土牛膝總皂苷的提取、成分鑒定及抗炎活性研究

曾瓊麗 王玉鳳 張恒 肖煒婷 楊蒂 韓越 王雄龍 李順祥 歐陽文

〔摘要〕 目的 對土牛膝總皂苷進(jìn)行體內(nèi)外抗炎活性與分離鑒定研究，為其治療炎癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠-AQ柱色譜法（ODS-AQ）純化制備土牛膝總皂苷；建立氨水誘導(dǎo)的急性咽炎大鼠模型，灌胃給藥評(píng)價(jià)粗毛牛膝提取物及總皂苷抗炎活性；采用柱層析、核磁共振譜、質(zhì)譜等技術(shù)對土牛膝總皂苷中的主要化合物進(jìn)行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定；建立脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型，評(píng)價(jià)各皂苷單體化合物的抗炎活性。結(jié)果 制備的粗毛牛膝總皂苷含量達(dá)到81.8%；在急性咽炎大鼠模型中，粗毛牛膝總皂苷及水煎液具有良好抗炎療效，能顯著降低血清IL-6、IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子水平；總皂苷中鑒定出6個(gè)齊墩果烷型三萜皂苷，分別為竹節(jié)參皂苷Ⅳa（1）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa丁酯（2）、金盞花皂苷E（3）、金盞花皂苷E丁酯（4）、竹節(jié)參皂苷I（5）、竹節(jié)參皂苷Ⅴ（6）；體外炎癥模型表明，分離得到的三萜皂苷類單體化合物均有不同程度的抗炎作用。結(jié)論 首次系統(tǒng)證明了皂苷類成分是粗毛牛膝發(fā)揮抗炎活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；從牛膝屬植物中首次分離得到化合物2和4，并證實(shí)其具有抗炎作用。

〔關(guān)鍵詞〕 粗毛牛膝；抗炎；咽炎；三萜皂苷；化學(xué)成分；分離鑒定

〔中圖分類號(hào)〕R284.2；R285.5? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.011

Extraction， composition identification， and anti-inflammatory activity of total saponins from Achyranthes aspera L.

ZENG Qiongli1，2， WANG Yufeng1，2， ZHANG Heng1，2， XIAO Weiting1，2， YANG Di4， HAN Yue1，2，

WANG Xionglong4， LI Shunxiang1*， OUYANG Wen1，3，5*

1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Modern Research of TCM， Education Department of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The Second Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Liuyang， Hunan 410300， China; 4. Hunan Time Sun Pharmaceutical Co. Ltd.， Yongzhou， Hunan 410116， China; 5. Liuyang Hospital of Chinese Medicine， Liuyang， Hunan 410300， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the in vivo and in vitro anti-inflammatory activity， as well as isolation and identification of total saponins from Achyranthes aspera L.， providing experimental evidence for its treatment of inflammation. Methods The total saponins of Achyranthes aspera L. were purified and prepared by ODS-AQ; after modeling of ammonia-induced acute pharyngitis， rats were treated with corresponding drugs by gavage to evaluate the anti-inflammatory activities of the extract and total saponins of Achyranthes aspera L.; column chromatography， nuclear magnetic resonance spectroscopy （NMR）， mass spectrometry （MS）， and other techniques were used to isolate， purify， and identify the main compounds in the total saponins of Achyranthes aspera L.; a lipopolysaccharide-induced macrophage inflammation model was established to evaluate the anti-inflammatory activity of various saponin monomers. Results The prepared total saponins of Achyranthes aspera L. reached a content of 81.8%; in the acute pharyngitis rat model， the total saponins and aqueous extract of Achyranthes aspera L. showed good anti-inflammatory effects， significantly reducing the serum levels of IL-6， IL-1β， and TNF-α; six oleanane-type triterpenoid saponins were identified as chikusetsusaponin Ⅳa （1）， chikusetsusaponin Ⅳa butyl ester （2）， calendulaside E （3）， calendulaside E butyl ester （4）， chikusetsusaponin I （5）， and chikusetsusaponin Ⅴ （6）. In vitro inflammation model indicated that the isolated triterpenoid saponin monomers all exhibited varying degrees of anti-inflammatory effects. Conclusion This paper systematically demonstrates for the first time that saponin components are the pharmacological material basis for the anti-inflammatory activity of Achyranthes aspera L.. Compounds 2 and 4 with anti-inflammatory effects are ester first isolated from Achyranthes plants

