基于Hepcidin和JAK2/STAT3信號通路探討通痹顆粒對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠的影響

吳伊瑩 柳玉佳 廖亮英 范伏元 郭志華

〔摘要〕 目的 研究通痹顆粒對膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis， CIA）大鼠鐵調素（hepcidin， Hepc）、Janus激酶（janus kinase， JAK）2/信號轉導子和轉錄激活子（signal transduction and activator of transcription， STAT）3信號通路的影響。方法 選取36只雌性SD大鼠隨機分成空白組、模型組、陽性對照組和通痹顆粒低、中、高劑量組，每組6只。空白組不予處理，其余組用牛Ⅱ型膠原建立CIA模型。造模完成后，空白組、模型組予生理鹽水灌胃，其余各組分別以巴瑞替尼片和低、中、高劑量通痹顆粒灌胃。每天1次，連續(xù)4周。HE染色行滑膜組織病理學觀察；酶聯(lián)免疫吸附法測定血清Hepc、白細胞介素6（interleukin 6， IL-6）水平；逆轉錄-聚合酶鏈反應法測定滑膜中JAK2、STAT3、細胞信號因子傳導抑制體（suppressor of cytokine signaling， SOCS）1、SOCS3的mRNA相對表達量；Western blot法檢測滑膜中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3的蛋白表達量。結果 模型組見滑膜上皮結構缺損，滑膜重度增生，排列紊亂，并有大量炎癥細胞浸潤和多個血管翳形成；各給藥組滑膜炎癥均有所減輕，陽性對照組優(yōu)于通痹顆粒高劑量組，通痹顆粒中、高劑量組優(yōu)于低劑量組。與模型組相比，各給藥組關節(jié)炎指數(shù)評分、血清Hepc和IL-6水平均顯著降低（P＜0.01）；與陽性對照組相比，通痹顆粒中、低劑量組關節(jié)炎指數(shù)評分、血清Hepc和IL-6水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和通痹顆粒低、中、高劑量組JAK2、STAT3 mRNA和蛋白以及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達量均降低（P＜0.05），而通路抑制因子SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白的表達均升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，通痹顆粒各劑量組JAK2、STAT3 mRNA和蛋白以及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達量均升高（P＜0.05），而SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白的表達均降低（P＜0.05）。結論 通痹顆粒能夠改善CIA大鼠滑膜炎癥，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路而減少Hepc的表達有關。

〔關鍵詞〕 類風濕關節(jié)炎；膠原誘導性關節(jié)炎；中藥；通痹顆粒；鐵調素；JAK2/STAT3信號通路

〔中圖分類號〕R285? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.005

Effects of Tongbi Granule on collagen-induced arthritis rats based on Hepcidin and JAK2/STAT3 signaling pathway

