低聚木糖對高脂飲食致脂肪肝小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制

李翰卿 李宇鹍 張震 田字彬 齊興四

［摘要］ ?目的 ?探討低聚木糖對高脂飲食所致脂肪肝小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。

方法5周齡C57/BL6J雄性小鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。低脂飲食對照組（LFD組）和高脂飲食模型組（HFD組）分別喂飼脂肪含量10%的低脂飼料和脂肪含量60%的高脂飼料，高脂飲食+低劑量低聚木糖干預(yù)組（XOS.L組）和高脂飲食+高劑量低聚木糖干預(yù)組（XOS.H組）小鼠在HFD組基礎(chǔ)上分別灌胃0.35和1.0 g/kg低聚木糖，每日1次，LFD組、HFD組小鼠同時(shí)灌胃等劑量生理鹽水。第16周時(shí)收集各組小鼠血液、肝臟組織、糞便樣本，測定各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、三酰甘油（TG）水平，HE染色和油紅O染色對肝臟進(jìn)行組織學(xué)評估；通過16S rRNA微生物測序技術(shù)及代謝組學(xué)檢測分析各組小鼠糞便腸道菌群和代謝物的變化。

結(jié)果與LFD組相比，HFD組肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變性，花生四烯酸、亞油酸（LA）等多種代謝產(chǎn)物紊亂，F(xiàn)aecalibaculum、Bacteroidaceae等致病菌群豐度均顯著增加，Bacteroides、Ruminococcaceae等有益菌群豐度降低。XOS.H組較HFD組Ruminococcaceae、Actinobacteria等相關(guān)菌群豐度和肝臟脂肪變性明顯改善，肝臟SAF評分降低，前列腺素H2等促炎代謝物富集強(qiáng)度降低，前列腺素D2、二十二碳五烯酸、LA等代謝物富集強(qiáng)度增加。

結(jié)論低聚木糖可以明顯改善高脂飲食所致脂肪肝小鼠的肝臟脂肪變性，改善高脂飲食介導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)及代謝物紊亂，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)腸道菌群干預(yù)花生四烯酸、LA等代謝通路來實(shí)現(xiàn)。

［關(guān)鍵詞］ ?寡糖類；益生元；非酒精性脂肪性肝??；胃腸道微生物組；脂類代謝；代謝網(wǎng)絡(luò)和途徑

［中圖分類號］ ?R575.5

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ ?A

Protective effect of xylo-oligosaccharides on mice with fatty liver induced by high-fat diet and related mechanisms

LI Hanqing， LI Yukun， ZHANG Zhen， ?TIAN Zibin， QI Xingsi

（Department of Gastroenterology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

;［ABSTRACT］?Objective?To investigate the protective effect of xylo-oligosaccharides on mice with fatty liver induced by high-fat diet and related mechanisms.

Methods?A total of 40 male C57/BL6J mice， aged 5 weeks， were randomly divided into low-fat diet control group （LFD group）， high-fat diet model group （HFD group）， high-fat diet+low-dose xylo-oligosaccharide intervention group （XOS.L group）， and high-fat diet+high-dose xylo-oligosaccharide intervention group （XOS.H group）， with 10 mice in each group. The mice in the LFD group were fed a low-fat diet containing 10% fat， and those in the HFD group were fed a high-fat diet containing 60% fat; in addition to the treatment in the HFD group， the mice in the XOS.L group were given xylo-oligosaccharides at a dose of 0.35 g/kg by gavage once a day， and those in the XOS.H group were given xylo-oligosaccharides at a dose of 1.0 g/kg by gavage once a day; the mice in the LFD group and the HFD group were given an equal volume of normal saline by gavage. At the end of week 16， blood， liver tissue， and fecal samples were collected from each group of mice; the serum levels of alanine ami-

notransferase （ALT）， aspartate aminotransferase and triglyceride （TG） were measured; HE staining and oil red O staining were used to perform a histological evaluation of the liver; 16S rRNA microbial sequencing technology and metabolomics were used to measure the changes in fecal gut microbiota and metabolites.

