馬岡鵝和泰州鵝糞便微生物區(qū)系分析及潛在功能預測

吳云飛　涂遠璐　馬曦　閆俊書　奚雨萌

摘要：為分析馬岡鵝和泰州鵝種鵝糞便微生物組成差異，探究糞便微生物區(qū)系對宿主生理功能調(diào)節(jié)的潛在影響。試驗選取體重相似、日齡相仿、飼養(yǎng)環(huán)境相同的健康種鵝17羽（泰州鵝8羽+馬岡鵝9羽），利用16S rDNA高通量測序技術(shù)分析種鵝糞便菌群多樣性、種屬差異及其對宿主生理功能的潛在影響。結(jié)果表明，在多樣性分析上，2個品種糞便微生物菌群Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)品種間無顯著差異，主坐標分析聚類不明顯。分析糞便菌群結(jié)構(gòu)組成發(fā)現(xiàn)，在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是種鵝糞便中的優(yōu)勢菌群；在屬水平上，羅氏菌屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬_9、乳酸桿菌屬等是優(yōu)勢菌群種屬。同時，泰州鵝糞便中厚壁菌門細菌CAG：822、苯基桿菌屬和漫游菌屬細菌平均豐度顯著高于馬岡鵝；但固氮螺菌屬Blvii28_wastewater-sludge_group、Ezakiella、默多克菌屬、假谷氨酸菌屬和斯內(nèi)菌屬平均豐度顯著低于馬岡鵝（P<0.05）。KEGG功能預測提示，馬岡鵝與泰州鵝糞便差異菌群可能影響宿主碳水化合物代謝、糖基化合物合成、能量代謝等生理過程。綜上，在相同飼養(yǎng)條件下，馬岡鵝和泰州鵝種鵝糞便微生物區(qū)系總體上受其遺傳背景影響較小，但也在菌群組成上表現(xiàn)出一定差異，可能影響宿主環(huán)境適應、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等生理功能的調(diào)節(jié)。

關鍵詞：鵝；品種；糞便微生物；16S rDNA；菌群結(jié)構(gòu)；功能預測

中圖分類號：S852.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0226-06

鵝是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟水禽，近年來養(yǎng)殖規(guī)模持續(xù)擴大。據(jù)國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系統(tǒng)計，2021年底我國肉鵝年出欄量為5.7億羽，占世界總出欄量的94%，發(fā)展?jié)摿薮?。然而，與雞、鴨相比，鵝相關研究起步較晚，有關鵝消化生理、飼料營養(yǎng)、遺傳選育等方面的研究不夠系統(tǒng)，行業(yè)總體飼養(yǎng)管理水平落后于其他畜禽，有待提高。

腸道菌群是指腸道內(nèi)豐富的微生物群落結(jié)構(gòu)，包含細菌、真菌、原生動物、古菌等，可直接或間接參與宿主胃腸道乃至整個機體健康的調(diào)節(jié)，與代謝、消化、免疫等生理過程密切相關［1-2］。健康的腸道微生態(tài)環(huán)境是提高家禽生產(chǎn)性能的關鍵［3-4］；腸道菌群失衡，不僅會影響腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還會損傷腸黏膜屏障功能，導致疾病發(fā)生［5］。在鵝上，腸道菌群受到多種因素的調(diào)節(jié)，飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)水平、添加劑使用等均可顯著影響腸道菌群組成，進而影響宿主生理機能［6-9］。值得注意的是，不同鵝種間的腸道菌群存在顯著差異，這可能是導致品種間消化代謝和生理調(diào)節(jié)差異的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，四川白鵝、揚州鵝、浙東白鵝和霍爾多巴吉鵝在28日齡時，盲腸菌群多樣性、種屬組成等存在顯著差異［10］。其中，霍爾多巴吉鵝的腸道菌群多樣性最優(yōu)，其次為浙東白鵝、揚州鵝、四川白鵝；進一步發(fā)現(xiàn)，纖維降解菌群的豐度差異也導致了不同鵝種間纖維消化能力的差別［10］。因此，研究品種對鵝腸道菌群的影響有助于深入了解鵝的消化生理機能。