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Achyranthes aspera L.; antiinflammation; pharyngitis; triterpenoid saponin; chemical composition; isolation and identification

土牛膝是臨床上常見的特色民族藥材之一，其植物基源主要包括莧科植物粗毛牛膝（Achyranthes aspera Line）、柳葉牛膝（Achyranthes longifolia Makino）及野生牛膝（Achyranthes bidentata Blume）的干燥根及根莖[1-2]，具有活血祛瘀、瀉火解毒、利尿通淋的功效，常用于治療跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、痢疾、白喉、咽喉腫痛等[3-4]。

現(xiàn)代藥理研究表明，土牛膝具有顯著的抗炎活性，其水提液對巴豆油致炎劑引起的小鼠腫脹、雞蛋清誘導(dǎo)大鼠足跖腫脹、小鼠耳郭腫脹等多種急性炎癥模型均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎和鎮(zhèn)痛活性，以及單味鮮土牛膝根汁液對流行性腮腺炎、巴豆油引起的家兔咽炎具有明顯減輕炎癥表現(xiàn)的作用[5-6]。關(guān)于土牛膝主要的化學(xué)成分報(bào)道較多，主要為糖類、甾酮類和三萜皂苷類等物質(zhì)，而其活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究相對較少，且未見系統(tǒng)研究數(shù)據(jù)[7-8]。課題組前期初步研究證實(shí)，β-蛻皮甾酮是土牛膝抗炎的主要活性成分之一，而關(guān)于其他含量高的皂苷類物質(zhì)有待進(jìn)一步深入研究[9]。鑒于以上背景，為進(jìn)一步明確土牛膝所含主要皂苷類成分的抗炎作用，本課題組對粗毛牛膝總皂苷進(jìn)行制備，在體內(nèi)、外模型上研究粗毛牛膝總皂苷及其主要化合物的抗炎作用及化學(xué)結(jié)構(gòu)，明確皂苷類物質(zhì)的抗炎活性，為土牛膝藥材進(jìn)一步研究及開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，研究內(nèi)容及結(jié)果如下。

1 材料

1.1? 細(xì)胞與動(dòng)物

細(xì)胞株：小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫。SPF級(jí)SD大鼠：體質(zhì)量180～220 g、雌雄各半（共70只），購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK湘2019-0004。實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：LL2021111704）。

1.2? 藥物與主要試劑

粗毛牛膝采自湖南永州馬鞍嶺瑤家寨湖南時(shí)代陽光藥業(yè)股份有限公司種植基地，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室王智老師鑒定為正品，標(biāo)本保存在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心。純水儀（上海和泰儀器有限公司）；香草醛、地塞米松、氨水（批號(hào)：C15518844、C12912459、C15383490，上海麥克林生化科技有限公司）；高氯酸（批號(hào)：20220626，湖南匯虹試劑有限公司）；竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷Ⅴ對照品（批號(hào)：PS010730、PS010731，成都普思生物公司）；IL-6、IL-1β、TNF-α檢測試劑盒（貨號(hào)：G0132W，北京四正柏公司）；RAW264.7細(xì)胞專用培養(yǎng)基（貨號(hào)：CM-0190，武漢普諾賽公司）；脂多糖、CCK-8試劑（批號(hào)：1031Q003、20150715，北京索萊寶公司）；一氧化氮比色法試劑盒（貨號(hào)：E-BC-K035-M，武漢伊萊瑞特生物公司）；色譜級(jí)乙腈、甲醇、反相硅膠板（批號(hào)：22095277、23035102、HX87091648，德國默克公司）；ODS-A（octadecysilyl-A）、ODS-AQ（50 μm）（型號(hào)：AAG12S50、OCG20S21，日本YMC公司）；柱層析硅膠（80-100目和200-300目）、薄層色譜板（批號(hào)：14081318、020200518，青島海洋公司）；常規(guī)提取分離用試劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯等均為分析純試劑（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3? 主要儀器

