福建省36株人源豬鏈球菌分離株病原學(xué)特征分析

梁雪晨,高亞東,李曲文,,3

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原菌,最早報(bào)道于1954年,1968年在丹麥報(bào)告首例人感染豬鏈球菌病例[1]。豬鏈球菌宿主存在多樣性,主要宿主是豬,定植部位為豬的上呼吸道。人感染豬鏈球菌的主要途徑是呼吸道和接觸,例如通過破損的傷口、黏膜、消化道、鼻咽腔等。感染豬鏈球菌會(huì)引起化膿性關(guān)節(jié)炎、聽力喪失、敗血癥等疾病,甚至威脅生命。根據(jù)莢膜多糖抗原差異,將豬鏈球菌分為29個(gè)血清型,為1-19、21、23-25、27-31和1/2[2]。其中1型、1/2型、2型、7型、9型和14型為引起豬鏈球菌病的主要血清型。1998年和2005年2次疫情暴發(fā),均為豬鏈球菌2型[3]。豬鏈球菌發(fā)病率與致病性和其數(shù)量無關(guān),而與其毒力因子相關(guān)。豬鏈球菌毒力因子眾多,根據(jù)其攜帶毒力因子的不同,被分為高致病性毒株、低致病性毒株和無致病性毒株[4]。常用多位點(diǎn)序列分析分型(Multi-locus sequencing typing,MLST)測定細(xì)菌的多個(gè)管家基因獲得菌株的序列型(sequence type,ST)對其進(jìn)行分類。隨著高通量測序成本的降低,全基因組測序技術(shù)廣泛運(yùn)用于分析豬鏈球菌的流行病學(xué)、致病性、耐藥性以及進(jìn)化等研究。豬鏈球菌血清型眾多,疫苗防治效果不理想,養(yǎng)殖場常在飼料中添加抗生素進(jìn)行預(yù)防。抗生素的濫用導(dǎo)致豬鏈球菌產(chǎn)生了耐藥性,甚至出現(xiàn)多重耐藥菌株[5],因此調(diào)查和分析豬鏈球菌的耐藥性與耐藥基因不僅對臨床治療豬鏈球菌感染引起的相關(guān)疾病有極大幫助,還有助于新型抗菌藥物的研發(fā)。自2005-2023年期間,福建地區(qū)共報(bào)告了36例人感染豬鏈球菌的病例。為了解福建省人源豬鏈球菌分離株毒力基因、耐藥情況,進(jìn)行了全基因組分析、藥敏試驗(yàn)等研究,以了解福建流行菌株的病原特征,對福建地區(qū)的豬鏈球菌防控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 福建省2005-2023年分離自人的豬鏈球菌分離株,共計(jì)36株(菌株標(biāo)號為1-36號,見表1),均通過PCR、質(zhì)譜、生化鑒定為豬鏈球菌。

表1 福建省人源豬鏈球菌信息表

1.2 主要儀器設(shè)備 熒光PCR儀購自中國杭州博日科技股份有限公司;常規(guī)PCR儀購自美國ABI有限公司;全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測儀購自BRUKER公司;鏈球菌藥敏試劑板DL-96STR MIC購自珠海迪爾生物工程股份有限公司;豬鏈球菌熒光PCR核酸檢測試劑盒購自深圳生科原有限公司;血瓊脂平板購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌株的復(fù)蘇 將實(shí)驗(yàn)室保存的36株豬鏈球菌菌株分別劃線接種于血瓊脂平板上,放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

1.3.2 DNA提取 使用凱杰基因組試劑盒,參照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組,用于毒力、耐藥、基因組測定等實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 毒力因子檢測 選擇豬鏈球菌主要的毒力基因(mrp、sly、epf、gdh、fpbs、gapdh)進(jìn)行 PCR 檢測,參考文獻(xiàn)[6]合成引物。引物由生工生物工程股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系(23 μL):模板 DNA 3.0 μL,上、下游引物各 0.5 μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 6.5 μL。PCR 反應(yīng)結(jié)束后,取 5 μL 產(chǎn)物進(jìn)行 1.2%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 全基因組測序 由上海生工生物工程股份有限公司有限公司進(jìn)行細(xì)菌基因組框架圖測序。使用Illumina Hiseq進(jìn)行基因組二代測序,對測序的原始數(shù)據(jù)通過FastQC進(jìn)行質(zhì)量評估,使用SPAdes拼接二代測序數(shù)據(jù),拼接的序列用于后續(xù)分析。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏實(shí)驗(yàn)按照鏈球菌藥敏試劑盒微量肉湯稀釋法(MIC法)說明書進(jìn)行,質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。耐藥折點(diǎn)值參考2020版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)藥敏實(shí)驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)中肺炎鏈球菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6 耐藥基因及耐藥基因預(yù)測 使用CARD網(wǎng)站預(yù)測菌株可能攜帶的林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氯霉素類等耐藥基因,并通過ICEfinder網(wǎng)站預(yù)測可能含有的ICE。