泰州鵝和馬岡鵝均為我國代表性地方特色品種。其中，馬岡鵝原產(chǎn)于廣東省開平市馬岡鎮(zhèn)，體型適中，羽毛灰黑色；母鵝單羽重2.5～3.0 kg，公鵝單羽重3.5～4.0 kg，粗食、早熟、易長，產(chǎn)蛋較多，是華南地區(qū)主要養(yǎng)殖的肉鵝品種［11］。泰州鵝主要在華東地區(qū)飼養(yǎng)，近年來由萊茵鵝和太湖鵝雜交育成，體型中等，羽毛白色，肉質(zhì)細膩，具有較高的經(jīng)濟價值，深受消費者喜愛［12］。此外，當前不同品種間鵝腸道菌群的研究多集中在雛鵝和肉鵝上，對種鵝關注較少。為此，本研究擬利用16S rDNA測序技術(shù)，研究馬岡鵝和泰州鵝種鵝腸道菌群區(qū)系組成與潛在功能預測，以期為完善腸道菌群與與宿主生理功能調(diào)節(jié)間的互作理論提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品收集

試驗于2023年6月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院六合實驗禽場展開。選取體重相似、日齡相仿、飼養(yǎng)環(huán)境相同的健康泰州鵝和馬岡鵝種鵝各20羽，執(zhí)行常規(guī)飼養(yǎng)管理、消毒防疫流程，不同品種種鵝飼養(yǎng)條件一致。試驗飼喂商品種鵝飼料，日糧組成及營養(yǎng)水平滿足肉鵝飼料營養(yǎng)標準。在180日齡時，隨機選取泰州鵝8羽，馬岡鵝9羽，收集新鮮糞便，用液氮速凍后，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 糞便DNA的提取、擴增與測序

參照PowerSoilDNA Isolation kit試劑盒說明提取樣品微生物DNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計（賽默飛世爾科技公司）檢測DNA濃度。選擇通用引物（343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG

-3′；798R：5′-AGGGTATCTAATCCT

-3′）擴增16S V3-V4高變區(qū)。PCR反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、模板DNA 10 ng、引物F（5 μmol/L）0.8 μL、引物R（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu Polymerase（5 U/μL）0.4 μL，補純水至20 μL。擴增程序：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用Illumina PE250測序平臺進行16S rDNA測序，委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司開展。

1.3 生物信息學處理

下機后，使用Trimmomatic軟件對原始雙端序列去雜，利用Flash軟件進行拼接，并通過UCHIME檢測并去除嵌合體序列，得到優(yōu)質(zhì)序列。首先，以序列相似度大于或等于97%為依據(jù)，利用Vsearch軟件將序列聚類生成多個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。使用QIIME軟件包挑選出OTU代表序列，并與Greengenes或Silva（version.123）數(shù)據(jù)庫比對注釋，物種比對注釋使用RDP classifier軟件。隨后，通過韋恩圖計算組間共享和唯一的OTU數(shù)量，并將OTU按照相對豐度大小進行排序，以OTU由大到小的排序編號為橫坐標，OTU相對豐度為縱坐標，繪制等級聚類曲線，評估物種豐度與分布均勻度。接著，通過計算Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)分析樣本α多樣性，Chao1指數(shù)表示菌群豐度，Shannon和Simpson指數(shù)表示菌群多樣性。利用β多樣性距離矩陣，使用非加權(quán)組平均算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，通過主坐標分析可視化展示樣本間差異。在門和屬水平上，利用SPSS 22.0軟件中的T-test分析比較細菌種屬平均豐度差異。利用LEfSe（LDA Effect Size）分析生物標記物，采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）來估算標記物對差異效果影響的大小。最后，利用PICRUSt2軟件進行京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）微生物群落功能預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序分析結(jié)果

