粒細胞胞外陷阱在老年髖部骨折肺炎中的診斷意義△

梁健軍，陳建民，劉國印*

（1.岱山縣人民醫(yī)院骨科，浙江舟山 316261；2.南京醫(yī)科大學金陵臨床醫(yī)學院骨科，江蘇南京 210000）

髖部骨折是老年人群常見的骨折之一，發(fā)病率逐年上升［1，2］。手術治療是髖部骨折的首選治療方案，但老年患者術后并發(fā)癥發(fā)生率較高［3］。肺炎是老年髖部骨折患者術后常見的并發(fā)癥之一，與術后病死率增加密切相關［4］。免疫功能紊亂是發(fā)生肺部感染的重要因素之一［5］。中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps,NETs）是中性粒細胞在刺激狀態(tài)下，染色質解凝所形成的，富含抗菌蛋白（包含彈性蛋白酶和髓過氧化酶等）和DNA 的復雜網狀物質，可誘捕并殺滅入侵體內的病原微生物。自從Brinkmann 在2004 首次發(fā)現NETs 后，大量研究揭示NETs 在膿毒癥、類風濕關節(jié)炎及腫瘤轉移中扮演重要作用［6～8］。近年研究表明，NETs 生成與肺部感染的臨床預后密切相關［9］。但尚未見有關NETs 生成在老年髖部骨折患者術后肺炎中的研究報道。本研究旨在分析術后前3 d 老年髖部骨折患者外周血中NETs 生成量的情況，探討NETs 生成與術后肺炎的關系。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1）年齡＞65 周歲；（2）經X 線檢查診斷為髖部骨折；（3）新鮮初次髖部骨折；（4）肺炎診斷標準參照中華醫(yī)學會呼吸病學分會2018 年制定的《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南》中有關院內獲得性肺炎的診斷［10］。

排除標準：（1）陳舊性、病理性或合并其他部位骨折；（2）術前出現肺部感染者；（3）合并慢性肺部疾病者；（4）合并嚴重心腦血管疾病者；（5）合并癌癥、艾滋病等免疫缺陷疾病者。

1.2 一般資料

前瞻性選取2019 年1 月—2021 年12 月就診于本科的老年髖部骨折患者，共57 例患者符合上述標準，納入本研究，其中男23 例，女34 例；平均年齡（71.5±4.9）歲；平均病程（2.6±1.2）d。本研究經醫(yī)院倫理委員會的批準（批號：81YY-KYLL-15-01），所有患者均知情同意且簽署知情同意書。

1.3 手術方法

所有手術均由同一組醫(yī)師完成， 根據骨折類型、活動能力和患者身體情況等因素選擇合適的手術方式。全髖關節(jié)置換（total hip arthroplasty,THA）和股骨頭置換（hemiarthroplasty,HA）均選用后外側入路；后外側切口長約12 cm，依次切開皮膚、皮下組織、闊筋膜及其張肌，鈍性分離臀中肌和臀小肌后緣，顯露大轉子，轉子窩處切斷外旋肌群止點，顯露關節(jié)囊，取出股骨頭并與小轉子上方約1 cm 處截骨，行單純股骨側假體置換（HA）或髖臼側和股骨側假體置換（THA）。股骨近端防旋髓內釘（proximal femoral nail anti-rotation,PFNA）采用牽引床閉合復位下PFNA 內固定術，健肢外展，患肢內旋15°，雙下肢正常行走姿態(tài)，大轉子尖部前1/3 偏內側為入針點，開髓后置入合適長度的主釘，并依次置入頭頸螺釘、遠端交鎖螺釘和尾帽。

1.4 檢測方法

記錄患者術后前3 d 內中性粒細胞絕對值（neutrophil, NEU）、淋巴細胞絕對值（lymphocyte, LYM）和血小板計數（platelet,PLT）的資料，計算NEU 與LYM 的比值（neutrophil to lymphocyte ratio, NLR）和NEU 與LYM 和PLT 比值（neutrophil to lymphocyte and platelet ratio,N/LPR）。計算公式參考劉大東等［11］的研究，即NLR=（NEU/LYM），N/LPR= [(NEU×100)/(LYM×PLT)]。所有資料均采用術后3 d 內最差的數值。

分別收集患者術后3 d 內的外周靜脈血標本，采用雙抗夾心法檢測外周血漿髓過氧化物酶-脫氧核糖核酸（myeloperoxidase-deoxyribonucleic acid, MPODNA）含量來代表NETs 水平［12］。具體方法：MPO單克隆抗體包被96 孔細胞培養(yǎng)板，依次洗滌、封閉、洗滌后加入外周血漿標本，室溫孵育2 h，洗滌后加入辣根過氧化物酶偶聯的抗DNA 單克隆抗體（DNA-HRP），室溫孵育2 h；洗滌后加入ABTS，避光室溫孵育1 h 后在405 nm 處檢測吸光度（A405）值。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 臨床結果