AL104型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；5425型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；T2602FC型紫外儀（上海佑科儀器儀表有限公司）；Pack Pro型C18色譜柱（日本YMC公司）；LC-20A型高效液相色譜儀；LC-20AT型半制備液相色譜儀（日本島津公司）；iMark型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；CJ-2D型超凈工作臺(tái)（天津泰斯特儀器公司）；CLM-170B-8CN型二氧化氮培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；G2-XSQTof型超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；INOVA-600MHz型高分辨超導(dǎo)核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 粗毛牛膝總皂苷的制備及含量測定

取粗毛牛膝（A. aspera L.）1.17 kg，陰干過20目篩，12 L甲醇回流提取3次，每次2 h，提取液濃縮并干燥得浸膏130 g。浸膏與117.5 g ODS-AQ全親水性反相硅膠攪拌，60 ℃水浴揮干溶劑。經(jīng)ODS柱層析（4 cm×10 cm），利用甲醇-水（0∶1、1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1、1∶0）和丙酮分別洗脫2 L，收集50%～70%甲醇洗脫液干燥即得粗毛牛膝總皂苷。

參考文獻(xiàn)[10]的方法，分別稱取適量竹節(jié)參皂苷Ⅳa和粗毛牛膝總皂苷，加入甲醇，制成0.204 mg/mL竹節(jié)參皂苷Ⅳa對照品溶液和0.4 mg/mL粗毛牛膝總皂苷供試品溶液。取100、300、500、700、900、1 100 μL竹節(jié)參皂苷Ⅳa對照品溶液和300 μL粗毛牛膝總皂苷供試品溶液置于試管中，于60 ℃水浴揮干后精密加入5%香草醛-冰乙酸0.2 mL和高氯酸0.8 mL，密塞，搖勻，置60 ℃恒溫水浴中加熱15 min，取出放入冰水浴中冷卻10 min，加冰乙酸5 mL，搖勻，在紫外-可見分光光度計(jì)547 nm處測量吸光度A值。

2.2? 粗毛牛膝總皂苷體內(nèi)抗炎活性研究

2.2.1? 溶液的配制? 地塞米松溶液：精密稱取100 mg地塞米松溶于100 μL二甲基亞砜溶液中，待地塞米松完全溶解后加入100 mL生理鹽水，配制成濃度為1 mg/mL的溶液，分裝后置于4 ℃冰箱備用。

粗毛牛膝總皂苷溶液：精密稱取2.1項(xiàng)下粗毛牛膝總皂苷3 g，加入100 mL純水，混合均勻，配制成0.03 g/mL的粗毛牛膝皂苷藥液，分裝后置于4 ℃冰箱備用。

粗毛牛膝水煎液：稱取粗毛牛膝根及根莖粉末150 g，分別加入三倍量的水100 ℃煎煮4次，每次煎煮1 h。過濾、合并濾液，濃縮至300 mL左右，配制為每毫升含0.5 g原藥材的藥液，分裝后置于4 ℃冰箱備用。

2.2.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建造? 參照《中醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》以及參考文獻(xiàn)[11]中的急性咽炎大鼠模型的建立方法，采用15%氨水點(diǎn)涂法進(jìn)行造模。先用10%水合氯醛麻醉大鼠（按體重0.3 mL/100 g腹腔注射），待大鼠疼痛反射消失后，向下牽引大鼠下頜骨，暴露出咽部組織。除正常組外，其余組的大鼠用浸泡于15%氨水中的棉簽定點(diǎn)涂抹大鼠咽部約10 s，正常組大鼠用同樣的方法涂抹生理鹽水約10 s，連續(xù)涂抹3 d，大鼠出現(xiàn)撓抓口部以及咽部出現(xiàn)充血、腫脹即為造模成功。

2.2.3? 分組給藥? 70只SPF級(jí)SD大鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為7組，分別為空白組、模型組、地塞米松組、粗毛牛膝水煎液高劑量組、粗毛牛膝水煎液低劑量組、粗毛牛膝總皂苷高劑量組、粗毛牛膝總皂苷低劑量組，每組10只。

