鐵死亡在眼底疾病中的研究進展

李娟英,張文芳

0 引言

2012年Dr. Brent R Stockwell 提出了鐵死亡(ferroptosis)這一概念,它是一種可調(diào)控的鐵依賴性脂質(zhì)過氧化、活性氧自由基大量累積(reactive oxygen species,ROS)所致的細胞死亡形式。因為其可調(diào)控性的特點,成為近年來各個領(lǐng)域的研究熱點,在腫瘤、自身免疫病、發(fā)育和衰老、神經(jīng)退行性疾病、傳染性疾病中得到了廣泛研究[1]。在眼科疾病方面,近年來有研究表明很多致盲性眼科疾病如青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性( age-related macular degeneration,ARMD) 和視網(wǎng)膜色素變性( retinitis pigmentosa,RP)[2]、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)[3]的發(fā)生發(fā)展與鐵死亡相關(guān)。本文就鐵死亡在眼底疾病中的相關(guān)研究進展進行綜述。

1 鐵死亡的分子機制

1.1鐵死亡的特點鐵死亡與細胞凋亡、壞死和自噬不管在形態(tài)學、生物化學、還是在遺傳學上均不同[4],它是以細胞代謝機制中氨基酸和脂質(zhì)代謝機制、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的調(diào)控、鐵的調(diào)節(jié)為基礎(chǔ),并在這三個領(lǐng)域的生物學交叉處[1]。鐵在細胞膜外以Fe3 +存在,在細胞膜上和轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TRF,Tf)結(jié)合進入細胞后,被二價金屬轉(zhuǎn)運體1(divalent metal transporter 1,DMT1)轉(zhuǎn)換化成Fe2 +在細胞內(nèi)參與各種細胞代謝活動[5]。除此之外,Fe2 +以三種方式貯存:進入細胞自由鐵池、與鐵蛋白結(jié)合、通過鐵的自噬被膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(recombinant ferroportin,FPN)排出細胞外。當細胞內(nèi)游離的Fe2 +數(shù)量超載時,就會和過氧化氫結(jié)合發(fā)生芬頓反應(yīng)形成羥基自由基[5],羥基自由基和脂質(zhì)反應(yīng)形成ROS,ROS大量堆積形成細胞破裂死亡,即鐵死亡。鐵死亡發(fā)生后,線粒體嵴減少、消失,膜密度增加,細胞外膜以及胞膜破裂,繼而出現(xiàn)線粒體萎縮、胞核固縮。在這一過程中,游離鐵增加、脂質(zhì)過氧化、質(zhì)膜不穩(wěn)定、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性被破壞、蛋白質(zhì)骨架重新排列,呈現(xiàn)明顯的“氣球”表型細胞[6]。 這種由鐵離子介導細胞的氧化還原失衡導致的細胞調(diào)節(jié)性死亡是由多種信號通路參與的,其中大多數(shù)信號通路主要通過影響谷胱甘肽過氧化物酶 4 (glutathione peroxidase 4,GPX4)的活性來實現(xiàn)[2]。近年來,也發(fā)現(xiàn)了不依賴GPX4的其他一些通路。