Results?compared with LFD group， the HFD group showed significant steatosis of the liver， disturbances in various metabolites including arachidonic acid and linoleic acid （LA）， significant increases in the abundances of the pathogenic bacteria such as Faecalibaculum， Bacteroidaceae， and significant reductions in the abundances of the probiotic bacteria such as Ruminococcaceae， ?Bacteroides. Compared with the HFD group， the XOS.H groups showed a significant improvement in liver steatosis and ?the abundances of related microbiota such as Ruminococcaceae and Actinobacteria， significant reductions in liver SAF scores and the enrichment intensities of the proinflammatory metabolites such as Prostaglandin H2， and significant increases in the enrichment intensities of the metabolites such as ?Prostaglandin D2， LA， and docosahexaenoic acid.

Conclusion?Xylo-oligosaccharides can significantly improve liver steatosis， gut microbiota dysbiosis， and metabolite disturbances induced by high-fat diet in mice， possibly by regulating the gut microbiota to interfere with the metabolic pathways such as arachidonic acid and LA.

［KEY WORDS］?Oligosaccharides; Prebiotics; Non-alcoholic fatty liver disease; Gastrointestinal microbiome; Lipid metabolism; Metabolic networks and pathways

隨著人們生活水平的提高，高脂飲食致脂肪肝（fatty liver disease，F(xiàn)LD）的發(fā)病率呈上升趨勢，該病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)最常見的慢性肝病之一［1］。FLD除可直接導(dǎo)致失代償性肝硬化、肝細(xì)胞癌外，還可增加2型糖尿病、心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［2］，因此高脂飲食所致FLD的防治已成為目前臨床關(guān)注的熱點(diǎn)之一。低聚木糖（XOS）是一種穩(wěn)定性好、安全性高的益生元。目前研究表明，XOS可通過提高大鼠腸道有益菌的豐度水平，調(diào)整短鏈脂肪酸（SCFAs）組成、減少酪氨酸和異戊酸含量，從而改善肝臟脂肪堆積狀況［3-4］，但具體機(jī)制尚不明確。本研究從腸道菌群及糞便代謝組學(xué)角度探討不同劑量XOS對高脂飲食所致FLD的影響效果及機(jī)制，為FLD的臨床防治提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小鼠的分組與處理

5周齡C57/BL6J雄性小鼠40只，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，于18～24 ℃光暗各12 h環(huán)境下飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂飼7 d后，隨機(jī)分為低脂飲食對照組（LFD組）、高脂飲食模型組（HFD組）、高脂飲食+低劑量XOS干預(yù)組（XOS.L組）、高脂飲食+高劑量XOS干預(yù)組（XOS.H組）4組，每組10只。LFD組和HFD組分別喂飼脂肪含量10%的低脂飼料和脂肪含量60%的高脂飼料，XOS.L組和XOS.H組小鼠在HFD組基礎(chǔ)上分別灌胃0.35和1.0 g/kg的XOS（將0.35 g和1.0 g的XOS分別溶于10 mL生理鹽水中），每日1次；LFD組、HFD組小鼠灌胃等劑量生理鹽水。所有小鼠共灌胃16周。每日記錄小鼠進(jìn)食量，每日測量小鼠體質(zhì)量。

1.2 小鼠血生化指標(biāo)的檢測及肝臟的組織學(xué)評估

第16周時(shí)，小鼠禁飲食12 h后，腹腔麻醉，眼球取血，分離血清，使用自動(dòng)生化分析儀檢測小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、三酰甘油（TG）含量。采血后斷頸處死小鼠，立即剝離出小鼠的肝臟組織；收集小鼠近段結(jié)腸內(nèi)的新鮮糞便，液氮冷凍后于冰箱-80 ℃保存，備用。各組小鼠分別取1/4肝臟組織，用4%多聚甲醛固定24 h之后，石蠟包埋后切片，洗脫石蠟后切片行蘇木素-伊紅（HE）染色；另取各組小鼠1/4肝臟組織于4%多聚甲醛固定24 h后，OCT包埋后切片，洗脫OCT后行油紅O染色。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家對各組小鼠肝臟的HE染色切片，通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)評估，評分標(biāo)準(zhǔn)參照SAF評分系統(tǒng)［5］。

