常見肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)差異分析及主動(dòng)靶向載體效率比較

張效瑋, 王興芝, 王永安, 全東琴, 申遼

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所, 北京 100850)

肝癌病程發(fā)展快,死亡率高,是中國(guó)最常見的惡性腫瘤之一[1]。由于肝癌發(fā)病隱匿,多數(shù)患者確診即處于中晚期,無法進(jìn)行手術(shù)切除,因此僅能接受射頻消融、介入栓塞或系統(tǒng)性化學(xué)藥物等治療[2-3]。然而,在臨床實(shí)踐中,化療藥物治療效果不甚理想,存在耐藥、副作用大等問題,且治療后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高,五年生存期不足15%[4]。因此,肝癌的臨床治療仍是頗具挑戰(zhàn)性的難題。

納米藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展有望解決上述問題。通過特定材料對(duì)藥物所包載形成的納米結(jié)構(gòu),能夠改善原有藥物的不足,達(dá)到如延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期,增加生物利用度,靶向腫瘤組織等目的[5-6]。其中,表面修飾主動(dòng)靶向型納米載體備因可設(shè)計(jì)性強(qiáng)、發(fā)展?jié)摿Υ蠖鴤涫荜P(guān)注[7]。主動(dòng)靶向納米遞藥系統(tǒng)常被比喻為“精確制導(dǎo)導(dǎo)彈”,該系統(tǒng)根據(jù)腫瘤部位進(jìn)行針對(duì)性設(shè)計(jì),將可與腫瘤細(xì)胞相互作用的分子通過共價(jià)鍵等方式修飾于納米顆粒的表面,使載體與腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合,經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等過程將藥物遞送至腫瘤內(nèi)部,達(dá)到增效減毒的目的[7-8]。

目標(biāo)靶點(diǎn)的選擇是主動(dòng)靶向載體設(shè)計(jì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。據(jù)報(bào)道,肝癌細(xì)胞表面存在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、葉酸受體、表皮生長(zhǎng)因子受體等特異性表達(dá)或過表達(dá)的現(xiàn)象[9-11]。其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TfR1)由于能夠介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用,有利于癌細(xì)胞高效攝取納米粒,是最為常用的納米載體遞送靶點(diǎn)之一[10, 12]。在科學(xué)研究中,研究人員通常使用肝癌細(xì)胞系建立體外及動(dòng)物水平模型,評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體靶向載體的遞送效率及抗腫瘤作用[13-14]。然而目前肝癌細(xì)胞系種類繁多,來源差異導(dǎo)致細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)情況也存在一定差距[15-16]。但目前尚未有研究報(bào)道比較不同肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)情況,不利于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)納米載體的靶向性以及腫瘤治療效果。

現(xiàn)選取4種常見的肝癌細(xì)胞系,從基因表達(dá)層面、蛋白質(zhì)表達(dá)層面對(duì)不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比研究。同時(shí),分別選擇重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tf)以及轉(zhuǎn)鐵蛋白核酸適配體(transferrin nucleic acid aptamer,Tf-APT)作為靶向分子,考察其在不同細(xì)胞系中的靶向結(jié)合效率。研究結(jié)果可為針對(duì)肝癌的納米藥物載體研究提供相關(guān)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

人肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、MHCC97-H、Huh-1,浙江美森細(xì)胞科技有限公司;Cy3標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白(Cy3-transferrin,Cy3-Tf),西安昊然生物科技有限公司;Cy5標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白核酸適配體(Cy5-transferrin nucleic acid aptamer,Cy5-Tf-APT,序列Cy5-TTTTTTTTTTTTTTTGCGTGGTACCACGC-inverted dT),蘇州貝信生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),DMEM培養(yǎng)基,美國(guó)Gibco公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),武漢賽維爾生物科技有限公司;Transfer Buffer(25 mmol/L Tris base, 0.2 mol/L glycine, 20% methanol pH 8.5),北京希諾因子科技有限公司;SDS Sample Buffer (1×)(62.5 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8 at 25 ℃), 2% SDS, 10% glycine, 50 mmol/L DTT, 0.1% bromophenol blue)北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司;Blocking Buffer(1×TBS, 0.1% Tween-20, 5% nonfat dry milk)上海碧云天生物技術(shù)有限公司;10×TBS( Tris-buffered saline)北京希諾因子科技有限公司;Wash Buffer (TBST)北京希諾因子科技有限公司;5×TGS(SDS-PAGE Electrode Buffer),北京博泰斯生物技術(shù)有限公司;SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates,北京安諾倫生物科技有限公司;M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent,北京安諾倫生物科技有限公司;PVDF Transfer Membrane,美國(guó)Millipore公司;Anti-Transferrin Receptor antibody(EPR20584), 艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司; 小鼠抗β-actin單克隆抗體(30101ES50), Preoxidase-conjugated goat anti-Rabbit IgG(P16726), Preoxidase-conjugated goat anti-Mouse IgG(P07141), 上海翌圣生物科技股份有限公司;PowerPacTMHC電泳儀,美國(guó)bio-rad公司;VE-180垂直電泳槽,上海天能科技有限公司;VE-386半干轉(zhuǎn)膜儀,上海天能科技有限公司;DY-B1脫色搖床,上海滬西儀器廠有限公司;KODAK X-Omat BT Film,伊士曼柯達(dá)公司;濾紙 (3MM),英國(guó)whatman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞均使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基 (含100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin)進(jìn)行培養(yǎng),在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)( 37 ℃、5% CO2、飽和濕度) 中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)、傳代。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)(RT-PCR)細(xì)胞中TfR1表達(dá)