本研究最終納入57 例患者，其中肺炎組19 例，占33.3%；非肺炎組38 例，占66.7%。單側肺炎5例，雙側肺炎14 例；肺炎發(fā)生時間為術后3～7 d，平均（4.5±4.6）d。所有肺炎患者均接受氧療、抗感染等對癥治療后，均不同程度的緩解，無需要氣管插管者，均未進入重癥監(jiān)護室。

2.2 是否發(fā)生肺炎的單因素分析

根據患者術后是否發(fā)生肺炎將患者分為非肺炎組和肺炎組，兩組患者單因素比較結果如表1 所示：兩組患者年齡、性別、吸煙和飲酒史、基礎疾病（高血壓、糖尿病和心臟?。⒐钦鄄课唬ü晒穷i、轉子間）、術前住院時間、手術類型（THA、股骨頭置換、PFNA）、全身麻醉、手術時間和術中出血量的差異均無統計學意義（P＞0.05）。與非肺炎組相比，肺炎組患者外周血MPO-DNA 含量、NLR 和N/LPR 顯著升高（P＜0.05）；而兩組NEU、LYM 和PLT 差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1. 是否發(fā)生肺炎兩組患者的單因素比較Table 1.Univariate comparison between the two groups with or without pneumonia

2.3 是否肺炎的多因素邏輯回歸分析

以是否肺炎為因變量，以NETs（MPO-DNA）、N/LPR 和NLR 為自變量行二分多因素邏輯回歸分析，采用Forwards conditional 逐步向前回歸，模型分類能力為91.2%，經卡方檢驗模型有效（χ2=9.204,P=0.010）。邏輯回歸分析結果見表2，提示NETs（MPO-DNA）（OR=4.175,P＜0.001）和N/LPR（OR=2.087,P=0.048）均為術后肺部感染發(fā)生的危險因素。

表2. 是否肺炎的多因素邏輯回歸分析結果Table 2.Results of multivariate logistic regression analysis for pneumonia or not

2.4 是否發(fā)生肺炎的ROC 分析

外周血MPO-DNA 含量預測老年髖部骨折患者術后肺炎的價值優(yōu)于N/LPR 值和NLR 值；對3 種指標的曲線下面積（area under curve, AUC）差異進行統計分析，結果提示外周血MPO-DNA 含量的AUC高于N/LPR（Z=1.984,P=0.047）、NLR（Z=2.313,P=0.021）；而N/LPR 與NLR 的AUC 的差異無統計學意義（Z=0.429,P=0.668）。以上結果提示外周血MPODNA 含量對老年髖部骨折患者術后肺炎的預測價值優(yōu)于NLR 和N/LPR，見表3 和圖1。

圖1. 預測是否發(fā)生肺炎的ROC 圖。NETs（MPODNA），髓過氧化物酶-脫氧核糖核酸；NLR，NEU 與LYM 的比值；N/LPR，NEU 與LYM 和PLT 比值。Figure 1. ROC diagram for predicting the occurrence of pneumonia. NETs (MPO-DNA), myeloperoxidase- deoxyribonucleic acid;NLR,ratio of NEU to LYM;N/LPR, ratio of NEU to LYM and PLT.

表3. 預測是否發(fā)生肺炎的ROC 分析Table 3.ROC analysis for predicting whether pneumonia happened or not

2.5 亞組分析

根據外周血MPO-DNA 含量的ROC 曲線分析的截斷值4.2，將57 例老年髖部骨折患者分為兩組，對兩組患者術后肺炎發(fā)生率進行分析，結果顯示：MPO-DNA 含量≥4.2 的患者術后肺炎發(fā)生率顯著高于MPO-DNA 含量＜4.2 的患者（P＜0.05）；而NLR≥5.94 的患者術后肺炎發(fā)生率亦高于NLR＜5.94 的患者、N/LPR≥5.71 的患者術后肺炎發(fā)生率亦高于N/LPR＜5.71 的患者，但差異均無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4. 亞組分析Table 4.Subgroup analysis

3 討 論

肺炎是老年髖部骨折常見的術后并發(fā)癥，亦是造成術后患者死亡的重要危險因素［13］。老年人肺部感染發(fā)生隱匿，但進展快，可迅速導致呼吸衰竭甚至死亡。因此，盡早發(fā)現是預防和治療老年髖部骨折術后肺炎的重要環(huán)節(jié)［14］。胸部X 線片和痰液培養(yǎng)是臨床診斷肺部感染的重要措施，但由于存在放射、延遲和污染的因素導致其診斷價值偏低。

