細(xì)菌外囊泡的研究進(jìn)展

郭金榮,雍浩蕾,賀雅寧,李沐曉,王麗梅

細(xì)菌外囊泡(bacterial extracellular vesicles, BEVs)是由細(xì)菌分泌的、直徑為10～450 nm的球形雙層膜結(jié)構(gòu),其內(nèi)攜帶有母源細(xì)菌來(lái)源的外膜蛋白、周質(zhì)蛋白、肽聚糖、脂多糖、磷脂、DNA、RNA和毒性因子等物質(zhì),被認(rèn)為是一種特殊形式的細(xì)菌分泌[1-2]。

1965年,研究人員在一株?duì)I養(yǎng)缺陷的大腸埃希菌的電子顯微鏡圖像中,首次觀察到BEVs的產(chǎn)生[3]。隨后幾十年,由于革蘭陽(yáng)性(Gram-positive, G+)菌細(xì)胞壁較厚,被認(rèn)為較難分泌BEVs,研究一直集中于革蘭陰性(Gram-negative, G-)菌的BEVs。直到2009年,Lee等[4]才從金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)上清液中分離出G+菌的BEVs。隨后,在古細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)有BEVs。BEVs在細(xì)菌的發(fā)生和進(jìn)化中扮演著重要的角色,而且與人的正常生理功能和疾病的發(fā)生發(fā)展也具有密切的關(guān)系。本文從BEVs在細(xì)菌的環(huán)境耐受、防御作用、信號(hào)交流、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)菌對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)和發(fā)病機(jī)理等方面,對(duì)當(dāng)前的BEVs研究進(jìn)展進(jìn)行了全面的綜述,為BEVs的相關(guān)研究提供有用參考。

1 BEVs的發(fā)生機(jī)制和結(jié)構(gòu)組成

不同細(xì)菌來(lái)源的BEVs,其生物發(fā)生途徑不同,且具有不同的結(jié)構(gòu)和組成。

1.1 G-菌的BEVs G-菌的BEVs主要通過(guò)兩種途徑生成,即通過(guò)細(xì)菌外膜(outer membrane, OM)的起泡生成或通過(guò)細(xì)菌裂解產(chǎn)生[5-6]。由此,G-菌的BEVs可分為由外膜起泡產(chǎn)生的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)和外-內(nèi)膜囊泡(outer-inner membrane vesicles, OIMVs),以及細(xì)菌裂解產(chǎn)生的外膜囊泡(explosive outer-membrane vesicles, EOMVs)和外-內(nèi)膜囊泡(explosive outer-inner membrane vesicles, EOIMVs)。

1.1.1 OMVs和OIMVs OMVs為一種球形顆粒,由內(nèi)外兩小葉構(gòu)成。內(nèi)小葉由磷脂組成,外小葉由脂多糖、外膜蛋白和膜出芽起泡過(guò)程中捕獲的周質(zhì)蛋白組成[7]。OMVs是由于細(xì)菌外膜紊亂,如肽聚糖生物合成不平衡導(dǎo)致細(xì)菌OM與肽聚糖間的交聯(lián)減少,周質(zhì)間隙中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)或包膜成分的積累,脂多糖分子之間的陰離子電荷排斥以及疏水分子嵌入OM等因素,引起OMVs的產(chǎn)生[5,7]。所以,OMVs富含周質(zhì)蛋白、外膜蛋白和OM特定的脂質(zhì)。然而,OMVs隨著細(xì)菌生長(zhǎng)階段和條件的不同,其攜帶的成分和含量也存在差異[8-9]。

OIMVs的發(fā)生是由于細(xì)菌自溶酶降解肽聚糖層后,細(xì)菌內(nèi)膜突出到周質(zhì)間隙,伴隨胞質(zhì)內(nèi)容物進(jìn)入囊泡并最終與周圍的OM一起被擠壓出去,從而產(chǎn)生OIMVs[10]。OIMVs包含DNA、RNA和ATP等細(xì)胞質(zhì)成分。不同細(xì)菌產(chǎn)生的OIMVs含量,在細(xì)菌分泌產(chǎn)生的總BEVs含量中所占的比例差異較大。如研究發(fā)現(xiàn),囊狀希瓦氏菌M7產(chǎn)生的OIMVs只占其總BEVs的大約0.1%,而海假交替單胞菌產(chǎn)生的OIMVs占其總BEVs的49%左右[11-12]。