培養(yǎng)HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細(xì)胞,待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,將各細(xì)胞樣本收集,使用TRLzol法進(jìn)行總RNA提取,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中TfR1的mRNA表達(dá)水平,使用GAPDH作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件為95 ℃, 3 min,變性;95 ℃, 12 s, 62 ℃, 40 s,40個(gè)循環(huán),在每個(gè)循環(huán)延伸末端點(diǎn)收集熒光信號(hào),繪制擴(kuò)增曲線并計(jì)算。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物合成Table 1 Primer synthesis

1.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)TfR1細(xì)胞中表達(dá)

培養(yǎng)HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細(xì)胞,待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,細(xì)胞中TfR1表達(dá)情況,以β-actin蛋白作為內(nèi)參照蛋白。實(shí)驗(yàn)操作:使用 PBS 洗滌細(xì)胞3 次至除去培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液(RIPA∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1,體積比),冰上裂解10 min后收集至離心管中。將樣品在12 000 g、4 ℃條件下離心5 min,小心收集上清液。樣品通過10% SDS-PAGE分離后,使用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(100 mA,時(shí)間40 min)。使用封閉液處理60 min,加入一抗并置于4 ℃過夜后,加入二抗并置于室溫孵育120 min。使用ECL試劑盒進(jìn)行條帶顯影,并進(jìn)行圖像分析。

1.5 轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向結(jié)合效率測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2等肝癌細(xì)胞接種至6孔板中,細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)/孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后,將培養(yǎng)基更換為含有Cy3-Tf的PBS溶液(Cy3-Tf終濃度為100 μg/mL)。37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h后,使用新鮮PBS沖洗,除去未結(jié)合的Cy3-Tf,并通過高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞熒光強(qiáng)度值。

1.6 轉(zhuǎn)鐵蛋白核酸適配體靶向結(jié)合效率測(cè)定

培養(yǎng)HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細(xì)胞,待其增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分別接種至6孔板中,接種密度3 × 105個(gè)/孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后,將培養(yǎng)基更換為2 mL含有Cy5-Tf-APT的PBS溶液(Cy5-Tf-APT終濃度為0.3 OD/mL)并混合均勻,于37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,使用新鮮PBS沖洗,除去未結(jié)合的Cy5-Tf-APT,并使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞熒光強(qiáng)度值。

1.7 CCK-8法測(cè)定Cy3-Tf、Cy5-Tf-APT細(xì)胞毒性

培養(yǎng)HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細(xì)胞,待其增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分別接種至96孔板中,接種密度5 × 103個(gè)/孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后,將Cy3-Tf或Cy5-Tf-APT添加至各孔中并混合均勻。孵育2 h后,各孔更換新鮮完全培養(yǎng)基,于37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h,使用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.8 載紫杉醇轉(zhuǎn)鐵蛋白受體靶向脂質(zhì)體的制備

使用乙醇注入-薄膜擠出法制備空白脂質(zhì)體(LP)、包載紫衫醇的普通脂質(zhì)體(PTX-LP)以及表面修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白的靶向脂質(zhì)體(Tf-PTX-LP)。制備方法:定量稱量蛋黃卵磷脂、DSPE-PEG2000-Tf(LP、PTX-LP組不添加)及紫杉醇(LP組不添加),完全溶解于乙醇后,緩慢滴入純化水中并充分渦旋混勻,進(jìn)一步稀釋后得到初步貯備液;使用薄膜擠出儀處理貯備液,得到紫杉醇脂質(zhì)體。使用激光粒徑粒度分析儀測(cè)定其平均粒徑以及Zeta電位;通過高效液相色譜法測(cè)定脂質(zhì)體中紫杉醇含量。

