(diào)控及遺傳改良提供科學(xué)支撐。

參考文獻(xiàn)? Reference：

［1］? 張椿雨，龍? 艷，馮? 吉，等.植物基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控及其生物學(xué)意義 ［J］.遺? 傳，2007（7）：793-799.

ZHANG CH Y，LONG Y，F(xiàn)ENG J，et al.Transcriptional regulation of plant genes and its signifi-cance biology ［J］.Proceedings of the National Academy of SciencesProceedings of the National Academy of Sciences，2007（7）：793-799.

［2］? CONE K C，BURR F A，BURR B.Molecular analysis of the maize anthocyanin regulatory locus C1 ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences USA，1986，83：9631-5.

［3］? ABDULLAH-ZAWAWI M R，AHMAD-NIZAMMUDDIN N F，Govender N，et al.Comparative genome-wide analysis of WRKY，MADS-box and MYB transcription factor families in Arabidopsis and rice ［J］. Scientific Reports，2021，11：19678.

［4］? 楊敬天，黎? 華，趙? 歡，等.過路黃MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的挖掘及鑒定 ［J］.中草藥，2022，53（16）：5149-5158.

YANG J T，LI H，ZHAO H，et al.Excavation and identification of members of MYB transcription factor family in Lysimachia christinae ［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2022，53（16）：5149-5158.

［5］? 居利香，雷? 欣，趙成志，等.辣椒MYB基因家族的鑒定及與辣味關(guān)系分析 ［J］.園藝學(xué)報(bào)，2020，47（5）：875-892.

JU L X，LEI X，ZHAO CH ZH，et al.Identification of MYB family genes and its relationship with pungency of? pepper［J］. Acta Horticulturae Sinica ，2022，47（5）：875-892.

［6］? OGATA K，KANEI-ISHII C，SASAKI M，et al.The cavity in the hydrophobic core of Myb DNA-binding domain is reserved for DNA recognition and trans-activation ［J］. Nature Structural and Molecular Biology，1996，3：178-187.

［7］? DUBOS C，STRACKE R，GROTEWORD E，et al.MYB transcription factors in Arabidopsis［J］.Trends in Plant Science，2010，15：573-581.

［8］? ROSINSKI J A，ATCHLEY W R.Molecular evolution of the Myb family of transcription factors：evidence for polyphyletic origin ［J］. Journal of Molecular Evolution，1998，46：74-83.

［9］? 位欣欣，蘭海燕.植物MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控次生代謝及逆境響應(yīng)的研究進(jìn)展 ［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（8）：12-23.

WEI X X，LAN H Y.Advances in the regulation of plant MYB transcription factors in secondary metabolism and stress response ［J］. Biotechnology Bulletin ，2022，38（8）：12-23.

［10］? STRACKE R，ISHIHARA H，HUEP G，et al.Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of the Arabidopsis thaliana seedling ［J］. Plant Journal， 2007，50：660-677.

［11］? RAMALINGAM A，KUDAPA H，PAZHAMALA L T，et al.Gene expression and yeast two-hybrid studies of 1R-MYB transcription factor mediating drought stress response in chickpea（Cicer arietinum L.） ［J］. Frontiers in Plant Science，2015，6：1117.

［12］? HAO S X，LU Y F，PENG Z，et al.? McMYB4 improves temperature adaptation by regulating phenylpropanoid metabolism and hormone signaling in? apple［J］. Horticulture Research，2021，8：182.

［13］? YANG L，ZHAO X，RAN L Y，et al.? PtoMYB156 is involved in negative regulation of phenylpropanoid metabolism and secondary cell wall biosynthesis during wood formation in? poplar［J］. Scientific Reports， 2017，7：41209.

［14］? PRESTON J，WHEELER J，HEAZLEWOOD J，et al. AtMYB32 is required for normal pollen development in Arabidopsis thaliana ［J］. Plant Journal，2004，40：979-995.

［15］? 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2020.

Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China［M］. Beijing：China Pharmaceutical Science and Technology Press，2020.