1.316S rRNA基因測序和數(shù)據(jù)分析

取各組小鼠的新鮮糞便樣本，使用DNA抽提試劑盒提取糞便中的基因組DNA，以16S rRNA為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增靶向引物行PCR擴(kuò)增，使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA濃度并將其純化后，通過上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司的Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序。將所獲得的測序數(shù)據(jù)，通過FLASH軟件進(jìn)行拼接、序列質(zhì)控后得到有效序列，使用Vsearch軟件將有效序列歸類為多個(gè)可操作分類單元（OTUs）。通過Muscle（version v.1.30）軟件對各組基于OUTs結(jié)果的小鼠腸道菌群種類進(jìn)行α多樣性分析，獲得代表腸道菌群種類多樣性的Shannon指數(shù)，使用R語言工具繪制各組菌群種類多樣性的分布熱圖和箱式圖；通過多變量主坐標(biāo)分析（PCoA）對各組小鼠腸道菌群豐度的β多樣性進(jìn)行分析，即基于歐式距離算法和95%置信區(qū)間，來分析各組腸道菌群的距離尺度，得到橫坐標(biāo)（PC1）和縱坐標(biāo)（PC2）的PCoA圖。通過MetaStats分析各組小鼠腸道菌群在科水平和屬水平相對豐度，并進(jìn)行比較，獲得各組間差異較大的腸道菌群。

1.4 小鼠糞便代謝組學(xué)分析

取各組小鼠的新鮮糞便樣本，經(jīng)PBS預(yù)處理后，采用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（由Nexera UPLC超高效液相串聯(lián)QE高分辨質(zhì)譜儀組成）分析在ESI正離子和負(fù)離子模式下的糞便代謝譜。通過Proteo Wi-zard軟件把糞便代謝譜的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成mzXML格式，然后應(yīng)用Progenesis QI v2.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將處理好的數(shù)據(jù)通過正交偏小二乘判別分析（OPLS-DA）模型來區(qū)分各組小鼠代謝譜的差異。為了驗(yàn)證該模型的可靠性，采用置換驗(yàn)證對其進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)。

1.5 差異代謝物獲取與通路富集分析

將從各組小鼠糞便中分析得到的糞便代謝譜數(shù)據(jù)，利用R語言中的Metabo Analyst R包，以P＜0.05且VIP＞1為篩選條件進(jìn)行代謝物差異分析。將獲得的差異代謝物導(dǎo)入Metabo Analyst 5.0平臺，再使用KEGG Compound數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，比較差異代謝物在共同通路中的富集強(qiáng)度。采用Speraman方法對各組小鼠的差異腸道菌群與差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，以獲得腸道菌群與代謝物之間的相互關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0和Graphapd 8.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或MetaStat分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。使用QIIME（1.8.0）、R軟件（3.6.2）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制圖形。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 各組小鼠血清指標(biāo)及肝臟組織學(xué)比較

單因素方差分析結(jié)果顯示，4組小鼠血清中ALT、AST、TG水平及肝臟SAF評分比較差異均有顯著性（F=39.17～113.80，P＜0.05）。其中與LFD組比較，HFD組血清ALT、AST、TG水平及SAF評分均顯著增高（t=8.26～15.68，P＜0.05）；與HFD組比較，XOS.L組和XOS.H組小鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低（t=5.89～12.19，P＜0.05）；XOS.H組較XOS.L組小鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低（t=2.37～3.79，P＜0.05）。見表1。

肝臟組織切片HE染色顯示，LFD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列較為整齊，肝索呈放射狀排列，無明顯纖維化；XOS.H組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝索排列尚整齊，輕度纖維化；XOS.L組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列不齊，部分肝細(xì)胞氣球樣變，纖維化較XOS.H組重；HFD組小鼠肝臟損傷嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細(xì)胞腫脹、肝索排列紊亂，有大量氣球樣變，明顯纖維化。油紅O染色顯示，LFD組肝臟組織切片幾乎無油紅著色，XOS.H組有輕微著色，XOS.L組著色較LFD組、XOS.H組深，但比HFD組輕，而HFD組小鼠肝臟內(nèi)著色均較余3組明顯。見圖1。