1.9 載紫杉醇轉(zhuǎn)鐵蛋白受體靶向脂質(zhì)體的體外抗腫瘤作用

培養(yǎng)HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1細(xì)胞,待其增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分別接種至96孔板中,接種密度5 × 103個(gè)/孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后,各孔更換新鮮培養(yǎng)基并分別添加PBS、LP、PTX-LP以及Tf-PTX-LP。除PBS組外,LP、PTX-LP以及Tf-PTX-LP組添加總脂質(zhì)量相同,均為1.0 mg/mL; PTX終濃度均為2.0 μg/mL。于37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。使用CCK-8試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞存活率,計(jì)算Tf-PTX-LP組的細(xì)胞相對(duì)靶向存活率,計(jì)算公式為

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism9進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多個(gè)不同處理組組內(nèi)、組間計(jì)量資料的比較應(yīng)用單因素方差分析。取雙側(cè)為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝癌細(xì)胞中TfR1表達(dá)水平差異

RT-PCR測(cè)定結(jié)果結(jié)果見圖1(以HepG2為參比)。從mRNA表達(dá)水平來看,不同肝癌細(xì)胞系TfR1的表達(dá)存在顯著性差異,其中Huh-1細(xì)胞及Hep3B細(xì)胞表達(dá)水平較高,HepG2及MHCC97-H細(xì)胞表達(dá)水平較低。TfR1蛋白表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見圖2(參比蛋白β-actin)。TfR1蛋白在細(xì)胞中的實(shí)際表達(dá)情況趨勢(shì)與其對(duì)應(yīng)mRNA表達(dá)水平具有相似性,但也存在一定的差異。其中,Huh-1細(xì)胞中TfR1蛋白表達(dá)量最高,與RT-PCR定量結(jié)果一致;但是HepG2及Hep3B細(xì)胞中TfR1蛋白表達(dá)量偏低。

樣本數(shù)n=3,*表示P <0.05圖1 不同肝癌細(xì)胞系TfR1 mRNA表達(dá)水平Fig.1 TfR1 mRNA expression in different hepatoma cell lines

2.2 Tf以及Tf-APT的靶向結(jié)合效率及細(xì)胞毒性

本節(jié)分別測(cè)定了Tf以及Tf-APT對(duì)不同肝癌細(xì)胞的靶向結(jié)合效率。Tf以及Tf-APT與各細(xì)胞系的靶向結(jié)合效率與其轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)水平存在相關(guān)性,測(cè)定結(jié)果見圖3。其中Huh-1的平均熒光強(qiáng)度最強(qiáng),靶向結(jié)合效率最高;HepG2、MHCC97-H、Hep3B次之,靶向結(jié)合效率相較更弱。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)Tf及Tf-APT未產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性,不會(huì)影響細(xì)胞的活力[圖4(a)、圖4(b)]。

樣本數(shù)n=6, *表示P <0.05圖4 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The results of in vitro cytotoxicity

2.3 紫杉醇脂質(zhì)體的制備體外表征

從表2可知,LP以及PTX-LP粒徑約為40 nm,聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)為0.220,粒徑分布較均為均一且Zeta電位為-8.42±1.20, 說明脂質(zhì)體表面攜帶負(fù)電荷;Tf-PTX-LP表面通過共價(jià)鍵修飾了Tf蛋白,因此粒徑有所增大,平均粒徑約為50 nm,Zeta電位為-15.37 ± 0.96,表面所攜帶負(fù)電荷較PTX-LP更多。HPLC含量測(cè)定結(jié)果表明,PTX-LP和Tf-PTX-LP的藥物含量一致,均為20 μg/mL左右。

表2 紫杉醇脂質(zhì)體體外表征結(jié)果(n=3)Table 2 Results of in vitro characterization of paclitaxel liposomes(n=3)

2.4 體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制評(píng)價(jià)

由于不同細(xì)胞系對(duì)于抗腫瘤藥物的敏感性存在差異,因此以靶向組(Tf-PTX-LP)與非靶向組(PTX-LP)的細(xì)胞增值率比值計(jì)算相對(duì)細(xì)胞增殖率,用于分析比較靶向基團(tuán)的引入對(duì)不同肝癌細(xì)胞抑制能力差異。圖4(c)、圖4(d)顯示,Huh-1細(xì)胞系對(duì)于Tf靶向納米粒的敏感性較高,細(xì)胞增殖率最低;HepG2、Hep3B、MHCC97-H細(xì)胞次之,對(duì)于Tf靶向納米粒的敏感性相對(duì)較弱。PBS組及LP組未顯示出生長(zhǎng)抑制作用,表明納米材料對(duì)細(xì)胞無細(xì)胞毒性。