1.2鐵死亡的調(diào)控

1.2.1GPX4相關(guān)的通路依賴GPX4的鐵死亡通路也稱為經(jīng)典的鐵死亡通路。該通路中,胱氨酸通過胱氨酸-谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體(System-xc)進入細胞,在胱氨酸還原途徑中還原生成半胱氨酸,促進谷胱甘肽(glutathione,GSH)生成。 GSH 是一種強效的還原劑,作為GPX4的輔因子在細胞內(nèi)促進磷脂氫過氧化物( PLOOHs )還原為其相應(yīng)的醇( PLOHs ),執(zhí)行鐵死亡的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)與GPX4相關(guān)的通路有:谷氨酸途徑、甲羥戊酸途徑、硒代半胱氨酸途徑、甲硫氨酸途徑,以上途徑中均通過調(diào)節(jié)GPX4發(fā)揮作用。鐵死亡的誘導劑中,一類通過抑制System-xc阻止胱氨酸的攝取,另一類通過抑制GPX4。同時,通過消耗GSH、輔酶Q10(CoQ10)、微量元素Se這三種底物進而降低GSH水平,提高細胞對鐵死亡的敏感性[1]。Erastin 與柳氮磺胺吡啶、谷氨酸鹽等通過谷氨酸-胱氨酸反向轉(zhuǎn)運體/還原型谷胱甘肽,GSH/GPX4軸誘導細胞發(fā)生鐵死亡,但其具體機制仍有待研究[3]。Shimada 等[7]在對56種半胱天冬酶非依賴性致死化合物的檢查中通過優(yōu)化分子骨架的周圍結(jié)構(gòu),最終產(chǎn)生了一種選擇性誘導鐵死亡而不激活壞死的化合物發(fā)現(xiàn)了Ferroptosis-Inducer-56(FIN56),它不僅可以誘導GPX4的降解,還可以通過甲羥戊酸途徑起作用。即通過消耗CoQ10來提高細胞對鐵死亡的敏感性,是鐵死亡的特異性誘導劑。此外,伴侶介導的溶酶體相關(guān)膜蛋白通過自噬會誘導GPX4的降解,分子伴侶介導的自噬(chaperone mediated autophagy,CMA)的抑制穩(wěn)定了GPX4并減少了鐵死亡。這成為了另一種控制 GPX4 降解的機制,參與對鐵死亡的敏感性調(diào)節(jié)[8]。

1.2.2不依賴于GPX4的通路目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的不依賴GPX4鐵死亡抑制系統(tǒng)有三種,它們分別為鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)/CoQ10、二氫乳清酸脫氫酶(recombinant dihydroorotate dehydrogenase,DHODH) 和肌酐一磷酸環(huán)化水解酶1(guanosine triphosphate cyclohydrolase I,GCH1)/四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)1介導。CoQ10存在于細胞的線粒體和細胞膜之中,在鐵死亡中作為防止驅(qū)動脂質(zhì)過氧化的內(nèi)源性機制與GPX4平行作用,抑制鐵死亡[9]。這一發(fā)現(xiàn)是使用合成致死的CRISPR-Cas9篩選,將FSP1鑒定為有效的鐵死亡抑制性因子,實驗中募集到質(zhì)膜中的FSP1作為氧化還原酶起作用,降低CoQ10,從而作為親脂性自由基捕獲抗氧化劑,阻止了脂質(zhì)過氧化物的增加[9]。由此可見,FSP1-CoQ10-NADPH通路作為獨立的平行系統(tǒng),對鐵死亡的抑制是由泛醌還原形式泛醇捕獲介導脂質(zhì)過氧化的脂質(zhì)過氧自由基,而FSP1催化CoQ10的再生通過使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)還原CoQ清除脂質(zhì)過氧化中間體導致CoQ10被氧化以觸發(fā)鐵死亡[10]。在哺乳動物細胞中,細胞溶質(zhì)磷酸酶MESH1的過表達會耗盡 NADPH,增加細胞對鐵死亡的敏感性[11]。DHODH作為鐵死亡的線粒體抑制因子,亦是通過將泛醌還原為泛醇來實現(xiàn)[12]。而GCH1抑制下生物合成的BH4則除了類似于CoQ10為了防止脂質(zhì)過氧化外[13-14],還可以引起GCH1的細胞脂質(zhì)膜重塑,選擇性地阻止多不飽和脂肪酸鏈(PUFA-PL)消耗來抑制鐵死亡[15]。

1.2.3鐵代謝在鐵的自我調(diào)節(jié)中,鐵自噬主要負責鐵的釋放和回收[16],也被認為是調(diào)節(jié)細胞對鐵死亡易感性的主要靶標[6]。當鐵蛋白降解增加或表達被抑制時,細胞內(nèi)的自由鐵池增加,鐵死亡的敏感性提高[17-18]。鐵螯合劑、鐵抑制素及其衍生物通過減少細胞內(nèi)的游離鐵來對抗鐵死亡,降低鐵死亡敏感度[19-21]。而熱休克蛋白β-1(heat shock proteinβ-1,HSPβ-1)、核因子E2相關(guān)因子2 (NRF2)等則通過抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor protein1,TFR1)表達后改變鐵代謝進程,從而調(diào)節(jié)鐵死亡[22-23]。