2.2 小鼠腸道菌群多樣性分析

α多樣性分析的結(jié)果顯示，LFD組、HFD組、XOS.L組、XOS.H組小鼠腸道菌群種類多樣性均未見顯著性差異（P＞0.05），Shannon指數(shù)分別為5.81±0.94、6.07±0.85、6.13±0.61、6.25±0.37，各組間比較差異無顯著性（P＞0.05）；同時(shí)通過Shan- non指數(shù)所繪制的箱式圖也呈窄、扁形狀，見圖2A，說明各組Shannon指數(shù)值相對穩(wěn)定。

4組小鼠腸道菌群豐度的β多樣性分析詳見圖2B，圖中4組腸道菌群豐度以4種不同的顏色的符號表示，以95%置信區(qū)間將各組腸道菌群豐度進(jìn)行聚類，顯示HFD組與LFD組、XOS.L組和XOS.H組橢圓重疊度均較低，說明HFD組與余3組的菌群豐度差異較大；LFD組、XOS.L組和XOS.H組橢圓重疊度較高，說明這3組菌群豐度差異較??；XOS.H組與LFD組橢圓重疊度最高，說明這兩組的腸道菌群豐度差異最小。

MetaStat分析結(jié)果顯示，在屬水平方面，4組小鼠中腸道菌群相對豐度均較高的屬分別為Bacteroides、Parabacteroides、Faecalibaculum、Alistipes、Colidextribacter、Oscillibacter、Coriobacte-riaceae_UCG_00等。其中與LFD組相比較，HFD組Bacteroides、Parabacteroides等菌群豐度顯著降低（P＜0.01），而Faecalibaculum、Alistipes、Colidextribacter、Oscillibacter等菌群的豐度顯著升高（P＜0.05）；與HFD組相比，XOS.H組Actinobacteria、Coriobacteriia、Coriobacteriaceae_UCG_002等菌群豐度顯著降低（P＜0.05）；XOS.L組與其余三組比較，各菌群豐度差異不明顯（P＞0.05）?？扑椒矫?，4組小鼠中腸道菌群相對豐度均較高的科分別為Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Ruminococcaceae等。與LFD組相比， HFD組Ruminococcaceae、 Erysipelatotrichaceae、Lachnospiraceae、 Oscillospirace等菌群的豐度顯著升高（P＜0.05），Bacteroidaceae、Muribaculaceae、Prevotellaceae等菌群的豐度顯著降低（P＜0.05）；與HFD組相比，XOS.H組Ruminococcaceae、Atopobiaceae、Bacteroidaceae、Faecalibaculum、Erysipelatotrichaceae等菌群豐度顯著降低（P＜0.05），Bifidobacterium、Alloprevotella、Prevotellaceae等菌群豐度顯著升高（P＜0.01）；XOS.L組較其余的3組僅Fusobacterium、Erysipelatotrichaceae菌群的豐度顯著降低（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠糞便差異代謝物分析

在OPLS-DA模型中，4組小鼠糞便差異代謝物的分布明顯分離，互不重疊，說明OPLS-DA模型無過度擬合，穩(wěn)定性良好，對糞便代謝物差異性分析的評價(jià)結(jié)果可靠度高。同時(shí)對模型經(jīng)200次置換檢驗(yàn)后，顯示R2=0.97，Q2=－0.2， R2表示模型的擬合情況，其值接近1.0，證明模型的穩(wěn)定性好；Q2為模型的預(yù)測指數(shù)，其值為負(fù)值，證明模型的預(yù)測能力可靠。

對小鼠糞便代謝物分析顯示，HFD組與LFD組比較有117種上調(diào)，66種下調(diào)（VIP=1.0～2.0，P＜0.05）；XOS.L組與HFD組比較有84種上調(diào)，77種下調(diào)（VIP=1.0～3.0，P＜0.05）；XOS.H組與HFD組比較有247種上調(diào)，91種下調(diào)（VIP=1.0～1.5，P＜0.05）；XOS.H組與XOS.L組比較有100種上調(diào)，15種下調(diào)（VIP=0.5～2.5，P＜0.05）。各組間兩兩比較得到的最顯著的差異代謝物包括前列腺素H2（PGH2）、前列腺素D2（PGD2）、白三烯B4（LTB4）、△12-前列腺素J2（△12-PGJ2）、亞油酸（LA）、二十二碳五烯酸（DPA）等。