WU Yiying1，2， LIU Yujia1， LIAO Liangying1， FAN Fuyuan1， GUO Zhihua2*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the effects of Tongbi Granule on hepcidin （Hepc） and janus kinase （JAK） 2/signal transduction and activator of transcription （STAT） 3 signaling pathway in collagen-induced arthritis （CIA） rats. Methods A total of 36 female SD rats were randomized into blank， model， positive control， low-， medium-， and high-dose of Tongbi Granule groups， with six rats in each group. CIA model was constructed with bovine type Ⅱ collagen in all groups except the blank group. After modeling， the blank and model groups were given normal saline by gavage， the other groups were given baricitinib tablets， and low-， medium-， and high-dose of Tongbi Granule by gavage respectively， once a day， for continual four weeks. HE staining was performed to observe pathological synovial tissue. Serum Hepc and interleukin 6 （IL-6） levels were measured by ELISA. The mRNA relative expressions of JAK2， STAT3， suppressor of cytokine signaling （SOCS） 1， and SOCS3 in synovium were determined by RT-PCR. Western blot was used to test the protein expressions of JAK2， p-JAK2， STAT3， p-STAT3， SOCS1 and SOCS3 in synovium. Results In the model group， there were defects of synovial epithelium， severe synovial hyperplasia， disordered arrangement， and a large number of inflammatory cell infiltration and pannus formation. However， all administration groups showed reduction of synovial inflammation， the positive control group was better than the high-dose Tongbi Granule group， and the medium- and high-dose groups was better than the low-dose group. Compared with model group， arthritis index scores， and levels of serum Hepc and IL-6 were significantly lower in all drug administration groups （P<0.01）. Compared with the positive control group， the arthritis index scores， serum Hepc and IL-6 levels in low- and medium-dose Tongbi Granule groups were higher （P<0.05）. Compared with model group， the mRNA and protein expressions of JAK2 and STAT3， as well as the protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were lower （P<0.05）， while the mRNA and protein expressions of pathway inhibitors SOCS1 and SOCS3 were higher in positive control group and low-， medium-， and high-dose Tongbi Granule groups （P<0.05）. Compared with positive control group， the mRNA and protein expressions of JAK2 and STAT3， and the protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were higher in Tongbi Granule groups of various doses （P<0.05）， while the mRNA and protein expressions of SOCS1 and SOCS3 were lower （P<0.05）. Conclusion Tongbi Granule can relieve synovial inflammation in CIA rats， and its mechanism may be related to inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathway and reducing the expression of Hepc.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 rheumatoid arthritis; collagen-induced arthritis; Chinese medicines; Tongbi Granule; hepcidin; janus kinase 2/signal transduction and activator of transcription 3 signaling pathway

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種臨床常見的免疫介導性疾病，以持續(xù)的滑膜炎癥和不可逆的軟骨、骨損傷為主要臨床特點[1]。隨著對RA發(fā)病機制研究的不斷深入，對小分子靶向藥和生物制劑的探索使用，RA的臨床緩解率已經得到了提高，但仍有部分患者遷延難愈[2]。且常規(guī)治療策略中糖皮質激素、抗風濕藥的大劑量、頻繁和長期給藥，不可避免地導致不良反應，患者依從性差[3]?；ぱ缀凸瞧茐氖荝A治療的主要切入點，但在臨床中RA的滑膜炎和骨破壞并非完全一致。當滑膜炎癥被控制、病情活動度逐漸降低時，軟骨損傷和骨侵蝕仍可繼續(xù)發(fā)展[4]；即使是針對非炎癥的RA治療，以破骨細胞為靶點同樣可以緩解其骨破壞[5]。因此，在控制關節(jié)炎癥的同時，尋找滑膜炎和骨破壞機制中共同的作用靶點，具有重要臨床意義[6]。

鐵調素（hepcidin， Hepc）具有調節(jié)機體鐵狀態(tài)、參與炎癥反應、增強機體防御機制的重要作用，Hepc作為一種炎癥介質參與了RA滑膜炎的發(fā)病，還是破骨細胞生成的關鍵調節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)，Hepc的過表達可能與RA滑膜炎和骨破壞共同相關[7]。炎癥信號Janus激酶（janus kinase， JAK）2/信號轉導子和轉錄激活子（signal transduction and activator of transcription， STAT）3通路與Hepc的分泌相互關聯(lián)促進，是調節(jié)Hepc的主要信號通路[8]。免疫反應時，炎癥因子白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）與細胞受體結合激活STAT3，激活的STAT3與Hepc啟動子結合進而增加Hepc的水平，是Hepc的調控因子[9]。

通痹顆粒是由當歸、黃芪、白芥子、血竭、甘草、僵蠶等多種藥物組成，用于治療血虛痰瘀證RA活動期患者。前期研究表明，通痹顆粒對RA滑膜炎和骨破壞均有一定改善作用[10-12]，但具體機制尚未完全明確。本實驗通過研究通痹顆粒對RA模型膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced Arthritis， CIA）大鼠Hepc、JAK2/STAT3信號通路、IL-6及細胞信號因子傳導抑制體（suppressor of cytokine signaling， SOCS）的作用，進一步明確通痹顆粒治療RA的可能作用機制，以期為中藥治療RA研究提供依據(jù)并指導臨床治療。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