經(jīng)測序，質(zhì)控后的高質(zhì)量測序標簽數(shù)據(jù)量分布在44 577～76 767之間，經(jīng)嵌合體去除得到最終用于分析的數(shù)據(jù)標簽，其數(shù)據(jù)量分布在32 083～66 191 之間，序列長度分布在403.42～419.48 bp之間。各樣本OTU個數(shù)分布在732～1 707個之間。如圖1-A所示，泰州鵝糞便樣品測得OTU為3 542個，馬岡鵝為4 020個，共有OTU數(shù)量為 2 968 個。如圖1-B所示，樣品稀釋曲線和等級聚類曲線均隨數(shù)據(jù)量增大而逐漸趨于平坦，這表明測序數(shù)據(jù)量合理，各試驗組樣本中物種豐富，具有代表性。

2.2 α多樣性分析結(jié)果

如圖2所示，泰州鵝和馬岡鵝糞便菌群中觀測到物種數(shù)量、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著差異（P>0.05），提示相同飼養(yǎng)條件下2個品種種鵝糞便菌群多樣性近似。

2.3 主坐標分析結(jié)果

對泰州鵝和馬岡鵝種鵝糞便樣品測序結(jié)果進行主坐標分析。如圖3所示，第1主坐標數(shù)據(jù)差異的貢獻度為31.43%；第2主坐標數(shù)據(jù)差異的貢獻度為23.47%，表明該分析反映了原始數(shù)據(jù)樣品間54.90%的變異性。泰州鵝和馬岡鵝在β多樣性分析中聚類不明顯，微生物區(qū)系組成相近。

2.4 菌群組成結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

菌群組成結(jié)構(gòu)分析表明，泰州鵝和馬岡鵝種鵝糞便菌群組成存在差異（圖4）。在門水平上， 厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門是種鵝糞便微生物中的優(yōu)勢菌門，其在泰州鵝糞便中平均豐度分別為44.61%、35.11%、15.06%和3.73%，在馬岡鵝樣品中平均豐度分別為36.48%、39.01%、16.23%和4.27%。在屬水平上，羅氏菌屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬_9和乳酸桿菌屬為種鵝糞便微生物優(yōu)勢菌屬，其在泰州鵝糞便中平均豐度分別為21.84%、12.49%、3.02%和2.66%，在馬岡鵝糞便中平均豐度分別為12.22%、12.85%、4.24%和2.61%。

2.5 糞便菌群差異種屬分析結(jié)果

對泰州鵝和馬岡鵝糞便樣品菌群組成進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：在門水平上，2個品種種鵝糞便菌群無顯著差異（表1）；在屬水平上，2個品種種鵝糞便菌群有9個種屬差異顯著（表2）。由表2可知，泰州鵝種鵝糞便樣品中厚壁菌門細菌CAG：822、苯基桿菌屬和漫游菌屬平均豐度顯著高于馬岡鵝（P<0.05）；而馬岡鵝種鵝糞便樣品中固氮螺菌屬、Blvii28_wastewater-sludge_group、Ezakiella、默多克菌屬、假谷氨酸菌屬和斯內(nèi)化菌屬平均豐度顯著高于泰州鵝（P<0.05）。

2.5 多級物種層級樹圖（LEfSe）分析結(jié)果

基于糞便微生物OTU矩陣，對泰州鵝和馬岡鵝種鵝糞便菌群做LEfSe分析，明確標志種屬。由圖5可知，馬岡鵝組糞便菌群在進化分支圖中存在一支相對獨立的分類，無壁菌門。在LDA評分中，馬岡鵝組糞便中的無壁菌門和柔膜細菌綱得分最高；泰州鵝組糞便中細小棒狀菌科、細小棒狀菌屬和細小棒狀菌目得分最高。

2.6 KEGG功能預測結(jié)果分析

為進一步了解差異種屬對宿主生理功能調(diào)節(jié)的潛在影響，試驗對種鵝糞便菌群做KEGG功能預測。由圖6可見，糞便差異菌群可能影響種鵝以下生理功能的調(diào)節(jié)，主要包括：環(huán)境適應、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、糖基化合物的生物合成和代謝、萜類和多酮類代謝、氨基酸代謝、其他氨基酸代謝、核苷酸代謝、代謝性疾病等過程。