2.4 各組差異代謝物KEGG通路富集分析

分析結(jié)果顯示，4組小鼠的差異代謝物在花生四烯酸代謝途徑、LA代謝途徑、不飽和脂肪酸代謝途徑中均發(fā)生顯著富集，其中，HFD組較LFD組△12-PGJ2、PGH2等差異代謝物富集強(qiáng)度顯著上調(diào)（P＜0.001），PGD2等差異代謝物富集強(qiáng)度顯著下調(diào)（P＜0.05），XOS.H組較HFD組的PGH2富集下調(diào)，而PGD2以及不飽和脂肪酸LA、DPA富集強(qiáng)度顯著上調(diào)（P＜0.01），XOS.L組較HFD組僅DPA、PGD2的富集強(qiáng)度上調(diào)（P＜0.01）。

2.5 各組小鼠腸道菌群與差異代謝物相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，差異代謝物PGH2與Alistipes、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium等的豐度呈正相關(guān)性（P＜0.01），同時(shí)與Lachnospiraceae_NK4A136_group、Allobaculum、Faecalibaculum的豐度呈負(fù)相關(guān)性（P＜ 0.05）。 PGD2與Lachnospiraceae_ NK4A136_group的豐度呈正相關(guān)（P＜0.05），而與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium以及Alistipes的豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（P＜0.01）?！?2-PGJ2與Colidextribacter的豐度呈正相關(guān)性（P＜0.01），與Bacteroides、Alloprevotella豐度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。同時(shí)LA與Lachnospiraceae_NK4A136_group、Oscillibacter、Colidextribacter的豐度呈正相關(guān)（P＜0.05）， 與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ileibacterium、Lactobacillus、［Eubacterium］_fissicatena_group的豐度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。另外DPA與Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度呈正相關(guān)（P＜0.001），而與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ileibacterium、Lactobacillus、Alistipes的豐度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討 ?論

通過改善腸道菌群治療高脂飲食所致FLD是目前比較受關(guān)注的治療手段之一［6-7］，“腸-肝軸”理論是支持該治療策略的主要依據(jù)［8-9］。益生元可刺激腸道有益菌群的活性和生長，對宿主健康產(chǎn)生積極影響［10］。XOS是一種更具耐酸性和抗熱性的益生元，在經(jīng)過上消化道時(shí)不會被分解，可以穩(wěn)定地進(jìn)入腸道［11］。

本研究對5周齡C57/BL6J雄性小鼠分別喂飼低脂和高脂飼料，并對高脂飼料喂飼小鼠分別灌胃不同劑量的XOS，16周后，HFD組較LFD組、XOS.H組、XOS.L組血清ALT、AST、TG水平顯著升高，XOS.H組較XOS.L組的ALT、AST、TG水平顯著降低，與已有研究結(jié)果一致［12］。說明XOS的干預(yù)可顯著降低小鼠血液中的ALT、AST、TG水平，提高肝細(xì)胞血脂代謝能力，且高劑量較低劑量效果更顯著。同時(shí)本研究對小鼠的肝臟切片行油紅O染色及HE染色，觀察顯示，HFD組小鼠肝臟肝索紊亂，肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞內(nèi)脂滴浸潤嚴(yán)重，肝臟中重度纖維化，SAF評分最高；LFD組小鼠肝臟切片示肝細(xì)胞排列較為整齊，無明顯纖維化，肝細(xì)胞內(nèi)幾乎無油紅O著色，無明顯脂滴積累、水腫；XOS.L組上述特征較HFD組減輕，且XOS.H組上述特征較HFD組改善更加明顯，與LFD組比較接近，說明了XOS可改善FLD小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴堆積及細(xì)胞水腫，顯著降低肝細(xì)胞損傷，且高劑量較低劑量效果更顯著。