3 討論

TfR1可通過受體介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞對(duì)靶向結(jié)合的納米粒子進(jìn)行攝取,此過程已在多年的研究中得到確證。因此,基于TfR1靶向的納米載體成為了研究最為廣泛且最具希望的主動(dòng)靶向型納米藥物遞送系統(tǒng)之一。其中,由于肝癌細(xì)胞表面存在TfR1高表達(dá)的現(xiàn)象,許多研究者的目光投向了這一靶點(diǎn),以期通過主動(dòng)靶向作用,增加腫瘤部位的藥物分布,強(qiáng)化抗腫瘤治療效果的同時(shí)減輕藥物的不良反應(yīng)。然而,肝癌患者個(gè)體情況差異較大,同時(shí)癌癥成因也較為復(fù)雜,如感染慢性病毒性肝炎(尤其是慢性乙型病毒性肝炎)或攝入黃曲霉毒素等。因此,肝癌在基因?qū)用娌町愶@然不容忽視。而這一差異很可能會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平的不同,因此TfR1在肝癌細(xì)胞中的實(shí)際表達(dá)情況仍值得探討。

體外抗腫瘤作用是基于TfR1靶點(diǎn)納米載體的重要研究部分,如靶向結(jié)合能力評(píng)價(jià)等。因此,有必要對(duì)常用的細(xì)胞系TfR1表達(dá)情況進(jìn)行探討。本研究選取了4種研究中常用的肝癌細(xì)胞系,其詳細(xì)信息見表3,實(shí)驗(yàn)流程示意圖如圖5所示。通過對(duì)各個(gè)細(xì)胞系mRNA水平以及蛋白表達(dá)水平的分析,各細(xì)胞系之間的TfR1表達(dá)存在一定的差異。從mRNA表達(dá)水平表達(dá)來看,各組均存在TfR1表達(dá),且Huh-1及Hep3B細(xì)胞系表達(dá)較其他細(xì)胞系高;TfR1蛋白表達(dá)WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然總體趨勢(shì)與mRNA表達(dá)水平相近,僅Huh-1細(xì)胞系表達(dá)水平較高,但實(shí)際分析結(jié)果存在一定程度的差異,這可能是由于細(xì)胞內(nèi)存在其他調(diào)節(jié)機(jī)制所導(dǎo)致的。因此,僅憑借RT-PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定mRNA表達(dá)水平進(jìn)而推定實(shí)際TfR1蛋白表達(dá)情況,仍存在一定偏差。

圖5 實(shí)驗(yàn)流程示意圖Fig.5 Schematic diagram of the experiments

表3 肝癌細(xì)胞系的詳細(xì)信息Table 3 Details of the five hepatoma cell lines

本研究分別考察了轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)以及轉(zhuǎn)鐵蛋白核酸適配體(Tf-APT)對(duì)上述幾種肝癌細(xì)胞的靶向親和能力。Tf和Tf-APT是TfR1的親和配體,將其通過共價(jià)鍵修飾于納米載體表面,是制備轉(zhuǎn)鐵蛋白受體靶向藥物遞送系統(tǒng)的常見手段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Tf和Tf-APT的靶向親和程度與細(xì)胞系所表達(dá)的TfR1水平呈現(xiàn)正相關(guān)性,因此理論上不同的細(xì)胞系對(duì)TfR1靶向納米載體的敏感性也存在一定區(qū)別。因此,本研究制備了表面修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體,并包載抗腫瘤化療藥物紫衫醇作為模型藥物,進(jìn)一步考察其對(duì)不同細(xì)胞系間細(xì)胞毒性的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Tf的靶向親和性趨勢(shì)一致,即Tf-PTX-LP對(duì)于親和程度較高的Huh-1細(xì)胞系相對(duì)靶向存活率更低,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用更為明顯。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明,不同肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達(dá)水平存在明顯的差異,并且這一差異直接影響了針對(duì)該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的主動(dòng)靶向載體的結(jié)合、遞送效率。目前,多數(shù)研究?jī)H選擇一種體外細(xì)胞模型對(duì)靶向納米載體進(jìn)行評(píng)價(jià)。建議在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中,應(yīng)對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行充分的研究,從mRNA及蛋白表達(dá)水平初步判斷體外模型合理性,并適當(dāng)選擇兩種或以上的細(xì)胞系作為評(píng)價(jià)模型,以便更為充分地探究納米載體的靶向性能,獲得更多有益于研究及產(chǎn)品研發(fā)的信息。