1.1.2 EOMVs和EOIMVs 這兩種BEVs的生物發(fā)生機(jī)制是由于細(xì)菌DNA損傷應(yīng)激,誘導(dǎo)前噬菌體來(lái)源的內(nèi)溶素表達(dá),從而降解細(xì)菌肽聚糖層并破壞細(xì)胞壁,從而導(dǎo)致細(xì)菌爆炸,出現(xiàn)膜碎片聚集并自組裝形成EOMVs和EOIMVs[13-14]。EOMVs和EOIMVs也含有細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)成分和基因組DNA。研究發(fā)現(xiàn),囊狀希瓦氏菌M7在生長(zhǎng)指數(shù)后期到穩(wěn)定期階段,會(huì)產(chǎn)生EOMVs和EOIMVs,而且其EOIMVs通常具有不同尋常的結(jié)構(gòu),如在一個(gè)較大的囊泡內(nèi)有多個(gè)囊泡或不規(guī)則形狀的內(nèi)囊泡[15]。

1.2 G+菌的BEVs 研究證實(shí),G+菌在不同條件和自然環(huán)境下都會(huì)產(chǎn)生BEVs,大小在10～450 nm之間。G+菌的BEVs的發(fā)生機(jī)制類似于G-菌通過(guò)發(fā)生裂解產(chǎn)生BEVs的機(jī)制,是由缺陷前噬菌體編碼的內(nèi)溶素降解肽聚糖層,破壞細(xì)胞壁,導(dǎo)致菌體發(fā)生腫脹,細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物向外膨出而形成。所以,G+菌的BEVs,又常被稱為細(xì)胞質(zhì)膜囊泡(cytoplasmic membrance vesicles, CMVs)[16]。由于G+菌在此過(guò)程中并未完全解體,但細(xì)胞質(zhì)膜完整性的喪失可導(dǎo)致部分細(xì)菌死亡,因此這一機(jī)制又被稱為“起泡細(xì)胞死亡”。

1.3 特殊類型的BEVs 管狀膜結(jié)構(gòu)(tube-shaped membranous structures, TSMSs)是一種特殊類型的BEVs,又被稱為納米管、納米絲或納米顆粒。目前對(duì)于TSMSs的形成機(jī)制尚不完全明確,一般認(rèn)為T(mén)SMSs是由G-菌的OM或G+菌細(xì)胞質(zhì)膜的管狀突起而形成。結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的TSMSs是由OMVs串聯(lián)而形成[5]。部分細(xì)菌還可將串聯(lián)的OMVs進(jìn)一步融合形成納米管結(jié)構(gòu),如土拉弗朗西斯菌可在液體介質(zhì)中產(chǎn)生OMVs和TSMSs。OMVs與TSMSs之間還可以相互轉(zhuǎn)化,OMVs能夠串聯(lián)融合形成納米管,而納米管也可分解形成OMVs[17]。

2 BEVs的生物學(xué)功能

BEVs是細(xì)菌的一種特殊形式分泌[1-2],在細(xì)菌的自身調(diào)節(jié)和細(xì)菌—細(xì)菌之間相互作用中發(fā)揮著重要功能。但由于不同來(lái)源的BEVs含有的內(nèi)容物不同,因而也發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。

2.1 攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) BEVs內(nèi)含有水解酶,可催化降解環(huán)境中存在的蛋白質(zhì)和復(fù)合多糖,幫助細(xì)菌攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18]。此外,BEVs中還具有鐵載體、鋅載體、氨基酸和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等,從而促進(jìn)細(xì)菌對(duì)相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取。如結(jié)核分枝桿菌分泌的BEVs攜帶分枝菌素,可幫助結(jié)核分枝桿菌遠(yuǎn)距離獲取宿主中的鐵成分,促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)[19]。

2.2 防御作用 BEVs可通過(guò)環(huán)境耐受、抑制抗生素的殺菌作用、拮抗噬菌體的作用等多種機(jī)制增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的防御能力。其一,在應(yīng)激情況下,細(xì)菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)BEVs的產(chǎn)量和內(nèi)容物,以此緩解由錯(cuò)誤折疊蛋白、肽聚糖片段或脂多糖在周質(zhì)間隙積累而引起的膜應(yīng)激反應(yīng)[20]。如溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而引起細(xì)菌外膜流動(dòng)性增加,BEVs的分泌也隨之增加[21]。鐵缺乏、氧化應(yīng)激、酒精和鹽等環(huán)境刺激也均會(huì)影響B(tài)EVs的分泌[22]。其二,BEVs來(lái)源于細(xì)菌膜成分,可以保護(hù)細(xì)菌免受某些抗生素的侵害。研究證實(shí),在抗生素環(huán)境中,分泌BEVs的細(xì)菌比不分泌的細(xì)菌存活時(shí)間更長(zhǎng)。BEVs可通過(guò)結(jié)合、降解和排放等途徑作用進(jìn)入菌體中的抗生素,從而提高細(xì)菌對(duì)抗生素的防御力。如流感嗜血桿菌分泌的含β-內(nèi)酰胺酶的BEVs,能夠水解阿莫西林,保護(hù)A組鏈球菌免受阿莫西林的殺菌作用[23]。當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌處于亞抑菌濃度的左氧氟沙星環(huán)境時(shí),可以通過(guò)高外排泵的表達(dá)和BEVs的分泌,排出大量負(fù)載的抗生素囊泡,從而阻止抗生素的殺菌作用[24]。BEVs也可通過(guò)包裹的耐藥質(zhì)粒,將抗生素抗性基因水平傳遞到其他細(xì)菌,從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗生素的殺傷作用。如鮑氏不動(dòng)桿菌可通過(guò)OMVs將β-內(nèi)酰胺酶基因blaOXA-24傳遞給其陰性株,而使其獲得青霉素和頭孢類抗生素的抗性[25],從而增強(qiáng)鮑氏不動(dòng)桿菌群落細(xì)菌對(duì)抗生素的抵抗力。其三,BEVs既可作為靶標(biāo)吸引噬菌體的攻擊,又可作為將噬菌體傳遞給其他細(xì)菌的載體,進(jìn)而擴(kuò)大噬菌體的感染范圍[26]。如大腸埃希菌BEVs可結(jié)合并滅活大腸埃希菌特異性T4噬菌體,從而降低環(huán)境中噬菌體的細(xì)菌感染率[27]。