本研究對4組小鼠腸道菌群種類的α多樣性分析結(jié)果顯示，4組小鼠的Shannon指數(shù)無顯著差異，說明4組小鼠腸道菌群種類沒有明顯差異，即4組間菌群種類相似。對腸道菌群豐度的β多樣性分析結(jié)果顯示，HFD組與LFD組菌群豐度差異較大，提示腸道菌群對FLD發(fā)生發(fā)展有顯著影響，XOS.H組與LFD組的菌群豐度的差異最小，提示XOS對FLD小鼠腸道菌群有顯著調(diào)節(jié)作用。

目前研究顯示FLD小鼠腸道中Erysipelatotrichaceae、Faecalibaculum等菌群豐度較正常小鼠顯著升高［13］；此外，有研究發(fā)現(xiàn)Ruminococcaceae、Lachnospiraceae菌群豐度在肥胖人群腸道中顯著升高，對T2DM進(jìn)展有促進(jìn)作用，腸道中Muriba-culaceae具有促進(jìn)脂質(zhì)氧化代謝，減輕脂質(zhì)堆積的作用［14-15］。本研究同時(shí)對小鼠腸道菌群豐度進(jìn)行了MetaStat分析，結(jié)果顯示，在屬水平上，HFD組較LFD組的小鼠腸道中Faecalibaculum、Alistipes、Colidextribacter、Oscillibacter等菌群的豐度顯著升高，高劑量XOS干預(yù)可以顯著地降低HFD組小鼠Actinobacteria、 Coriobacteriaceae_UCG_002、Co- riobacteriia等菌群豐度，低劑量XOS干預(yù)較HFD組未見明顯差異；科水平上，HFD組較LFD組小鼠Ruminococcaceae、Erysipelatotrichaceae、Lachnospiraceae、Oscillospirace等菌群豐度顯著升高，高劑量XOS干預(yù)可顯著降低HFD組小鼠Ruminococcaceae、Atopobiaceae、Bacteroidaceae、Faecalibaculum、Erysipelatotrichaceae等菌群的豐度，而低劑量XOS干預(yù)較HFD組僅有Fusobacterium、Erysipelatotrichaceae菌群豐度降低，提示XOS在屬水平和科水平上對腸道菌群均有調(diào)節(jié)作用，且高劑量較低劑量明顯。研究顯示FLD小鼠中Erysipelatotrichaceae、Faecalibaculum等菌群的豐度相較正常小鼠顯著升高［13］， Ruminococcaceae、Lachno- spiraceae菌群豐度在肥胖人群當(dāng)中顯著性升高，并且對T2DM進(jìn)展有促進(jìn)作用，Muribaculaceae具有促進(jìn)脂質(zhì)氧化代謝，減輕脂質(zhì)堆積的作用［14-15］，以上研究進(jìn)一步提示，XOS可能是通過調(diào)節(jié)屬水平及科水平的多種腸道菌群，來改善FLD小鼠的肝臟脂肪變性。