目前已報道的通過直接或間接靶向鐵代謝和脂質(zhì)過氧化來調(diào)節(jié)鐵死亡的幾種分子包括:GPX4、HSPβ-1和NRF2、NADPH氧化酶(NOX)、p53和SLC7A11、VDAC2/3[24]。其中,GPX4、HSPβ-1和NRF2分別通過限制ROS 產(chǎn)生和減少細胞鐵攝取作為鐵死亡的負調(diào)節(jié)因子,NADPH氧化酶通過促進ROS產(chǎn)生[24]成為正調(diào)節(jié)因子。除了經(jīng)典的調(diào)控機制外,P53途徑、活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)3/4途徑、Beclin 1(BECN1)通路和一些非編碼RNA也相繼被發(fā)現(xiàn)[16]。其中,p53(特別是乙?；毕萃蛔凅wp53)介導了典型和非典型鐵死亡通路,通過翻譯后修飾、單核苷酸多態(tài)性、非編碼RNA和營養(yǎng)因子等多種方式調(diào)節(jié)鐵死亡的敏感性,是鐵死亡的正調(diào)節(jié)因子[19]。最近發(fā)現(xiàn)的雙氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)則促進ROS的產(chǎn)生,在體內(nèi)引起顯著的腫瘤抑制[25]。

2 鐵死亡在眼底疾病中的研究

鐵死亡在近年來的研究中涉及各個領(lǐng)域,包括動物學、植物學及人類疾病等。臨床主要應(yīng)運在神經(jīng)退行性疾病、器官損傷、發(fā)育和衰老、傳染性疾病、自身免疫病、腫瘤等的研究,眼科涉及的目前有角膜疾病、青光眼、ARMD、DR、RB、RP、視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment,RD)等。以下將鐵死亡在眼底疾病中的研究簡單綜述。

2.1ARMD ARMD是視網(wǎng)膜退行性病變,以中心視力下降和視物變形為主要癥狀。ARMD分為干性ARMD和濕性ARMD兩類。隨著抗血管內(nèi)皮生長因子(antivascular endothelial growth factor, VEGF)靶向藥物的應(yīng)用,濕性ARMD得到了很好的治療。但對于干性ARMD的治療尚無特效藥物。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞的功能障礙和細胞死亡是晚期干性(萎縮性)ARMD的標志[26]。以往的研究發(fā)現(xiàn),在干性ARMD中,干擾素-γ(IFN-γ)水平、LCN2(脂質(zhì)運載蛋白2)均升高,IFN-γ誘導人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)通過經(jīng)典的鐵死亡通路引發(fā)細胞死亡[27],而RPE細胞中LCN2與Autophagy-related 4B(ATG4B)結(jié)合形成LCN2-ATG4B-LC3-Ⅱ復合物,調(diào)節(jié)ATG4B活性,使鐵自噬降低,激活鐵死亡[28]。在干性ARMD患者的房水中鐵的含量是正常人群的 2 倍以上[29],ARMD的發(fā)生與年齡具有相關(guān)性,而視網(wǎng)膜鐵含量亦隨著年齡的增長而增加,同一患者,患ARMD的眼視網(wǎng)膜鐵含量升高,而未患病的對側(cè)眼鐵水平正常[30],由此我們可以猜測,隨著年齡的增大,視網(wǎng)膜的鐵含量增加,富集的鐵誘導生成的氧自由基參與ARMD中RPE細胞的衰老、死亡及隨后的光感受器死亡。在這一過程中,GSH可以防止這一氧化損傷。鐵螯合劑DFO以及自噬抑制劑Baf-A1(75 nmol/L)和3-MA(10 mmol/L)的運用可以預防GSH耗竭,降低鐵死亡、自噬和減少應(yīng)激誘導的人RPE細胞過早衰老和細胞死亡[31]。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract,GBE)通過激活Nrf2介導的抗氧化防御來保護RPE細胞免受t-BHP誘導的鐵死亡[32]。

過度光照(light excessive,LE)是除衰老外ARMD發(fā)生的另一高危因素。光照顯著降低了光感受器細胞的活力并誘導了促鐵死亡的變化,包括鐵積累、線粒體收縮、谷胱甘肽消耗、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)增加以及SLC7A11和GPX4的蛋白表達降低,而鐵抑素-1減輕了光照對鐵死亡的影響,緩解光感受器萎縮和鐵死亡,抑制了神經(jīng)炎癥和防止光照對視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的影響[20, 33]。這些發(fā)現(xiàn)為利用鐵死亡預防包括ARMD在內(nèi)的視網(wǎng)膜變性類疾病的治療提供了新的思路。