［16］? 陳艷琰，唐于平，陳嘉倩，等.大黃資源化學(xué)研究進(jìn)展與利用策略 ［J］.中草藥，2018，49（21）：5170-5178.

CHEN Y Y，TANG Y P，CHEN J Q，et al.Research progress and utilization strategy on resource chemistry of Rhei Radix et Rhizoma［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2018，49：5170-5178.

［17］? DONG N Q，LIN H X，Contribution of phenylpropanoid metabolism to plant development and plant-environment interactions ［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63：180-209.

［18］? PERASSOLO M，QUEVEDO C，BUSTO V，et al.Enhance of anthraquinone production by effect of praline and aminoindan-2-phosphonic acid in Rubia linctorum suspension cultures ［J］. Enzyme and Microbial Technology，2007，41：181-185.

［19］? 李元敏.掌葉大黃MYB轉(zhuǎn)錄因子基因克隆與特征研究 ［D］.陜西咸陽：陜西中醫(yī)藥大學(xué)，2021.

LI Y M.Cloning and characterization of MYB transcription factor gene in? Rheum palmatum? L ［D］.Xianyang Shaanxi：Shaanxi University of Chinese Medicine，2021.

［20］? 黑小斌，李依民，李? 歡，等.掌葉大黃種子特性研究及無菌培養(yǎng)體系的構(gòu)建［J］.中草藥，2019，50（18）：4430-4437.

HEI X B，LI Y M，LI H，et al.Investigation on seeds characteristics and establishment of aseptic cultural system for? Rheum palmatum? ［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs ，2019，50（18）：4430-4437.

［21］? 李元敏，張? 娜，李? 慧，等.掌葉大黃轉(zhuǎn)錄因子? RpMYB4基因克隆及分子表達(dá)特性 ［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2021，56（4）：1170-1177.

LI Y M，ZHANG N，LI H，et al.Cloning and expression characteristics of a transcription factor gene? RpMYB4? in? Rheum palmatum? L.［J］. Acta Pharmaceutica Sinica， 2021，56（4）：1170-1177.

［22］? 王寧杭，陸丹迎，常鵬杰，等.望春玉蘭實(shí)時(shí)定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選 ［J］.分子植物育種，2019，17（11）：3674-3680.

WANG N H，LU D Y，CHANG P J，et al.Selection of internal reference genes in real-time quantitative PCR analysis of Magnolia biondii［J］. Molecular Plant Breeding，2019，17（11）：3674-3680.

［23］? LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-CT method ［J］. Methods，2001，25：402-408.

［24］? 邱文怡，王詩雨，李曉芳，等.MYB轉(zhuǎn)錄因子參與植物非生物脅迫響應(yīng)與植物激素應(yīng)答的研究進(jìn)展 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，32（7）：1317-1328.

QIU W Y，WANG SH Y，LI X F，et al.Functions of plant MYB transcription factors in response to abiotic stress and plant hormones ［J］. Acta Agriculturae Zhejiangensis， 2020，32（7）：1317-1328.

［25］? 王延謙，張? 波，陳文杰，等.小麥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子 TaMYB3-4D的克隆及功能分析 ［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2015，35（4）：646-652.

WANG Y Q，ZHANG B，CHEN W J，et al.Cloning and functional verification of R2R3-MYB transcription factor? TaMYB3-4D? in wheat［J］. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2015，35（4）：646-652.

［26］? 彭晶晶，李? 凱，楊? 靖，等.丹參轉(zhuǎn)錄因子SmMYB52的基因克隆、表達(dá)分析和亞細(xì)胞定位 ［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2021，40（2）：802-808.

PENG J J，LI K，YANG J，et al.Gene clone， expression?? analysis and subcellular localization of transcription factor?? SmMYB52 in Salvia miltiorrhiza ［J］. Genomics and Applied Biology，2021，40（2）：802-808.

［27］? 王軍曉，李? 婷，馬志博，等.棗樹MYB基因家族鑒定、果實(shí)表達(dá)和鹽脅迫響應(yīng)研究 ［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，? 37（2）：20-28，36.