每只大鼠灌胃給予相應(yīng)的藥物治療5 d，空白組和模型組每只大鼠予灌胃等體積量生理鹽水，根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]，地塞米松組給藥劑量為5 mg/kg；根據(jù)《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》土牛膝日服劑量，實(shí)驗(yàn)劑量按照體表面積折算的等效劑量比值來計(jì)算，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人體的6.3倍，粗毛牛膝水煎液低劑量組大鼠給藥劑量為2.5 g/kg，高劑量組大鼠給藥劑量為5 g/kg。根據(jù)自制的粗毛牛膝總皂苷獲得率折算，粗毛牛膝總皂苷低劑量給藥劑量為75 mg/kg，高劑量組給藥劑量為150 mg/kg。

2.2.4? HE染色觀察咽部組織病理學(xué)改變? 采用HE染色觀察大鼠咽部組織病理學(xué)變化。

2.2.5? ELISA檢測血清中炎癥因子水平變化? 采用ELISA檢測各組大鼠血清樣本中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，具體操作按照ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“ｘ±s”表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3? 粗毛牛膝總皂苷主要化合物的分離及鑒定

2.3.1? 粗毛牛膝總皂苷主要化合物的分離? 將2.1項(xiàng)下自制的粗毛牛膝總皂苷（3.6 g）經(jīng)硅膠柱（2 cm×30 cm）分離，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（88%）-水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得到5個(gè)流分Fr.A～E。

Fr.B（0.75 g）進(jìn)一步經(jīng)硅膠柱（2 cm×20 cm）分離，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（≥88%）-水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得到7個(gè)流分Fr.B1～Fr.B7。Fr.B2經(jīng)硅膠柱（2 cm×10 cm）反復(fù)分離，以二氯甲烷∶乙酸乙酯（5∶2）溶劑洗脫得到化合物4（8.2 mg）。Fr.B4經(jīng)硅膠柱（2 cm×10 cm）反復(fù)分離，以二氯甲烷∶乙酸乙酯（1∶2）溶劑洗脫得到化合物2（7.9 mg）。Fr.B7經(jīng)硅膠柱（2 cm×10 cm）反復(fù)分離，分別以乙酸乙酯∶甲酸（300∶1）溶劑洗脫得到化合物3（14.3 mg），以乙酸乙酯∶甲酸（200∶1）溶劑洗脫得到化合物5（9.5 mg）。Fr.C（1.28 g）進(jìn)一步經(jīng)硅膠柱（2 cm×20 cm）分離，以乙酸乙酯∶甲酸∶水（500∶20∶0.5）溶劑洗脫得到化合物1（42.6 mg），以乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸（500∶50∶40）溶劑洗脫得到化合物6（10.4 mg）。

2.3.2? 粗毛牛膝總皂苷主要化合物的結(jié)構(gòu)鑒定? 通過分析理化性質(zhì)，采用現(xiàn)代波譜技術(shù)（1H NMR、13C NMR）及MS方法解析，并結(jié)合對照品分析比較鑒定化合物結(jié)構(gòu)。

2.4? 粗毛牛膝總皂苷及其主要化合物體外抗炎活性研究

2.4.1? 細(xì)胞培養(yǎng)? 參照文獻(xiàn)[13]，將RAW264.7細(xì)胞（貨號(hào)：CL-0190，武漢普諾賽公司）培養(yǎng)于新鮮RAW264.7細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，隔日傳代。

2.4.2? 細(xì)胞存活率檢測? 參照文獻(xiàn)[10]，隨機(jī)分為空白組、正常組和給藥組，分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔，空白組不接種細(xì)胞，正常組和給藥組以每孔1×105密度接種細(xì)胞24 h，換用含LPS（1 μg/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基90 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的粗毛牛膝總皂苷和單體化合物各10 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出原培養(yǎng)基，將CCK-8溶液與完全培養(yǎng)基以1∶9的比例配制混勻后，以每孔100 μL加入到培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm處測OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率=×100%

2.4.3? 細(xì)胞上清液中NO釋放量檢測? 根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果，在對細(xì)胞無毒性作用的安全濃度范圍內(nèi)設(shè)置給藥濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置分組為正常組、模型組（含LPS 1 μg/mL）、地塞米松組（200 μg/mL）、粗毛牛膝總皂苷提取物（100、200、500 μg/mL）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa（25、50、100 μmol/L）、竹節(jié)參皂苷Ⅴ（25、50、100 μmol/L）、金盞花皂苷E（25、50、100 μmol/L）、金盞花皂苷E丁酯（25、50、100 μmol/L）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa丁酯（10、25、50 μmol/L）。各組加入含藥或空白培養(yǎng)基后，繼續(xù)孵育24 h，取上清液100 μL，加入100 μL griess試劑，于酶標(biāo)儀570 nm 處測定吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NO釋放量。