2.2RP RP是以夜盲癥、進行性視野缺損、中心視力下降和色覺異常為主要癥狀的一類遺傳性和非營養(yǎng)性視網(wǎng)膜退行性疾病[34]。其發(fā)病機制尚不明確,病理學標志為感光細胞的損傷。研究者在評估小鼠視網(wǎng)膜變性過程中鐵代謝相關(guān)基因、鐵水平和氧化損傷的表達時發(fā)現(xiàn),快速進展的視網(wǎng)膜變性的rd10小鼠中,轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍蛋白、鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達增加,總視網(wǎng)膜鐵和鐵蛋白結(jié)合鐵的水平增加,視網(wǎng)膜中脂質(zhì)過氧化標志物4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxyl-2-nonenal,4-HNE)的水平也顯著升高。這些結(jié)果表明鐵過載與視網(wǎng)膜損傷有關(guān)[35],而鐵死亡與碘酸鈉誘導的ARPE-19細胞死亡有關(guān)則證明鐵死亡與RP有關(guān)[36]。之后的RP模型研究中證實,鋅去鐵胺[37]、鐵螯合藥物[38](VK28和VAR10303)、鐵螯合劑去鐵酮[39]、去鐵胺或鐵抑素-1兩種鐵死亡抑制劑[40-41]均可以減緩感光細胞鐵死亡,保護光感受器的退化,為鐵穩(wěn)態(tài)是否可以作為治療干預的靶標提供了新的依據(jù)。

2.3DR DR是全球工作年齡人群失明的主要原因之一[42]。DR的血管病理改變有內(nèi)皮細胞死亡、毛細血管膜增厚、血管通透性增、視網(wǎng)膜組織缺血、毛細血管滲漏及釋放各種血管活性物質(zhì),導致新生血管形成[43],DR的細胞和分子機制很復雜,細胞的焦亡、壞死性凋亡和鐵死亡這三種新型調(diào)節(jié)細胞死亡均有參與[44]。 RPE細胞和視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞(retinal microvascular endothelial cells,RCEC)功能障礙導致了糖尿病視網(wǎng)膜損傷。與鐵死亡相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn),高葡萄糖(high glucose,HG)環(huán)境中,RPE細胞中硫氧還原蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)上調(diào),TXNIP上調(diào)和抗氧化蛋白(SOD1,Trx1) 將導致氧化型谷胱甘肽的產(chǎn)生和 GSH 的消耗,通過經(jīng)典的GPX4通路誘發(fā)RPE細胞鐵死亡[42],有研究表明,在HG處理的ARPE-19細胞中,環(huán)狀RNA-PSNE1(circ-PSNE1)增加[45],miR-200b-3p、miR-138-5p、miR-338-3p、microRNA-7-5p(miR-7-5p)上調(diào)。circ-PSNE1通過miR-200b-3p/CFL2軸誘導ARPE19細胞的鐵死亡,同時,miR-138-5p上調(diào),Sirt1/Nrf2活性和抗氧化表達降低,誘導RPE細胞鐵死亡[46]。miR-338-3p靶向作用SLC1A5的3’非翻譯區(qū)域(3’UTR)進行抑制和降解,通過miR-338-3p/ASCT2(SLC1A5)軸誘導鐵死亡[47]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在調(diào)節(jié)鐵死亡中,鋅指結(jié)構(gòu)翻譯轉(zhuǎn)錄本1可通過與microRNA-7-5p(miR-7-5p)競爭性結(jié)合并調(diào)節(jié)其下游分子?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)的表達來驅(qū)動鐵死亡[48]。除了 RPE細胞變化外,RCEC功能障礙也會導致糖尿病視網(wǎng)膜損傷。HG以時間或劑量依賴性方式顯著上調(diào)人視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRCECS)中TRIM46蛋白表達[49],TRIM46通過促進 IκBα泛素化,激活NF-κB信號通路,加速鐵死亡,加重HRCECS的HG誘導的高通透性和炎癥反應(yīng)[50]。

隨著鐵死亡在DR研究中的深入,鐵死亡抑制劑鐵抑素-1、去鐵胺、利普他汀-1[51]、及一些中草藥提取物如白藜蘆醇、吉馬酮、槲皮素、隱綠原酸[52]、黃芪甲苷-Ⅳ[46]等成為通過抑制鐵死亡治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究熱點,鐵死亡新靶點的不斷確定,成為了DR治療的有效藥物研發(fā)的新希望。