WANG J X，LI T，MA ZH B，et al.Identification，fruitexpression and response to salt stress of MYB gene family in Ziziphus jujuba ［J］. Journal of Northwest Forestry?? University， 2022，37（2）：20-28，36.

［28］? 宋江華，張立新.植物跨膜蛋白研究進(jìn)展 ［J］.生物學(xué)雜志，2009，26（6）：62-64.

SONG J H，ZHANG L X.Progress on the transmembrane protein in plants ［J］. Journal of Biology， 2009，26（6）：62-64.

［29］? LI X Y，DHAUBHADEL S.14-3-3 proteins act as scaffolds for? GmMYB62 and? GmMYB176 and regulate their intracellular localization in soybean ［J］. Plant Signaling and Behavior，2012，7：965-968.

［30］ ?ZHAO P C，HOU S L，GUO X F，et al.A MYB-related transcription factor from? sheepgrass， LcMYB2，promotes seed germination and root growth under drought stress ［J］. BMC Plant Biology，2019，19：564.

［31］? CHEN Y S，CHAO Y C，TSENG T W，et al.Two MYB-related transcription factors play opposite roles in sugar signaling in Arabidopsis ［J］. Plant Molecular Biology，2017，93：299-311.

［32］? ZHANG K X，LOGACHEVA M D，MENG Y，et al.Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum ［J］. Journal of Experimental Botany，2018，69：1955-1966.

［33］? DEVAIAH B N，MADHUVANTHI R，KARTHIKEYAN A S，et al.Phosphate starvation responses and gibberellic acid biosynthesis are regulated by the? MYB62? transcription factor in Arabidopsis ［J］. Molecular Plant，2009，2：43-58.

［34］? COSTACHE A，BERGHI ON，CERGAN R，et al.Respiratory allergies：Salicaceae sensitization （Review） ［J］. Experimental and Therapeutic Medicine，2021，21（6）：609.

［35］? 謝德金，葉友杰，楊德明，等.基于巴戟天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和分析 ［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（1）：160-167.

XIE D J，YE Y J，YANG D M，et al.Identification and?? analysis of the R2R3-MYB transcription factor based on a transcriptome database in Morinda officinalis ［J］. Acta Pharmaceutica Sinica ，2020，55（1）：160-167.

［36］? 杜恬恬，李會(huì)萍，王博雅，等.梁山慈竹? DfMYB3基因克隆及啟動(dòng)子分析 ［J］.植物研究，2021，41（5）：729-737.

DU T T，LI H P，WANG B Y，et al.Cloning and promotor analysis of?? DfMYB3? from Dendrocalamus farinosus ［J］. Bulletin of Botanical Research， 2021，41（5）：729-737.

［37］? LIPPOLD F，SANCHEZ D H，MUSIALAK M，et al.? AtMYB41? regulates transcriptional and metabolic responses to osmotic stress in Arabidopsis ［J］. Plant Physiology，2009，149：1761-72.

［38］? MA X，YU Y N，JIA J H，et al.The pepper? MYB transcription factor? CaMYB306? accelerates fruit coloration and negatively regulates cold resistance ［J］. Scientia Horticulturae，2022，295：110892.

［39］? LEE H G，SEO P J. MYB96 recruits the HDA15 protein to suppress negative regulators of ABA signaling in Arabidopsis ［J］. Nature Communications，2019，10：1713.

