銀耳多糖醇沉級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

楊芳，王藝涵，袁辛銳，遲原龍，姚開，賈冬英*

1. 四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院（成都 610065）；2. 四川白家食品產(chǎn)業(yè)有限公司（成都 610065）

酪氨酸酶是含銅的氧化還原酶，廣泛分布于生物體中，具有雙重催化活性，既可催化L-酪氨酸羥基化生成L-多巴，也可將L-多巴氧化生成多巴醌，后者進(jìn)一步氧化聚合形成黑色素[1]，是參與人體皮膚黑色素形成的關(guān)鍵酶。抑制酪氨酸酶活性可減少體內(nèi)黑色素和色斑的生成，從而起到美白祛斑的作用[2-3]。從天然食材中提取分離得到安全、高效的酪氨酸酶抑制劑已成為目前研究熱點(diǎn)[4]。研究表明，某些植物多糖對(duì)酪氨酸酶活性具有一定抑制作用。Yang等[5]發(fā)現(xiàn)，龍眼果皮多糖具有良好的酪氨酸酶抑制活性，能夠抑制L-酪氨酸生成L-多巴；Tang等[6]研究顯示，板栗多糖可抑制酪氨酸酶活性，該抑制作用屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

銀耳俗稱白木耳、雪耳，自古以來就是女性美容養(yǎng)顏佳品。多糖是銀耳的主要活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、修復(fù)記憶障礙等生物活性[7-9]。來吉祥等[10]發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖具有優(yōu)良的保濕功效，用于化妝品中可減輕皮膚粗糙度，增強(qiáng)皮膚彈性。劉卉[11]研究顯示，化妝品中以0.05%銀耳多糖替代0.02%透明質(zhì)酸能達(dá)到更好的保濕效果。然而，關(guān)于銀耳多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用卻鮮有報(bào)道?；诖耍囼?yàn)比較不同銀耳多糖醇沉級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，探討其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類型，以期為銀耳多糖在化妝品中的高附加值利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福建古田銀耳（市售）。

酪氨酸酶（730 U/mg）、L-酪氨酸、L-多巴（上海源葉生物科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品（2.5～5 348 kDa，色譜純?cè)噭绹?guó)Sigma公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

SNB-2數(shù)字黏度計(jì)（上海精天儀器有限公司）；UV6000PC-1100型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；Spectra Max 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；Waters Breeze GPC凝膠滲透色譜儀（美國(guó)沃特斯有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 銀耳多糖分步醇沉級(jí)分的制備與純化

1.3.1.1 銀耳多糖分步醇沉級(jí)分的制備

參考高溫高壓法[12]提取銀耳多糖，并稍作修改。稱取一定質(zhì)量的干銀耳，加入其60倍質(zhì)量的飲用純凈水，浸泡20 min后打漿，將所得漿液于0.1 MPa、121℃下加壓提取30 min，離心后得到上清液，于60 ℃下真空濃縮使其黏度達(dá)到3.4±0.1 Pa/s（25 ℃，轉(zhuǎn)子#4，60 r/min），得到濃縮液。

在濃縮液中加入無水乙醇使體系乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)20%，攪拌后于4 ℃下靜置24 h，離心后分別收集沉淀物與上清液；將所得沉淀物用無水乙醇及丙酮洗滌、抽濾后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到銀耳多糖醇沉級(jí)分STP 20。將所得的上清液真空濃縮至上述黏度，加入無水乙醇調(diào)整體系乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，攪拌后按照上述方法進(jìn)行靜置沉淀和離心、洗滌、抽濾、干燥得到STP 40。將所得上清液按照上述方法依次調(diào)整體系的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到60%，80%得到銀耳多糖級(jí)分STP 60、STP 80。將得到的4種銀耳多糖級(jí)分稱質(zhì)量后按照式（1）計(jì)算其得率。

式中：m為干燥多糖級(jí)分質(zhì)量，g；M為干銀耳質(zhì)量，g。

1.3.1.2 銀耳多糖醇沉級(jí)分STP 60的純化

采用DEAE-Cellulose 52柱層析，濕法裝柱（Φ2×30 cm）。配制10 mg/mL的STP 60水溶液，以0.4 mL/min流速上樣10 mL后先用多于1倍柱體積的去離子水洗脫，依次用0.2，0.4和0.6 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，每10 min收集1管；隔管取0.5 mL，用苯酚-硫酸法檢測(cè)其多糖含量，繪制洗脫曲線；收集同一洗脫峰溶液，經(jīng)透析、濃縮、凍干后得到純化STP 60。