1.3.7 多位點(diǎn)序列分型 將全基因組序列結(jié)果在PubMLST網(wǎng)站進(jìn)行7個(gè)管家基因(mutS、recA、aroA、cpn60、thrA、dpr、gki)及序列ST型查詢。將全基因組測序數(shù)據(jù)上傳至BacWGSTdb網(wǎng)站繪制SNP進(jìn)化樹(參考菌株A7_CP002570_ST7)。使用iTOL(https://itol.embl.de/)對進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2013軟件錄入實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果和全基因組分析數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 毒力基因檢測 通過PCR對36株豬鏈球菌分離株mrp、sly、epf、gdh、fpbs、gapdh毒力基因進(jìn)行了檢測,其攜帶率分別為55.6%、80.6%、86.1%、100%、100%、100%。sly+epf+mrp+為優(yōu)勢毒力基因型,共15株,占47.1%,其次為sly+epf+mrp-毒力基因型,共10株,占27.8%,sly-epf+mrp-毒力基因型共4株,sly+epf-mrp-、sly-epf+mrp+與sly+epf-mrp+毒力基因型各2株,sly-epf-mrp+毒力基因型1株。

2.2 MLST分型及毒力基因攜帶模式 36株豬鏈球菌的MLST分析結(jié)果顯示,有5種不同的ST型,其中以ST1型58.3%(21/36)與ST7型30.6%(11/36)最為常見。

36株豬鏈球菌分離株ST型與血清型和毒力基因型的關(guān)系見表2,ST1主要毒力基因型為sly+epf+mrp-與sly+epf+mrp+;ST7主要毒力基因型為sly+epf+mrp+;ST25毒力基因型是sly-epf-mrp+與sly-epf+mrp-。

表2 豬鏈球菌ST型與血清型和毒力基因型分布

2.3 耐藥表型及基因型 36株藥敏結(jié)果顯示:對四環(huán)素的耐藥率高達(dá)100%(36/36),紅霉素83.3%(30/36)、克林霉素83.3%(30/36),復(fù)方新諾明耐藥率55.6%(20/36),氯霉素11.1%(4/36),頭孢噻肟、美羅培南、頭孢吡肟、萬古霉素、青霉素均為2.8%(1/36)。36株豬鏈球菌中7重耐藥菌株有1株,占比2.8%(1/36),5重耐藥菌株有2株,占比5.6%(2/36),4重耐藥菌株有17株,占比47.2%(17/36),3重耐藥菌株有10株,占比27.8%(10/36),2重耐藥菌株有2株,占比5.6%(2/36),耐1種藥物的菌株4株,占比11.1%(4/36)。其中最常見的是4重耐藥,具有兩種耐藥模式:四環(huán)素+紅霉素+克林霉素+復(fù)方新諾明(14株);四環(huán)素+紅霉素+克林霉素+氯霉素(2株),見表3。

表3 豬鏈球菌耐藥情況

對四環(huán)素耐藥基因(tet40、tetB、tetE、tetL、tetM、tetO)、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(mefA、ermA、ermB)、氨基糖苷類耐藥基因(acc(6′)-aph(2″)、ant(6)-Ia、ant(9)-Ia、aph(3′)-III)、葉酸通道拮抗劑耐藥基(dfrG)、惡唑烷酮類耐藥基因(optrA)、氯霉素類耐藥基因(cat、FloR、cmlA)進(jìn)行預(yù)測,不同菌株攜帶耐藥基因種類也不同,最常見的是cmlA(31株,86.1%),其次是ermB(30株,83.3%)、tetL(30株,83.3%)、tetE(27株,75%)、tetB(25株,69.4%)、tetM(21株,58.3%)、FloR(20株,55.6%)、tetO(19株,52.8%)和dfrG(19株,52.8%)等。同時(shí)結(jié)合耐藥基因及SNP進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示,36株菌株可分為4個(gè)進(jìn)化譜系,其中譜系1包括15株(41.7%)均為ST1型,譜系2中2株為ST25和1株ST2249;譜系3中6株ST1型和2株ST7型;譜系4中9株ST7型和1株ST1711型,見圖1。