2.3 信號(hào)交流 BEVs可參與生物被膜的形成:細(xì)菌釋放BEVs時(shí),可導(dǎo)致細(xì)胞表面疏水性的增加,從而增強(qiáng)生物膜的形成,同時(shí)BEVs也可作為細(xì)胞外DNA的成核位點(diǎn)或者通過(guò)提供有益的蛋白如血紅素利用蛋白HmuY,促進(jìn)生物膜的形成[28]。研究發(fā)現(xiàn),幽門(mén)螺桿菌可被其分泌的BEVs誘導(dǎo)形成生物被膜,但具體機(jī)制尚不清楚。變異鏈球菌分泌的BEVs不僅可促進(jìn)其自身生物被膜的形成,而且還有利于白色念珠菌生物被膜的形成[29]。BEVs可傳遞、釋放毒力因子:G-菌分泌的BEVs中包含的大部分蛋白為酶、分子伴侶、毒力相關(guān)蛋白等毒力因子,且這些毒力因子在BEVs中的半衰期延長(zhǎng),因此BEVs在毒力因子的傳遞釋放中具有重要作用。研究表明,銅綠假單胞菌分泌的BEVs通過(guò)與宿主質(zhì)膜中的脂筏融合,可直接將β-內(nèi)酰胺酶、堿性磷酸酶、溶血磷脂酶C等多種毒力因子傳遞到宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi),影響宿主細(xì)胞的生物學(xué)功能,從而避免病原體和宿主細(xì)胞直接相互作用引起的細(xì)胞毒性作用[30]。此外,腸出血性大腸埃希菌分泌的BEVs,其包裹的溶血素比游離的溶血素更穩(wěn)定,前者半衰期長(zhǎng)達(dá)20 h,而后者半衰期僅15 min[31]。BEVs可提高細(xì)菌群體競(jìng)爭(zhēng)力:群體感應(yīng)是一種細(xì)菌間通訊機(jī)制,允許細(xì)菌相互交流,是許多病原菌毒力的重要驅(qū)動(dòng)力[32]。BEVs內(nèi)所含的特異性酶能夠區(qū)分自身菌和非自身菌,進(jìn)而靶向根除非自身菌,提高自身菌在環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)力。如銅綠假單胞菌分泌的BEVs通過(guò)遞送細(xì)胞壁蛋白水解酶降解肽聚糖而殺死競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌;嗜酸乳桿菌BEVs內(nèi)的細(xì)菌素可使德氏乳桿菌和大腸埃希菌的生長(zhǎng)受到抑制[33]。此外,共生菌特別是腸道微生物群可對(duì)宿主腸道進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),共生菌分泌的BEVs可以殺死競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌,影響競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素,改善腸上皮屏障的功能,保護(hù)生態(tài)位,促進(jìn)宿主免疫調(diào)節(jié),從而為其親本細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢(shì)[34]。另外還有研究發(fā)現(xiàn),在同一生態(tài)空間中的競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌還可分泌抗生素到BEVs內(nèi),選擇性地殺傷其他種屬的細(xì)菌。部分細(xì)菌可將糖苷酶和蛋白水解酶通過(guò)BEVs傳遞給競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌,將其殺滅以獲取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[35]。

3 BEVs對(duì)宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)

BEVs能夠介導(dǎo)細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間的相互作用,參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的功能,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前對(duì)BEVs調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能的研究主要集中于免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)細(xì)胞死亡和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生等過(guò)程。