2.4.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“ｘ±s”表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1? UV法測定粗毛牛膝總皂苷含量

以竹節(jié)參皂苷Ⅳa的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=0.004 16X+0.002 6（R2=0.999 7），將粗毛牛膝總皂苷樣品的吸光度A值0.336代入線形回歸曲線中，通過計(jì)算得到粗毛牛膝總皂苷百分含量為81.8%。

3.2? 粗毛牛膝總皂苷體內(nèi)抗炎活性

3.2.1? 各組大鼠的咽部組織狀態(tài)? 各組大鼠的咽部組織狀況如圖1所示，與空白組相比，模型組大鼠咽部紅腫，兩側(cè)扁桃體腫大，硬腭黏膜有明顯的損傷，舌頭有明顯的潰瘍；與模型組相比，其余各組大鼠咽部紅腫明顯好轉(zhuǎn)，但舌頭潰瘍無明顯變化。

3.2.2? 各組大鼠咽部病理形態(tài)學(xué)變化? 各組大鼠咽部組織HE染色結(jié)果如圖2所示。觀察染色結(jié)果顯示，空白組咽部組織上皮分層清晰，黏膜上皮細(xì)胞完好，未見增生。模型組分層不清楚，上皮層明顯增厚，固有層炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯，腺體肥大，形態(tài)不規(guī)則。粗毛牛膝水煎液高、低劑量組、總皂苷提取物高、低劑量組相較于模型組，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，腺體形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，組織形態(tài)有明顯向正常方向轉(zhuǎn)變。從大鼠咽部組織病理學(xué)變化角度觀察，表明粗毛牛膝水煎液和總皂苷有明顯的組織修復(fù)作用，可減輕氨水刺激的咽部組織中炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)咽部組織黏膜和腺體修復(fù)。

3.2.3? 各組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平? 模型組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量較空白組顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量顯著降低（P＜0.01），粗毛牛膝水煎液各劑量組TNF-α含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而總皂苷低劑量組TNF-α無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與地塞米松組比較，粗毛牛膝水煎液低劑量組IL-1β及總皂苷低劑量組TNF-α的含量較高（P＜0.05），總皂苷低劑量組IL-1β的含量具有顯著性差異（P＜0.01），而粗毛牛膝水煎液高、低劑量和總皂苷高劑量組IL-6、TNF-α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此外，粗毛牛膝水煎液及總皂苷不同劑量組之間的炎癥因子含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖3。

3.3? 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末。ESI-MS m/z：793.4426[M-H]-。1H NMR （600 MHz， Pyridine-d5） δ 6.22（1H， d， J=8.0 HZ， Glc-H-1）， 5.42 （1H， brs， H-12）， 4.98（1H， d， J=7.4 Hz， GlcA-H-1）， 1.29（3H， s， H-27）， 1.05（3H， s， H-26）， 0.97（3H， s， H-24）， 0.93（3H， s， H-23）， 0.90（3H， s， H-29）， 0.82（3H， s， H-25）。13C NMR（150 Hz， Pyridine-d5） δ： 38.6（C-1）， 26.5（C-2）， 89.0（C-3）， 39.4（C-4）， 55.7（C-5）， 18.4（C-6）， 33.0（C-7）， 39.8（C-8）， 47.9（C-9）， 36.8（C-10）， 23.3（C-11）， 122.7（C-12）， 144.0（C-13）， 42.0（C-14）， 28.0（C-15）， 23.7（C-16）， 46.9（C-17）， 41.6（C-18）， 46.1（C-19）， 30.7（C-20）， 33.9（C-21）， 32.4（C-22）， 28.1（C-23）， 16.9（C-24）， 15.5（C-25）， 17.3（C-26）， 26.1（C-27）， 176.5（C-28）， 33.1（C-29）， 23.6（C-30）， 107.1（GlcA-C-1）， 75.2（GluA-C-2）， 77.6（GlcA-C-3）， 73.2（GlcA-C-4）， 77.8（GlcA-C-5）， 172.8（GlcA-C-6）， 95.5（Glc-C-1）， 73.8（Glc-C-2）， 78.6（Glc-C-3）， 70.9（Glc-C-4）， 79.0（Glc-C-5）， 62.0（Glc-C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]一致，故鑒定為竹節(jié)參皂苷Ⅳa。