1.3.2 銀耳多糖醇沉級(jí)分純度測(cè)定

以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，苯酚-硫酸法[13]測(cè)定其在不同質(zhì)量濃度下反應(yīng)液的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸后得到回歸方程y=0.008 1x-0.010 6（R2=0.999 1）。按照同樣方法測(cè)定4種銀耳多糖醇沉級(jí)分溶液的吸光度，將其代入回歸方程后計(jì)算出多糖樣品的純度。

1.3.3 銀耳多糖醇沉級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量與純化STP 60的單糖組成分析

1.3.3.1 醇沉級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

參照Mao等[14]所述凝膠滲透色譜法測(cè)定銀耳多糖級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量。GPC色譜條件：色譜柱為Ultrahyrogel linear（7.8 mm×300 mm），檢測(cè)器為2400示差折光檢測(cè)器，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為0.2 mol/L NaNO3溶液，pH 6.0，流速0.6 mL/min，對(duì)照品為窄分布的葡聚糖。

1.3.3.2 純化STP 60的單糖組成分析

參考Dai等[15]所述的3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生HPLC法，測(cè)定純化STP 60的單糖組成。以鼠李糖、巖藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸為對(duì)照品。

HPLC條件：色譜柱為SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱溫25 ℃、流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）和乙腈混合液（82︰18，V/V）、流速1.0 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

1.3.4 銀耳多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

1.3.4.1 對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制作用

參考Maisuthisakul等[16]方法，并稍作修改。將90 μL磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 6.8）和50 μL 100 μg/mL酪氨酸酶溶液依次加入到50 μL 1 mg/mL銀耳多糖醇沉級(jí)分溶液中，混合均勻后于37 ℃下預(yù)熱5 min，加入60 μL 2.5 mmol/L的L-酪氨酸溶液，混勻后于該溫度下保持10 min，振蕩后立即于490 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，每一樣品重復(fù)測(cè)定3次。按照以式（2）計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制作用。

式中：A1、A2、A3、A4分別是樣品組、樣品背景組（PBS代替酪氨酸酶）、空白組（蒸餾水代替樣品）、空白背景組（蒸餾水代替樣品、PBS代替酪氨酸酶）的吸光度。

1.3.4.2 對(duì)酪氨酸酶雙酚酶的抑制作用

參照上述單酚酶抑制作用步驟，以2.5 mmol/L L-多巴溶液替代2.5 mmol/L L-酪氨酸溶液，于37 ℃下繼續(xù)保持2 min，振蕩后立即于490 nm處測(cè)定吸光度。按照式（2）計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶雙酚酶抑制率。

1.3.5 銀耳多糖STP 60對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制作用類型與動(dòng)力學(xué)分析

1.3.5.1 抑制作用類型分析

固定底物L(fēng)-酪氨酸溶液濃度2.5 mmol/L，改變酪氨酸酶濃度，測(cè)定4種質(zhì)量濃度STP 60時(shí)的酶活力，以酪氨酸酶濃度為橫坐標(biāo)、酪氨酸酶活力為縱坐標(biāo)作圖，根據(jù)二者的關(guān)系判斷STP 60對(duì)該酶的抑制作用[17]。

1.3.5.2 抑制作用動(dòng)力學(xué)分析

固定酪氨酸酶質(zhì)量濃度為100 μ g/mL，改變底物L(fēng)-酪氨酸濃度，測(cè)定4種質(zhì)量濃度STP 60時(shí)的酶活力，根據(jù)Lineweaver-Burk法繪制底物濃度與酶反應(yīng)速率的雙倒數(shù)圖，分析STP 60對(duì)酪氨酸單酚酶的動(dòng)力學(xué)[18]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

除分子量外，其余試驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用OriginPro 2017繪圖，采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳多糖醇沉級(jí)分的得率和純度及相對(duì)分子質(zhì)量與單糖組成

4種銀耳多糖醇沉級(jí)分的得率、純度及分子量見表1。4種銀耳多糖級(jí)分的得率和純度差異顯著，以STP 60為最高，表明銀耳多糖主要是由STP 60為代表的中分子量多糖構(gòu)成。隨著醇沉?xí)r乙醇體積濃度增大，銀耳多糖級(jí)分的重均分子量和數(shù)均分子量逐漸減小，但均在同一數(shù)量級(jí)；4種級(jí)分的多分散系數(shù)遠(yuǎn)大于1，表明其分子量分布范圍較廣，以STP 60最為明顯。