雌性健康SPF級SD大鼠36只，體質量（200±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級中心實驗室，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～60%，通風、光照良好，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。本實驗嚴格按照倫理委員會的審查執(zhí)行，倫理審批號：20201010-35。

1.2? 主要藥物與試劑

通痹顆粒（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑，主要成分是當歸、黃芪、血竭、白芥子、僵蠶、甘草等，規(guī)格：10 g×6包）；巴瑞替尼片（美國禮來公司，批號：H20190039，規(guī)格：2 mg×28片）。

牛Ⅱ型膠原（北京凱詩源生物科技有限公司，貨號：T07-0597）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號：F5881）；兔抗JAK2試劑盒、兔抗STAT3試劑盒、兔抗p-STAT3試劑盒（北京Bioss公司，貨號：bs-23003R、bsm-52235R、bs-22386R）；兔抗p-JAK2試劑盒、兔抗SOCS1試劑盒、兔抗SOCS3試劑盒（美國Affinity公司，貨號：AF3024-100、AF5378、DF6133）；Hepcidin ELISA試劑盒（上海齊源生物科技有限公司，貨號：E4693-100）；IL-6 ELISA試劑盒（武漢艾迪抗生物科技有限公司，貨號：AD40134）。

1.3? 主要儀器

熒光定量RCP儀（美國Bio-rad公司，型號：CFX）；超微量分光光度計（美國Thermo公司， 型號：NanoDrop2000）；電泳儀、轉膜儀（中國北京六一有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-40D）；生物樣品均質儀（杭州奧盛公司，型號：BioPrep-24）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（廣州勤翔有限公司，型號：Chemiscope6100）。

1.4? 造模與分組

將實驗大鼠隨機分為6組：空白組、模型組、陽性對照組和通痹顆粒低、中、高劑量組，每組6只?？瞻捉M不予處理，其余各組予牛Ⅱ型膠原誘導造模，具體如下：取牛Ⅱ型膠原溶解于冰醋酸并充分乳化，將乳化后的溶液與完全弗氏佐劑充分混合，制備牛Ⅱ型膠原試劑；將配制好的試劑皮下注射于大鼠于尾部進行初次免疫，量約為0.2 mg，2周后再以0.1 mg于尾部進行再次免疫；4周后進行模型判定，當免疫后CIA大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分≥6分，則為造模成功[10]。

1.5? 實驗給藥

造模成功后，空白組、模型組予等量生理鹽水灌胃，其他各組藥物均按照人-大鼠體表面積進行換算，以正常人體質量70 kg進行計算，大鼠體質量平均為210 g，換算系數(shù)6.3[13]。其中，陽性對照組以巴瑞替尼片換算為人臨床等效劑量，換算后的等效劑量為0.18 mg/（kg·d）；通痹顆粒低、中、高劑量組分別換算為等效劑量的1/2、1、2倍，換算后分別為0.9、1.8、3.6 g/（kg·d）。均每天灌胃1次，連續(xù)4周。

1.6? 取材及指標檢測

1.6.1? 關節(jié)炎指數(shù)評分? 在造模成功后（第0天）及藥物治療過程（第7、14、21、28天）共計5次評分，根據(jù)大鼠關節(jié)受累程度不同進行相應的評分，具體如下：無任何關節(jié)紅腫為0分；僅足趾關節(jié)紅腫評為1分；足底及足趾均紅腫評為2分；踝關節(jié)以下全部紅腫評為3分；全部足踝關節(jié)均紅腫則評為4分。將大鼠4個關節(jié)的評分加起來所得分數(shù)即為大鼠的關節(jié)炎指數(shù)評分，最大值為16分[14]。關節(jié)炎指數(shù)評分越高，則大鼠關節(jié)炎癥狀越嚴重。