化合物2：白色針狀結(jié)晶。1H NMR （600 MHz， Pyridine-d5） δ： 6.30（1H， d， J=8.2 Hz， Glc-H-1）， 5.40 （1H， brs， H-12）， 4.97（1H， d， J=7.5 Hz， GlcA-H-1）， 1.26， 1.24， 1.06， 0.94， 0.88， 0.86， 0.81（each 3H， s）。 13C NMR （150 Hz， Pyridine-d5） δ： 38.4（C-1）， 26.4（C-2）， 88.8（C-3）， 39.2（C-4）， 55.5（C-5）， 18.2（C-6）， 32.9（C-7）， 39.6（C-8）， 47.7（C-9）， 36.7（C-10）， 23.1（C-11）， 122.6（C-12）， 143.9（C-13）， 41.8（C-14）， 28.0（C-15）， 23.5（C-16）， 46.7（C-17）， 41.5（C-18）， 45.9（C-19）， 30.6（C-20）， 33.7（C-21）， 32.3（C-22）， 27.9（C-23）， 16.6（C-24）， 15.3（C-25）， 17.2（C-26）， 25.8（C-27）， 176.2（C-28）， 32.9（C-29）， 23.4（C-30）， 107.1（GlcA-C-1）， 75.1（GlcA-C-2）， 77.7（GlcA-C-3）， 72.8（GlcA-C-4）， 77.7（GlcA-C-5）， 170.1（GlcA-C-6）， 95.5（Glc-C-1）， 73.9（Glc-C-2）， 78.6（Glc-C-3）， 70.8（Glc-C-4）， 79.1（Glc-C-5）， 61.9（Glc-C-6）， 64.7（-COOCH2）， 30.5（-CH2）， 19.0（-CH2）， 13.5（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]一致，故鑒定為竹節(jié)參皂苷Ⅳa丁酯。

化合物3：白色粉末。1H NMR （600 MHz， Pyridine-d5） δ 5.01（1H， d， J=7.7 Hz， GlcA-H-1）， 1.30， 1.30， 0.99， 0.97， 0.96， 0.94， 0.79（each 3H， s）。13C NMR（150 MHz， Pyridine-d5） δ： 38.3（C-1）， 26.3（C-2）， 88.8 （C-3）， 39.2（C-4）， 55.5（C-5）， 18.2（C-6）， 32.9（C-7）， 39.4（C-8）， 47.7（C-9）， 36.7（C-10）， 23.4（C-11）， 122.3（C-12）， 144.5（C-13）， 41.9（C-14）， 28.0（C-15）， 23.5（C-16）， 46.4（C-17）， 41.7（C-18）， 46.2（C-19）， 30.7（C-20）， 33.9（C-21）， 32.9（C-22）， 27.9（C-23）， 16.7（C-24）， 15.2（C-25）， 17.1（C-26）， 25.9（C-27）， 180.0（C-28）， 33.0（C-29）， 23.5（C-30）， 106.9（GlcA-C-1）， 75.2（GlcA-C-2）， 77.4（GlcA-C-3）， 73.2（GlcA-C-4）， 77.9（GlcA-C-5）， 173.0（GlcA-C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]一致，故鑒定為金盞花皂苷E。