Molecular Cloning and Stress Expression of Four MYB

Transcription Factors in? Rheum palmatum

ZHAO Xia1，2， LI Yuanmin1，3， LI Yimin1，2， HU Xiaochen1，2， GAO Jing1，2， YAN Yonggang1，2 and? ZHANG Gang1，2

（1.College of Pharmacy and Shaanxi Qinling Application Development and Engineering Center of Chinese Herbal

Medicine，Shaanxi University of Chinese Medicine， Xian? 712046， China; 2.Key Laboratory for Research and

Development of? “Qin Medicine”?? of Shaanxi Administration of Traditional Chinese Medicine， Shaanxi

University of Chinese Medicine， Xian? 712046，China; 3.The Second Affiliated Hospital

of Shaanxi University of Chinese Medicine， Xian? 712046， China）

Abstract? In this study，we searched the transcriptome database to obtain the sequence information of four MYB gene family members，?? RpMYB2，?? RpMYB3，?? RpMYB5 and?? RpMYB6 genes. The corresponding physicochemical properties， phylogenetic relationships， tissue-specific expression， and induced expression under hormonal and abiotic stresses were analyzed. The results showed that?? RpMYB2，?? RpMYB3，?? RpMYB5 and?? RpMYB6 encoded 333， 275， 293 and 291 amino acids with molecular masses of 34.781， 30.525， 31.243 and 33.313 ku， respectively， and the four RpMYBs proteins were all hydrophilic proteins with high thermal stability， except for?? RpMYB2. The remaining three gene structures were mainly α-helix and randomly coiled， and all of them were localized in the nucleus. Analysis of the protein structural domains and conserved motifs revealed that?? RpMYB2 and?? RpMYB5 contained one HTH-MYB structural domain， and?? RpMYB3 and?? RpMYB6 contained two HTH-MYB structural domains， and there were differences in the number and types of conserved elements contained in different MYB transcription factors. Phylogenetic analysis showed that?? RpMYB2 and?? RpMYB5 belonged to the R1-MYB subfamily， and?? RpMYB3 and?? RpMYB6 belonged to the R2R3-MYB subfamily， consistent with their structural domain classification. The protein structural domains and phylogenetic trees consistently indicated that?? RpMYB2 and?? RpMYB5 belonged to the R1-MYB subfamily， and?? RpMYB3 and?? RpMYB6 belonged to the R2R3-MYB subfamily. Real-time fluorescence quantification revealed that?? RpMYB2 and? ?RpMYB6 were the most highly expressed in roots， and?? RpMYB3 and?? RpMYB5 were highly expressed in leaves and petioles. Respectively，?? RpMYB5 peaked at 24 h when treated with 200 μmol·L-1 abscisic acid （ABA）. The highest expression of?? RpMYB6 was induced by 200 μmol·L-1 methyl jasmonate （MeJA）， and the expression level increased gradually with time and was 10.30 times higher at 24 h than at 0 h， and inhibited?? RpMYB3 expression. 200 μmol·L-1 salicylic acid （SA） induced the most pronounced expression of ??RpMYB6 at 21.84 fold. The expression of? RpMYBs? also varied under abiotic stress treatments.?? RpMYB2 was induced by high temperature.?? RpMYB3 was inhibited by damage and high temperature.?? RpMYB5 was inhibited by damage stress.?? RpMYB6 responded to high temperature and salt stress response. This study provides a foundation for the functional identification of RpMYBs ， which will be useful for the development of germplasm innovation and molecular breeding of R. palmatum L.

Key words? ?Rheum palmatum; MYB; Expression analysis; Stress; qRT-PCR

Received ??2023-01-05??? Returned? 2023-03-07

Foundation item? National Natural Science Foundation of China（No.82104334，No.81973430）; Middle Youth Science and Technology Innovation Leaders of Xianyang Municipality （No.L2022CXNLRC009）;Project for Discipline Innovation Team of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine（No.2019-QN01）.

First author? ZHAO Xia， female，master student.Research area：molecular biopharmacology.?? E-mail：2443284316@qq.com

LI Yuanmin， female，master student.Research area：molecular biopharmacology.E-mail：1272151264@qq.com

Corresponding?? author? ZHANG Gang，male，professor.Research area：molecular biopharmacology.? E-mail：jay_gumling2003@aliyun.com

LI? Yimin，female，associate professor.Research area：molecular biopharmacology.E-mail：2051058@sntcm.edu.cn

（責(zé)任編輯：郭柏壽? Responsible editor：GUO Baishou）