1.6.2? 取材及處理? 治療4周后處死所有大鼠，予以腹主動脈采血，4 ℃靜置4 h，3 500 r/min離心10 min（離心半徑15 cm），取上清液用于血清Hepc、IL-6水平檢測；將大鼠的左膝關節(jié)滑膜剝離，福爾馬林液固定，用于滑膜組織病理形態(tài)學觀察；將大鼠的右膝關節(jié)滑膜剝離，放入液氮中速凍，-80 ℃條件下封存，用于JAK2/STAT3信號通路相關基因和蛋白檢測。

1.6.3? 滑膜組織病理學觀察? 取固定好的滑膜組織，石蠟包埋，制作切片，HE染色，光鏡下（×200）行組織形態(tài)學觀察。

1.6.4? 酶聯(lián)免疫吸咐法測定各組大鼠血清Hepc、IL-6水平? 取離心好的血清室溫靜置30 min，使用酶聯(lián)免疫吸咐法測定血清Hepc、IL-6水平，具體流程嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.6.5? 逆轉錄-聚合酶鏈反應法測定滑膜組織中JAK2、STAT3、SOCS1、SOCS3的mRNA相對表達量? 使用Trizol法提取滑膜組織的總RNA，超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，逆轉錄后獲取互補的cDNA，使用逆轉錄-聚合酶鏈反應進行定量擴增。具體為：預變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s→60 ℃

30 s，擴增循環(huán)40次。以GAPDH為內參，對目的基因的擴增溶解曲線進行逆轉錄-聚合酶鏈反應程序分析，采用2-△△ct法計算目的mRNA的相對表達量。基因引物序列詳見表1。

1.6.6? Western blot法檢測滑膜組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3的蛋白表達

將粉碎的滑膜組織進行冰上裂解，裂解后離心并取上層清液，使用BCA法測定相關蛋白濃度，Western blot法電泳后轉印于NC膜封閉過夜，將一抗按比例稀釋后與膜一起孵育，4 ℃過夜，次日室溫放置90 min，PBST洗3次；二抗與膜共同室溫孵育90 min后，PBST洗3次，進行ECL顯色，并曝光。曝光后底片掃滿，以GAPDH為內參，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)軟件分析分子量和灰度值。

1.7? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件，計量資料以“ｘ±s”表示。若滿足正態(tài)分布和方差齊性者，行單因素方差分析和LSD檢驗；方差不齊者則采用Tamhane' T2法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分變化

造模后，與空白組相比，其余各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)積分顯著上升（P＜0.01）。經治療7 d后，陽性對照組和通痹顆粒各劑量組關節(jié)炎指數(shù)評分達到高峰。經治療28 d后，與模型組相比，通痹顆粒高、中、低劑量組及陽性對照組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與陽性對照組比較，通痹顆粒中、低劑量組CIA大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2? 各組大鼠滑膜組織病理學觀察

空白組滑膜上皮細胞形態(tài)結構正常，脂肪細胞無明顯異常，未見明顯炎癥增生；模型組見滑膜上皮結構缺損，滑膜重度增生，排列紊亂，并有大量炎癥細胞浸潤和多個血管翳形成；陽性對照組滑膜結構基本正常，滑膜輕度增生，少量炎癥細胞，較模型組明顯改善；通痹顆粒低劑量組見滑膜上皮結構缺損，滑膜重度增生，炎癥細胞浸潤及血管翳形成，較模型組稍輕；通痹顆粒中、高劑量組均見中度滑膜增生及炎癥細胞浸潤，較低劑量組均減輕，且高劑量組炎癥細胞浸潤及滑膜增生比中劑量組略輕。詳見圖2。

2.3? 各組大鼠血清Hepc、IL-6水平比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠血清Hepc、IL-6水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，通痹顆粒高、中、低劑量組和陽性對照組血清Hepc、IL-6水平均降低（P＜0.05）。與陽性對照組比較，通痹顆粒中、低劑量組血清Hepc、IL-6水平均升高（P＜0.05），通痹顆粒高劑量組血清Hepc、IL-6水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.4? 各組大鼠滑膜組織JAK2、STAT3、SOCS1、SOCS3的mRNA表達量比較