2.4RB RB是兒童最常見的一種眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤,以白瞳癥和斜視為首發(fā)癥狀。p53基因突變和RB1基因缺失是發(fā)病的重要原因。研究表明,來自p53腫瘤抑制通路內(nèi)的多個點影響鐵死亡敏感性。p53抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)介導的細胞周期抑制劑RB蛋白磷酸化,磷酸化的RB釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子蛋白,這些蛋白可反激活細胞周期促進基因。p53水平升高、RB基因的缺失增強了鐵死亡[53]。在RB的治療中研究者發(fā)現(xiàn),卡鉑長期治療RB后出現(xiàn)獲得性多重耐藥性(multi drug resistance,MDR),而誘導自噬依賴性鐵死亡可以消除人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞耐藥性。這一過程是通過衣康酸衍生物誘導自噬介導的鐵死亡增加,降解細胞凋亡效應(yīng)半胱天冬酶,從而恢復抗癌藥物卡鉑、依托泊苷和長春新堿的活性[54]。此外,在晚期肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的治療中,HCC細胞的RB蛋白在索拉非尼環(huán)境中促進了鐵死亡的發(fā)生,加速了癌細胞的氧化性壞死[55]。通過這些研究,我們可以發(fā)現(xiàn)通過對鐵死亡發(fā)生的調(diào)控,可以有效降低甚至消除細胞對抗癌藥物的耐藥性,加速癌細胞的死亡,從而有效的治療RB。由此可以推測鐵死亡或?qū)⒊蔀橐暰W(wǎng)膜母細胞瘤的治療的新方向。

2.5RD RD即視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮層的脫離。RD患者視功能恢復的影響因素一直備受關(guān)注,視網(wǎng)膜感光細胞(photoreceptor,PR)損傷與RD后視功能損傷密切相關(guān)。一項研究發(fā)現(xiàn),RD患者的玻璃體、視網(wǎng)膜下液中鐵離子水平、總鐵結(jié)合力隨著網(wǎng)脫時間的延長增高,在RD人組織切片中也發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜脫離區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium,RPE)鐵離子的堆積。同一實驗中,研究者發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)鐵蛋白阻止了小鼠和大鼠RD模型中RPE中鐵的積聚、PR細胞的核固縮,有效的保護了PR細胞死亡[56]。這表明鐵至少部分介導RD期間PR損傷,鐵螯合劑的使用可以減少這一損傷,在RD發(fā)生后給予適量的鐵螯合劑從而減少PR的損傷,提高術(shù)后視力,這或許為RD的預后提供另一個新的研究方向。

2.6Stargardt病鐵死亡是視網(wǎng)膜病中光感受細胞死亡的重要途徑之一,常染色體隱性遺傳性Stargardt病(STGD1)中。與ARMD類似,當過量的神經(jīng)視網(wǎng)膜全反式視網(wǎng)膜(all-trans-retinal,atRAL)在感光細胞中蓄積,將促進ROS的過度產(chǎn)生,觸發(fā)細胞鐵死亡。GSH補充劑、抑制Fe2 +通過甲磺酸去鐵胺(deferoxamine,DFO)或脂質(zhì)過氧化與鐵抑素-1可以保護光感受細胞免受atRAL引起的鐵死亡,作為預防STGD1的新靶點[20]。所以,鐵死亡可能成為研究預防STGD1的新方向。

3 展望

近年來,鐵死亡的研究成為了新的熱點,且在眾多疾病中取得了突破。通過調(diào)控Fe2 +、相關(guān)通路蛋白的表達來調(diào)控鐵死亡,抑制鐵積累、增加抗氧化劑水平并減少脂質(zhì)過氧化等手段抑制鐵死亡的發(fā)生,尋找潛在的相關(guān)治療靶點,從而預防治療相關(guān)眼底疾病,包括ARMD、RP等。雖然目前很多發(fā)病機制與鐵死亡之間的分子機制仍不清晰,治療及預后不明確,但是為眼底很多疾病中的研究提供了新的方向,明確各眼底病發(fā)病機制中的信號通路、尋找特異性治療靶點,研發(fā)相關(guān)治療藥物將為臨床治療帶來新的思路和方案。