化合物4：1H NMR （600 MHz， Pyridine-d5） δ 5.46 （1H， brs， H-12）， 4.98（1H， d， J=7.7 Hz， GlcA-H-1）; 1.30， 1.29， 0.99， 0.97， 0.95， 0.94， 0.80（each 3H， s）; 0.76（3H， t， J=7.2 Hz， butyl-CH3） 13C NMR （150 MHz， Pyridine-d5） δ： 38.4（C-1）， 26.4（C-2）， 88.8（C-3）， 39.2（C-4）， 55.5（C-5）， 18.2（C-6）， 32.9（C-7）， 39.4（C-8）， 47.7（C-9）， 36.7（C-10）， 23.4（C-11）， 122.2（C-12）， 144.6（C-13）， 41.9（C-14）， 28.0（C-15）， 23.5（C-16）， 46.4（C-17）， 41.7（C-18）， 46.2（C-19）， 30.7（C-20）， 33.9（C-21）， 32.9（C-22）， 27.9（C-23）， 16.6（C-24）， 15.2（C-25）， 17.1（C-26）， 25.9（C-27）， 180.0（C-28）， 33.0（C-29）， 23.5（C-30）， 107.1（GlcA-C-1）， 75.1（GlcA-C-2）， 77.0（GlcA-C-3）， 72.8（GlcA-C-4）， 77.7（GlcA-C-5）， 170.1 （GlcA-C-6）， 64.7（-COOCH2）， 30.6（-CH2）， 19.0（-CH2）， 13.5（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]一致，故鑒定為金盞花皂苷E丁酯。

化合物5：白色粉末。1H NMR （500 MHz， CD3OD），

δ： 5.40 （1H， d， J=8.2 Hz， H-1′）， 5.27 （1H， t， J=3.6 Hz， H-12）， 1.18（3H， s， H-27）， 0.99（3H， s， H-23）， 0.97（3H， s， H-30）， 0.95（3H， s， H-24）， 0.93（3H， s， H-29）， 0.83（3H， s， H-26）， 0.79（3H， s， H-25）。13C NMR （125 Hz， CD3OD）， δ： 38.4（C-1）， 27.5（C-2）， 76.9（C-3）， 38.5（C-4）， 55.4（C-5）， 18.1（C-6）， 32.1（C-7）， 39.3（C-8）， 47.9（C-9）， 36.7（C-10）， 22.6（C-11）， 122.4（C-12）， 143.5（C-13）， 41.5（C-14）， 26.5（C-15）， 23.1（C-16）， 46.6（C-17）， 41.2（C-18）， 45.8（C-19）， 30.1（C-20）， 33.5（C-21）， 31.7（C-22）， 27.3（C-23）， 14.9（C-24）， 14.6（C-25）， 16.3（C-26）， 24.9（C-27）， 176.7（C-28）， 32.5（C-29）， 22.5（C-30）， 94.3（Glc-C-1）， 72.6（Glc-C-2）， 77.3（Glc-C-3）， 69.8（Glc-C-4）， 78.3（Glc-C-5）， 61.0（Glc-C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]一致，故鑒定為竹節(jié)參皂苷Ⅰ。

化合物6：白色粉末。ESI-MS m/z：955.36[M-H]-。經(jīng)薄層色譜與標(biāo)準(zhǔn)品對比Rf值鑒定為竹節(jié)參皂苷Ⅴ。

3.4? 粗毛牛膝總皂苷及主要化合物體外抗炎活性

3.4.1? 粗毛牛膝總皂苷及主要化合物對RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞活力的影響? 粗毛牛膝總皂苷在100～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性（P＞0.05），750～2 000 μg/mL濃度時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.01）。竹節(jié)參皂苷Ⅳa（1）、金盞花皂苷E丁酯（4）、竹節(jié)參皂苷Ⅴ（6）在10～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)無明顯細(xì)胞毒性（P＞0.05）；竹節(jié)參皂苷Ⅳa丁酯在10～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)無明顯細(xì)胞毒性（P＞0.05）；金盞花皂苷E在10～150 μmol/L濃度范圍內(nèi)無明顯細(xì)胞毒性，50～100 μmol/L濃度時(shí)細(xì)胞存活率呈上升趨勢（P＜0.05）。因此，根據(jù)其結(jié)果選擇安全范圍內(nèi)的給藥濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。詳見圖4。

3.4.2? NO釋放量測定? 與正常組相比，模型組細(xì)胞上清液中NO含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松（200 μg/mL）組、粗毛牛膝總皂苷提取物（100、250、500 μg/mL）組、金盞花皂苷E、金盞花皂苷E丁酯（25、50、100 μmol/L）組NO含量均顯著降低（P＜0.01）。與地塞米松組相比，竹節(jié)參苷Ⅳa丁酯10 μmol/L劑量組中NO含量更高（P＜0.01），竹節(jié)參苷Ⅴ50 μmol/L劑量組中NO含量相對較高（P＜0.05），均無明顯的NO抑制作用。在50 μmol/L濃度下，各化合物抑制上清液中NO釋放的順序?yàn)榻鸨K花皂苷E丁酯>金盞花皂苷E>竹節(jié)參苷Ⅳa丁酯>竹節(jié)參苷Ⅳa>竹節(jié)參苷Ⅴ。詳見圖5。