與空白組比較，其余各組大鼠滑膜JAK2、STAT3的mRNA表達均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的mRNA表達均降低（P＜0.05）。與模型組比較，通痹顆粒高、中、低劑量及陽性對照組JAK2、STAT3的mRNA表達均降低（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的mRNA表達均升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，通痹顆粒各劑量組JAK2、STAT3的mRNA表達均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的mRNA表達均降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.5? 各組大鼠滑膜組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3蛋白表達比較

與空白組比較，其余各組大鼠滑膜JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3蛋白表達均降低（P＜0.05）。與模型組比較，通痹顆粒高、中、低劑量組和陽性對照組滑膜JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達均降低（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的蛋白表達均升高（P＜0.05）。與陽性對照組比較，通痹顆粒各劑量組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達均升高（P＜0.05），SOCS1、SOCS3的蛋白表達均降低（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

3 討論

RA是一種炎癥性、慢性自身免疫性關節(jié)疾病，當固有免疫和適應性免疫系統(tǒng)發(fā)生異常時，免疫耐受失衡誘發(fā)的損傷顯得尤為關鍵，這一系列事件將導致持續(xù)的關節(jié)炎癥、增生性滑膜炎，并最終引起基底層軟骨和軟骨下骨的損傷，導致永久性關節(jié)破壞、畸形和功能喪失[15]。由于RA常規(guī)治療藥物并不能完全滿足臨床，且存在藥物相關的耐藥性、經濟負擔和毒副作用等原因[16]，中醫(yī)藥辨證論治的獨特優(yōu)勢在RA治療中逐漸凸顯出來。中醫(yī)從整體入手，扶正與祛邪并行，具有多靶點調節(jié)、療效確切、毒副作用小等特點，在臨床中得到了廣泛應用。

RA屬于中醫(yī)學“尪痹”“骨骱痹”等范疇。《諸病源候論·風濕痹候》載：“由氣血虛，則受風濕，而成此病?！薄夺t(yī)級·痹》云：“痹非三氣，患在痰瘀?！彼伢w正氣虧虛，則易感受風寒濕邪為患；久痹不愈，則易成瘀血痰濁而遷延受損。基于RA的病機特點和前期研究[17-18]，本課題組提出了RA的基本病機是“虛、瘀、痰”，以此為基礎制定了益氣養(yǎng)血、化痰逐瘀的經驗協(xié)定方劑通痹顆粒。方中當歸為君，溫養(yǎng)活血，舒筋通脈；黃芪為臣，充養(yǎng)元氣，配伍當歸以共資氣血生化，氣血雙補；血竭散瘀和血止痛，僵蠶、白芥子豁痰散結、通利消腫，皆為佐藥；甘草為使，緩急溫中健脾，調和諸藥。既往課題組研究表明，通痹顆粒對RA滑膜炎和骨破壞均有一定的改善作用[19]。黃芪已被證實可調節(jié)阿爾茨海默病模型小鼠腦組織Hepc的表達[19]，并可通過JAK2、STAT3免疫炎癥相關通路治療RA[20]；當歸的有效成分當歸多糖對慢性炎癥貧血大鼠Hepc的表達具有抑制效應[21]。因此，通痹顆?？赡芡ㄟ^Hepc和JAK2/STAT3信號通路對RA發(fā)揮治療作用。