注:用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹,黑色填充表示存在參數(shù)。

3 討 論

豬鏈球菌是一種人獸共患病病原體,人可通過破損的傷口接觸而感染。本研究通過全基因組測序和抗生素敏感性實(shí)驗(yàn),分析了福建省近18年分離到的36株人源豬鏈球菌的毒力、耐藥和分子流行病學(xué)特征。血清2型被認(rèn)為是最致命的血清型,曾在中國造成了兩次大規(guī)模的人類疫情和大量的豬死亡[7-8]。血清型3、7和9在許多國家也廣泛傳播。本研究的豬鏈球菌分離株中,血清型2(97.2%)最常見,與現(xiàn)有報(bào)道一致[9]。

豬鏈球菌的毒力因子與致病力之間的作用機(jī)理還未明確,但兩者之間存在密切聯(lián)系。豬鏈球菌根據(jù)毒力基因不同分為強(qiáng)毒株、弱毒株和無毒株[10]。sly、epf、mrp是血清型2菌株的常用毒力指標(biāo)[1,12],本研究中豬鏈球菌的毒力基因攜帶情況,其中以sly+epf+mrp+有15株,占比41.7%,為最主要毒力基因攜帶型別,表明我省人感染分離株多為強(qiáng)毒株。多位點(diǎn)序列分型(MLST)是通過測定核酸序列來對細(xì)菌進(jìn)行分型的方法,豬鏈球菌的MLST分型已經(jīng)有1 000多種。根據(jù)報(bào)道,在我國主要流行的MLST分型主要為ST1和ST7型,本研究通過全基因組測序并上傳到pubMLST網(wǎng)站進(jìn)行分型,發(fā)現(xiàn)福建省近18年分離到的人感染豬鏈球菌多為ST1型(58.3%),與文獻(xiàn)中報(bào)道的豬鏈球菌易感染人主要是血清2型的ST1為主的結(jié)論相一致[13]。

2017-2019年中國臨床分離到的豬鏈球菌大多對克林霉素(96.26%)、四環(huán)素(92.52%)和紅霉素(67.29%)耐藥[14-15]。本研究中我們檢測了36株豬鏈球菌對15種抗生素藥物的敏感性,所有分離株至少對一類抗生素耐藥,其中,36株均對四環(huán)素耐藥,對紅霉素和克林霉素也發(fā)現(xiàn)具有較高的耐藥率,而對替考拉寧、阿莫西林、左氧氟沙星、青霉素、萬古霉素、莫西沙星、利奈唑胺敏感,與其他地區(qū)研究結(jié)果類似[16]。研究發(fā)現(xiàn)福建省的分離株中林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類耐藥基因的攜帶率較高?？股卦谑称穭?dòng)物養(yǎng)殖過程中不僅用于預(yù)防控制和治療病原菌感染,也常作為生長促進(jìn)因子,增加肉的產(chǎn)量。據(jù)報(bào)道,在所有抗生素中,四環(huán)素是豬生產(chǎn)中使用最廣泛的,很多研究也報(bào)道了中國養(yǎng)豬場使用磺胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和β類酰胺類抗生素[17-18]。這導(dǎo)致豬鏈球菌對四環(huán)素、紅霉素和克林霉素耐藥率高,提示應(yīng)及時(shí)調(diào)整抗生素治療策略,合理使用抗生素,避免產(chǎn)生耐藥性。而青霉素、萬古霉素、利奈唑胺屬于人常用藥物,一般很少獸用,因此幾乎所有的菌株都對這幾種抗生素敏感,但近些年也有許多研究發(fā)現(xiàn)有攜帶利奈唑胺耐藥基因的菌株其表現(xiàn)對利奈唑胺及氟苯尼考等耐藥[19]。

對36株豬鏈球菌的耐藥基因進(jìn)行了預(yù)測,發(fā)現(xiàn)福建省的人感染豬鏈球菌分離株普遍存在耐藥基因,且菌株攜帶耐藥基因型與其耐藥表型一致。其中氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類耐藥基因的攜帶率較高,這可能與這些抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用有關(guān),使耐藥基因發(fā)生選擇和擴(kuò)散。同時(shí)通過ICEfinder網(wǎng)站對菌株分析發(fā)現(xiàn)本研究中的36株有15株含有整合性接合元件 (Integrative and conjugative element, ICE),還需進(jìn)一步對該類菌株研究,以防攜帶這些元件菌株成為耐藥性傳播的重要載體。

綜上所述,本研究揭示了福建省人感染豬鏈球菌菌株的毒力、耐藥和部分基因組特征具有一定的地域性特征。應(yīng)加強(qiáng)對福建省各地區(qū)豬鏈球菌的監(jiān)測,加大對相關(guān)從業(yè)人員的健康教育,防止人感染豬鏈球菌病的暴發(fā)。

利益沖突：無

引用本文格式：梁雪晨,高亞東,李曲文.福建省36株人源豬鏈球菌分離株病原學(xué)特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2024,40(2):161-165,170. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.026