表1 銀耳多糖分步醇沉級(jí)分的得率和純度與相對(duì)分子質(zhì)量

純化STP 60經(jīng)PMP柱前衍生后的HPLC檢測(cè)圖譜如圖1所示。STP 60是由甘露糖、巖藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖和半乳糖醛酸組成，其摩爾比為871.72︰323.94︰251︰218.03︰15.51︰3.95︰2.01︰1.66︰1.03︰0.74。銀耳多糖的單糖組成以甘露糖、巖藻糖、木糖和葡萄糖醛酸為主，甘露糖含量最高，因此STP 60可能是以甘露聚糖為主鏈的酸性雜多糖。試驗(yàn)結(jié)果與Ukai等[19]得到的銀耳子實(shí)體多糖的單糖組成相似，但其含量差異較大，尤其是巖藻糖的含量明顯偏高，這可能與銀耳的產(chǎn)地、栽培方式及多糖的提取方法有關(guān)。

圖1 純化STP 60的HPLC色譜圖

2.2 銀耳多糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

4種銀耳多糖級(jí)分對(duì)酪氨酸酶單酚酶和雙酚酶的抑制作用如圖2所示。它們對(duì)酪氨酸酶均有一定抑制作用，其對(duì)單酚酶活性的抑制作用明顯強(qiáng)于雙酚酶，其中STP 60的抑制作用最大，STP 20的抑制作用最小。4種級(jí)分的抑制作用與其純度呈正相關(guān)，純度越高，其抑制作用越大。純度最高的STP 60在質(zhì)量濃度為1 mg/mL的條件下，對(duì)單酚酶和雙酚酶的抑制率分別為37.55%和9.94%，其抑制作用明顯高于羊棲菜多糖[20]和板栗多糖[6]。然而，銀耳多糖級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用明顯低于維生素C，這主要是因?yàn)楹笳呒仁且环N強(qiáng)抗氧化劑，也是一種金屬離子螯合劑，它可以通過強(qiáng)大的抗氧化和螯合銅離子2種途徑產(chǎn)生明顯的抑酶作用。

圖2 銀耳多糖級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

2.3 STP 60對(duì)酪氨酸單酚酶的抑制作用類型與抑制動(dòng)力學(xué)

抑制劑對(duì)酶活性的抑制作用分為可逆抑制和不可逆抑制。利用酶活性與酶的關(guān)系圖區(qū)分可逆抑制劑和不可逆抑制，直線過原點(diǎn)為可逆抑制，直線平行則為不可逆抑制。在酶活測(cè)定體系中，加入不同質(zhì)量濃度的STP 60，以酪氨酸酶濃度為橫坐標(biāo)、酶活力為縱坐標(biāo)作圖，得到二者之間的關(guān)系，如圖3所示?？梢钥闯觯?條直線均通過原點(diǎn)，且隨著STP 60濃度增大，直線斜率變小，說明STP 60對(duì)酪氨酸酶的抑制作用具有可逆性，與酶之間以非共價(jià)鍵發(fā)生可逆結(jié)合[16]，不會(huì)使酪氨酸酶永久失活。

圖3 酪氨酸酶單酚酶活性與酶濃度的關(guān)系

圖4 為4種質(zhì)量濃度的STP 60對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。4條直線均相交于第二象限X軸上一點(diǎn)，隨著STP 60濃度增大，直線與縱坐標(biāo)截距增大，也就是說，隨著STP 60濃度增加，米氏常數(shù)Km保持不變，最大反應(yīng)初速度Vmax逐漸減小。參數(shù)變化表明，STP 60對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即底物、抑制劑和酶之間的結(jié)合無競(jìng)爭(zhēng)性。因此，STP 60對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制，這一結(jié)果與Yang等[5]關(guān)于龍眼皮多糖的研究結(jié)果一致。對(duì)酪氨酸酶而言，其非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常是由于結(jié)合酶活性中心以外的殘基而影響了酶活性，也可能是由于抑制劑對(duì)氧自由基的清除作用阻礙酶催化反應(yīng)[4]。

圖4 STP 60對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖

3 結(jié)論

4種銀耳多糖醇沉級(jí)分對(duì)酪氨酸酶的單酚酶活性和雙酚酶活性均具有一定抑制作用，且對(duì)單酚酶活性的抑制作用明顯強(qiáng)于雙酚酶活性抑制，其中STP 60對(duì)單酚酶活性的抑制作用最大，屬于非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制。有關(guān)銀耳多糖對(duì)此酶的抑制作用機(jī)理有待深入探討。