4 討論

土牛膝作為我國西南地帶一味常見的中藥，沿用歷史悠久，民間多用于治療白喉等炎癥疾病。因其根莖、葉、花、種子均可藥用，藥用價(jià)值較高，在瑤族、傣族、白族、苗族等多個(gè)少數(shù)民族也有藥用記載?，幩帯拔寤⒕排Ｊ算@七十二風(fēng)”中的牛膝風(fēng)即土牛膝，用于腎炎水腫、下肢關(guān)節(jié)腫痛、石淋等癥的治療。傣醫(yī)稱其為“懷哦囡”，常熟用以調(diào)補(bǔ)水血，強(qiáng)健筋骨。在白族中被稱之為“尺光子”，為治骨傷的奇效三味白族藥之一。而在苗族中名為“酒嗓咯咯額?！?，常被臨床配伍治療鶴膝風(fēng)、跌打損傷、痢疾、紅崩等，使用較為普遍。此外，現(xiàn)代應(yīng)用中，以土牛膝為主藥研制出的喉咽清口服液、喉咽清顆粒、復(fù)方土牛膝糖漿、復(fù)方無花果含片等現(xiàn)代中藥制劑廣泛應(yīng)用于臨床治療急慢性咽炎、口腔潰瘍、扁桃體炎等疾病，療效突出且安全性高[16-19]。土牛膝資源豐富、分布廣泛、功效多樣，且具有良好的應(yīng)用基礎(chǔ)，結(jié)合傳統(tǒng)應(yīng)用對其進(jìn)行深入研究與開發(fā)利用具有重要意義。通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，近年對牛膝屬植物藥效成分的報(bào)道主要集中于三萜皂苷類物質(zhì)。牛膝總皂苷通過抑制IL-1β和TNF-α等促炎因子，從而抑制軟骨基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞凋亡及增殖等來治療膝骨關(guān)節(jié)炎[20]。牛膝莖葉總皂苷經(jīng)抑制腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、GLUT9對尿酸的重吸收，促進(jìn)OAT1蛋白分泌尿酸入尿等呈現(xiàn)出良好的降尿酸作用，對大鼠高尿酸血癥的治療效果顯著[21]。川牛膝皂苷類化合物通過降低血液、血漿黏度和IL-6、NO、TNF-α、COX-2等炎癥因子水平，對大鼠急性血瘀具有明顯的改善作用[22]。

本文擬對粗毛牛膝總皂苷進(jìn)行系統(tǒng)成分研究及抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)其對急性咽炎大鼠模型有顯著治療作用，作用機(jī)制與降低大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的釋放有關(guān)，竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷Ⅳa丁酯、金盞花皂苷E、金盞花皂苷E丁酯、竹節(jié)參皂苷Ⅴ為其主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)。其中，竹節(jié)參皂苷Ⅳa和竹節(jié)參皂苷Ⅴ為土牛膝藥材中含量較高、研究較多的皂苷類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[23-26]。竹節(jié)參皂苷Ⅳa通過抑制微小RNA-155、增加糖原合成酶激酶（GSK）-3β表達(dá)和抑制NF-κB信號(hào)通路來改善LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[25]。竹節(jié)參皂苷Ⅴ可通過NF-κB和MAPK信號(hào)通路抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)[27]。另有研究表明，金盞花皂苷E可通過抑制JAK-stat3信號(hào)通路的激活來抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[28]，上調(diào)大鼠Kruppel樣因子2的表達(dá)抑制糖酵解介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化來減輕動(dòng)脈粥樣硬化[29]。竹節(jié)參皂苷Ⅳa丁酯通過抑制輔助性T細(xì)胞17分化來改善小鼠關(guān)節(jié)炎，是一種天然的IL-6受體拮抗劑[30]。關(guān)于金盞花皂苷E丁酯的抗炎活性研究較少，其確切機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。本研究通過挖掘土牛膝的抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)，探索其作用機(jī)制，為土牛膝及相關(guān)復(fù)方的進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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