3 討論與結(jié)論

試驗利用16S rRNA高通量測序技術(shù)分析了泰州鵝和馬岡鵝種鵝糞便微生物區(qū)系，并探究了菌群差異與宿主生理功能調(diào)節(jié)間的聯(lián)系。筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)，在相同飼養(yǎng)條件下，馬岡鵝和泰州鵝種鵝糞便微生物區(qū)系總體上受其遺傳背景影響較小，主要表現(xiàn)在菌群多樣性無顯著差異和菌群組成總體上相似。家禽腸道菌群組成與遺傳背景、日糧營養(yǎng)、養(yǎng)殖環(huán)境等因素有關，其中飼糧組成是對腸道菌群影響最顯著的，而遺傳背景導致菌群組成差異一般也是由飲食驅(qū)動的［10，13-14］。Wang等研究了同地域黑頸鶴、 白鶴和斑頭鵝腸道菌群變化與遺傳背景間的關系，發(fā)現(xiàn)高淀粉飲食的黑頸鶴和白鶴在代謝和合成功能上的富集程度相似，與高纖維飲食的斑頭鵝有顯著差異；3種鳥類之間菌群代謝的差異是由食物驅(qū)動的［15］。Gao等描述了包括家鵝和野鵝在內(nèi)的7種鳥類的腸道菌群進化關系，發(fā)現(xiàn)腸道菌群的差異與酵解/糖異生、淀粉和蔗糖代謝、丙酸代謝、檸檬酸循環(huán)等過程有關，認為鵝獨特的生理能力得益于宿主基因組的適應性進化及其與腸道微生物的共生作用［16］。因此，泰州鵝和馬岡鵝可能因其不同的飲食類型導致腸道菌群的差異，但將其飼養(yǎng)在相同環(huán)境中、飼喂一段時間相同日糧后，其腸道菌群區(qū)系組成應具有逐漸相似的特點。

當然，盡管泰州鵝和馬岡鵝糞便菌群組成總體上相似，但也在菌群組成上表現(xiàn)出一定差異。無璧菌門是泰州鵝和馬岡鵝的主要差異菌門，它是一類潛在的有益菌，某些無璧菌門的微生物可以抵抗病原微生物的感染，保護宿主的健康。脫鐵桿菌門等這些成員參與了復雜碳水化合物的降解。在屬水平上，細小棒狀菌在2個品種間也存在差異，其主要功能是參與機體有機物的分解和循環(huán)。此外，CAG：822是厚壁菌門中的一些成員可以幫助維持代謝和免疫健康［17］。厚壁菌門中的一些成員還可以分解腸道中無法被機體酶消化的碳水化合物，如膳食纖維和抗性淀粉，從而產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如丁酸，這有助于維持腸道健康［18-19］。

微生物菌群間的差異可能影響宿主環(huán)境適應、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等生理功能的調(diào)節(jié)［20］。腸道微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以通過調(diào)節(jié)能量代謝、改善腸道屏障功能、調(diào)節(jié)免疫反應等機制影響宿主代謝［14］。本研究中，KEGG分析發(fā)現(xiàn)，馬岡鵝和泰州鵝糞便差異菌群可能參與環(huán)境適應、碳水化合物代謝、糖基化合物的生物合成和代謝、萜類和多酮類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝等生理過程。這意味著在長期的人類對家鵝的馴化過程中，馬岡鵝和泰州鵝腸道菌群的差異仍主要源于環(huán)境適應及碳水化合物、氨基酸、脂類等營養(yǎng)物質(zhì)代謝。

本研究結(jié)果表明，在相同飼養(yǎng)條件下，馬岡鵝和泰州鵝種鵝糞便微生物區(qū)系總體上受其遺傳背景影響較小，但也在菌群組成上表現(xiàn)出一定差異，可能影響宿主環(huán)境適應、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等生理功能的調(diào)節(jié)。

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收稿日期：2023-12-15

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：31902190）。

作者簡介：吳云飛（1999—），男，河南開封人，碩士研究生，主要從事家禽腸道營養(yǎng)與微生物方面的研究。E-mail：wuyunfei990902@163.com。

通信作者：奚雨萌，博士，副研究員，主要從事家禽腸道營養(yǎng)與微生物方面的研究。E-mail：xiyumeng@jaas.ac.cn。