本研究對小鼠糞便代謝組學(xué)分析的結(jié)果顯示，PGH2、PGD2、LTB4、△12-PGJ2、LA和DPA為最顯著的共同差異代謝物。既往研究顯示，PGH2是合成血栓素及PGD2的前體物質(zhì)，可被前列腺素D2合成酶（L-PGDS）催化異構(gòu)化形成PGD2，L-PGDS缺乏會導(dǎo)致正常小鼠血脂異常及肥胖，促進(jìn)脂肪肝的形成［16-17］。高脂飲食可以影響花生四烯酸代謝途徑中的PGH2、PGD2等相關(guān)代謝物的水平。本研究KEGG通路富集分析的結(jié)果提示，HFD組較LFD組PGH2水平顯著上調(diào)，PGD2水平顯著下調(diào)，XOS.H組相較HFD組PGH2水平顯著下調(diào)，PGD2水平顯著上調(diào)，表明XOS可能通過PGD2抑制花生四烯酸途徑中炎癥因子聚集黏附，減輕炎癥反應(yīng)，又經(jīng)調(diào)節(jié)L-PGDS表達(dá)來改善肝臟的脂肪變性。有研究顯示，XOS可降低脂肪肝小鼠肝臟的脂質(zhì)含量［3］，這也與本研究結(jié)果相符，因此，我們推測XOS可能通過阻斷脂質(zhì)氧化、抑制炎癥反應(yīng)，從而改善肝細(xì)胞脂肪樣變。有研究顯示，LA可以誘導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)換而具有降血脂作用；DPA可以降低脂肪酸合成基因以及一些炎癥相關(guān)基因如腫瘤壞死因子α的表達(dá)，減輕肝臟的脂肪累積及炎癥反應(yīng)［17-18］。在本研究中，LA、DPA在各組中強(qiáng)度也發(fā)生顯著改變，高劑量XOS干預(yù)組與HFD組相比LA、DPA富集強(qiáng)度升高，而低劑量XOS干預(yù)組與HFD組相比DPA的富集強(qiáng)度上調(diào)，表明XOS可能通過調(diào)節(jié)LA、DPA等代謝物富集強(qiáng)度，加速肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇、脂肪酸等脂質(zhì)代謝，從而改善FLD小鼠的肝臟脂肪變性，且高劑量組效果好于低劑量組。

本研究KEGG通路富集分析顯示，花生四烯酸代謝途徑、LA代謝途徑、不飽和脂肪酸代謝途徑是PGH2、PGD2、LTB4、12-PGJ2、LA、DPA共有的富集通路，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，LA、DPA與Ileibacterium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus的豐度呈負(fù)相關(guān)性。同時(shí)與Lachnospiraceae_NK4A136_group的豐度呈正相關(guān)，表明上述菌群可能參與了促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解進(jìn)程，從而改善小鼠FLD進(jìn)展。有研究 表明Lachnospira-ceae_NK4A136_group是一種有益菌，可通過花生四烯酸代謝途徑改善小鼠肥胖狀況［18］，這與本研究結(jié)果相符。PGH2與Alistipes、 Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium等豐度呈正相關(guān)，PGD2則呈負(fù)相關(guān)。因此，XOS可能通過影響Lachnospiraceae_NK4A136、Ileibacterium、Rikenellaceae_RC9、Lactobacillus等菌群的豐度，調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝途徑、LA代謝途徑、不飽和脂肪酸代謝途徑中PGH2、PGD2、LA和DPA等代謝物富集強(qiáng)度，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，減輕脂肪變性。以上結(jié)果均表明XOS具有改善FLD進(jìn)展的作用，但腸道菌群并非是影響FLD的唯一途徑，年齡、地理位置、飲食習(xí)慣、腸道菌群等因素間的復(fù)雜相互作用共同影響人體的健康，且XOS對FLD的作用，也可能并非僅僅是對腸道菌群的影響，所以后續(xù)需進(jìn)行更多計(jì)量梯度及更深入的臨床試驗(yàn)研究，來驗(yàn)證對FLD人群腸道菌群的影響。

綜上所述，本研究通過對FLD模型小鼠的組織病理特征分析顯示，XOS的干預(yù)可顯著降低FLD小鼠血液中的ALT、AST、TG水平，改善肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴堆積及肝細(xì)胞水腫，顯著降低肝細(xì)胞損傷；對小鼠腸道菌群及代謝物的HEGG通路分析顯示，XOS可能通過花生四烯酸代謝、亞油酸代謝及不飽和脂肪酸代謝等途徑調(diào)節(jié)PGH2、PGD2、LA以及DPA等代謝物水平，進(jìn)而影響腸道菌群Lachnospiraceae_ NK4A136_group、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、Ileibacterium等科到屬水平及其腸道代謝物的變化，從而改善FLD小鼠肝臟脂肪樣變，延緩肝損傷進(jìn)展。因此，XOS作為益生元可能具有改善高脂飲食所致FLD的效果。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明： 本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員審核批準(zhǔn)（文件號AHQU-MAL202106-01）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》條例進(jìn)行。

作者聲明： 李翰卿、李宇鹍、齊興四參與了研究設(shè)計(jì)；李翰卿、張震、田字彬、齊興四參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）