3.1 調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞免疫功能 由于BEVs的特殊發(fā)生機(jī)制,通常會(huì)攜帶有病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)[36]。PAMPs可被宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)所識(shí)別,從而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)。如BEVs含有的脂多糖和脂寡糖能夠被TLR4所識(shí)別,肽聚糖能夠被核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白1 (NOD1)和2 (NOD2)受體識(shí)別,從而激活NF-κB通路,介導(dǎo)促炎反應(yīng)。BEVs含有的RNA可被宿主細(xì)胞的TLR7/TLR8所識(shí)別,激活NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-12等細(xì)胞因子的分泌[37-39]。另外,BEVs還可通過(guò)PAMPs激活宿主細(xì)胞的NLRP3、NLRC4和AIM2等炎癥小體,從而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[40]。

BEVs還可誘發(fā)宿主細(xì)胞產(chǎn)生超敏反應(yīng),或者誘導(dǎo)免疫逃逸。Krisana A等[41]研究發(fā)現(xiàn),耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分泌的BEVs能夠刺激小鼠體內(nèi)IL-4、IL-5、IL-6等Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,并導(dǎo)致小鼠發(fā)生過(guò)敏性休克,這表明BEVs可引發(fā)IgE介導(dǎo)的全身性超敏反應(yīng)。鼠傷寒沙門(mén)菌分泌的BEVs攜帶PagC蛋白,可通過(guò)募集補(bǔ)體抑制因子H使C3b失活,從而逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷[42]。

3.2 誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡 BEVs可通過(guò)觸發(fā)炎癥小體的形成,激活焦亡效應(yīng)分子GSDMD,從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[43-44]。腸出血性大腸埃希菌分泌的BEVs可通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞,其表面的脂多糖能夠與宿主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的caspase-11結(jié)合,從而直接激活GSDMD,活化的GSDMD可在宿主細(xì)胞膜上成孔,促進(jìn)IL-1β和IL-18的分泌,導(dǎo)致宿主細(xì)胞焦亡[45]。BEVs也可通過(guò)直接影響線粒體的完整性或釋放毒力因子以及減少促生存蛋白的合成等途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[46]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌分泌的BEVs被宿主細(xì)胞內(nèi)化后,其內(nèi)的OmpA和Omp38可特異性地定位于線粒體,損害線粒體膜完整性,從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞凋亡[47]。淋病奈瑟菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌分泌的BEVs能以非特異性的方式降低線粒體膜電位,并通過(guò)激活BAX和BAK蛋白、減少促生存蛋白BCL-2的合成來(lái)激活細(xì)胞凋亡[48]。

3.3 誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生 細(xì)菌在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮作用是目前研究的一個(gè)方向,但其作用機(jī)制還不完全清楚。目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),BEVs傳遞的毒力因子能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞系基因組的損傷。例如,Kim DJ等[49]發(fā)現(xiàn),糞腸球菌和大腸埃希菌分泌的BEVs可能含有外毒素,且可以產(chǎn)生靶向宿主細(xì)胞DNA的自由基,導(dǎo)致宿主細(xì)胞染色體不穩(wěn)定,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。TurkinaMV等[50]發(fā)現(xiàn),幽門(mén)螺桿菌分泌的BEVs攜帶CagA蛋白,可增加ATP對(duì)染色體中H1組蛋白的親和力,導(dǎo)致基因組損傷,誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。另外,BEVs攜帶的msRNA和sRNA可抑制宿主細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯,或促進(jìn)mRNA衰減,從而參與宿主細(xì)胞腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)[51]。

4 展 望

BEVs作為細(xì)菌的一種特殊分泌形式,其在細(xì)菌自身的調(diào)節(jié)、細(xì)菌-細(xì)菌之間和細(xì)菌-宿主細(xì)胞之間相互作用中,均發(fā)揮著重要的功能。因此,目前在研究BEVs生物發(fā)生機(jī)制和生物學(xué)功能的基礎(chǔ)上,對(duì)于BEVs在細(xì)菌致病機(jī)制中的作用研究也越來(lái)越受到重視,成為BEVs研究的一個(gè)重要方向。此外,由于BEVs具有特殊的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成,將BEVs作為新型疫苗和藥物遞送載體以及佐劑等的研究也正成為BEVs研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。相信隨著對(duì)BEVs的不斷探索,未來(lái)我們將對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、進(jìn)化和環(huán)境耐受等方面會(huì)有更深的認(rèn)知,對(duì)細(xì)菌的致病機(jī)制和耐藥性等方面也會(huì)不斷有新的發(fā)現(xiàn),而且隨著對(duì)BEVs臨床應(yīng)用的探索,也將加快疫苗和藥物載體的研發(fā)。BEVs的研究將為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展開(kāi)辟一個(gè)全新的方向。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：郭金榮,雍浩蕾,賀雅寧,等.細(xì)菌外囊泡的研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2024,40(2):191-196. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.023