Hepc是一種具有抗菌特性的肝源性肽，最早于20世紀初從人的血清和尿液中提純發(fā)現(xiàn)，主要由炎癥細胞因子尤其是IL-6誘導產生，具有調節(jié)鐵代謝和參與人體炎癥防御反應的重要功能[22]。研究表明，Hepc可以反映RA患者的疾病活動度，其高表達可以直接加劇RA的炎癥程度，是RA疾病活動度增強的重要原因[23]。促炎因子在RA的病變進程中發(fā)揮重要作用，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）、IL-6和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GMCSF）等驅動了RA持續(xù)性滑膜炎和全身并發(fā)癥[24]。IL-6作為RA臨床發(fā)病前的關鍵調節(jié)因子，在RA早期滑膜炎的維持和造成關節(jié)破壞中發(fā)揮主要介導效應。研究發(fā)現(xiàn)，與健康者對比，RA組血清Hepc水平顯著升高，且與IL-6的表達和RA疾病活動度評分呈正相關，提示Hepc可能直接參與了慢性炎癥的發(fā)病過程[25]；通過藥物對IL-6進行抑制，Hepc表達量明顯減少，證明IL-6與Hepc之間具有高度相關性[26]。另有研究證實，Hepc在RA中的升高與骨破壞標志物正相關，Hepc的分泌增加促進破骨細胞生成和骨小梁破壞丟失，提示Hepc可能參與RA的骨破壞[27]；而Hepc的負調節(jié)因子紅富鐵激素可調節(jié)成骨細胞中骨形成蛋白的信號傳導、減少核因子-κβ受體活化因子配體的產生，限制破骨細胞生成，具有骨保護作用[28]。因此，Hepc、IL-6與RA的滑膜炎和骨破壞共同相關。本研究發(fā)現(xiàn)，通痹顆粒對CIA大鼠滑膜炎癥具有明顯改善作用，可減少滑膜增生和炎癥細胞浸潤，并且對大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分具有一定降低作用。與模型組相比，陽性對照組和通痹顆粒各劑量給藥組均能有效降低CIA血清Hepc和IL-6水平，且陽性對照組療效最佳，通痹顆粒高劑量與陽性對照組之間無明顯差異，提示Hepc與RA的炎癥狀態(tài)存在一定正相關性，推測通痹顆粒緩解RA滑膜炎和骨破壞的機制可能與降低血清的Hepc和IL-6水平有關，且通痹顆粒的療效可能存在一定的劑量依耐性。

Hepc主要通過與細胞表面的受體膜鐵轉運蛋白（ferroportin， FPN）結合后可激活JAK2蛋白激酶，促進FPN磷酸化以及內化降解，并通過調節(jié)鐵代謝影響成骨功能[8]。JAK2/STAT3通路受多種細胞因子調節(jié)，尤其是IL-6和γ干擾素[29]，IL-6可刺激JAK/STAT信號通路促使Hepc表達，既可加重RA的炎癥反應，還可導致貧血、骨破壞。而SOCS家族成員作為JAK/STAT信號通路的代表性負調節(jié)因子，可通過調節(jié)T細胞的分化和功能參與免疫耐受[30]。相關研究證實，IL-6可通過JAK2/STAT3信號通路降低十二指腸鐵轉運蛋白1水平，刺激Hepc的產生[26]；而Hepc也可與膜轉鐵蛋白結合激活JAK2，并磷酸化轉錄因子STAT3，進而促進IL-6、TNF的表達[31]；另外，抑制JAK2/STAT3信號通路可以使Hepc的表達降低，SOCS的轉錄表達增加，下調IL-6等細胞因子的水平進而減輕RA的骨破壞[8]。Hepc與JAK2/STAT3信號通路相互作用形成惡性循環(huán)，從而使RA滑膜炎及骨破壞不斷加深加重。通過本實驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組對比，陽性對照組和通痹顆粒各劑量給藥組JAK2/STAT3信號通路相關因子mRNA和蛋白表達均顯著降低，而通路抑制因子SOCS1、SOCS3的表達明顯升高，提示通痹顆粒對JAK2/STAT3信號通路具有一定的調節(jié)作用。

綜上所述，通痹顆粒能有效改善CIA大鼠的滑膜炎及關節(jié)炎指數(shù)評分，對RA具有多靶點的治療作用，降低炎癥因子IL-6水平，其作用機制與抑制JAK2/STAT3信號通路進而減少Hepc的表達有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，通痹顆粒對Hepc和JAK2/STAT3信號通路的調節(jié)作用與藥物濃度有關，因此，臨床探索最合理有效的治療劑量也是接下來的研究重點之一；研究還可以結合網絡藥理學，從細胞分子水平進一步探討通痹顆粒對破骨細胞的具體作用靶點及相關通路，以期為治療RA提供新的方法與藥物。

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