眾所周知，免疫細胞功能障礙在老年髖部骨折患者術后感染的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用［5］。中性粒細胞是機體含量最多的先天性免疫細胞，能夠快速到達感染部位并清除入侵病原體，是機體重要的免疫防線［15］。中性粒細胞計數升高是臨床細菌感染的重要證據之一，監(jiān)測中性粒細胞計數可以反映機體感染的情況。淋巴細胞是體積最小的白細胞，負責監(jiān)控體內細胞變異和對抗外界感染。NLR 是中性粒細胞與淋巴細胞計數的比值，亦是一個評價機體炎癥反應和抗炎反應的臨床指標，已被應用于炎癥性疾病預后的預測［16］。畢曉潔等［17］研究表明，NLR 在老年髖部骨折合并肺部感染的診斷中具有較高的價值。本研究對術后發(fā)生肺炎和未發(fā)生肺炎的老年髖部骨折患者進行分析，發(fā)現術后肺炎患者的NLR 顯著高于未發(fā)生肺炎者，而單獨中性粒細胞和淋巴細胞計數均稍高于未發(fā)生肺炎者。分析其原因主要考慮創(chuàng)傷、手術等因素的作用下，患者處于應激狀態(tài)，誘發(fā)免疫細胞的上升；其次患者術中及術后補液造成的循環(huán)中免疫細胞的稀釋。感染時，病原微生物入侵所釋放的毒素在升高中性粒細胞的同時可以誘導淋巴細胞凋亡，在一定程度上降低淋巴細胞計數，從而增大NLR 值。此外，本研究亦發(fā)現監(jiān)測NLR 能夠預測術后肺炎的發(fā)生，但其預測價值較低（AUC 僅為0.650）。其原因主要考慮NLR 僅僅考慮免疫因素，未涉及凝血系統的變化。

血小板是一種無核小細胞碎片，參與凝血和血栓的形成。近期研究證實血小板是溝通機體免疫和凝血的重要“橋梁”，在眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［18］。2020 年Gameiro 等［19］發(fā)現N/LPR 能夠預測膿毒癥伴有腎損傷患者住院病死率。2021 年劉大東等的研究亦證實監(jiān)測外周血N/LPR 能夠預測膿毒癥患者28 d 病死率，且優(yōu)于NLR［11，19］。此外，2018 年Koo［20］的研究證實，監(jiān)測N/LPR 能夠預測心臟手術患者術后腎損傷和長期病死率。與上述研究相似，本研究亦發(fā)現術后肺炎患者的血小板計數高于未發(fā)生肺炎者，且監(jiān)測N/LPR 亦能夠預測術后肺炎的發(fā)生。其原因亦類似于膿毒癥，感染抑制血小板生成并增加其消耗是導致血小板計數降低的重要因素。但N/LPR 預測老年髖部骨折患者術后肺炎的AUC 僅為0.701，且其最佳截斷值的預測靈敏度和特異度普遍偏低。因此，監(jiān)測N/LPR 仍不能很好地預測老年髖部骨折患者術后肺炎的發(fā)生。

NETs 是一種布滿抗菌蛋白的富含DNA 的網狀物質，是中性粒細胞捕捉和殺滅入侵病原微生物的重要方式［21］。然而，NETs 是一把“雙刃劍”，過度的NETs 生成亦是造成患者器官功能損害和死亡的主要原因之一［22～24］。一方面，NETs 可以招募炎癥細胞，促進炎癥介質的釋放，誘導組織器官的炎性損傷，破壞臟器結構的完整性。另一方面，NETs 可以結合血小板，吸附凝血因子，導致凝血功能紊亂，誘發(fā)機體微血栓形成甚至彌漫性血管內凝血的發(fā)生。2021年，Liu 等［25］的研究表明，NETs 生成與創(chuàng)傷性骨折患者深靜脈血栓形成的有關。本研究證實術后肺炎的患者外周血中NETs 含量值顯著高于未發(fā)生肺炎者，監(jiān)測外周血中MPO-DNA 含量能夠預測術后肺炎的發(fā)生；且其預測價值優(yōu)于NLR 和N/LPR。分析其原因主要考慮以下幾方面：（1）創(chuàng)傷和手術誘導中性粒細胞活化，活化后的中性粒細胞生成NETs 并在趨化因子的介導下迅速聚集至肺組織中。NETs 通過其攜帶的多種活性成分誘導肺泡內皮細胞和上皮細胞的凋亡而破壞肺泡-毛細血管屏障，介導肺組織的機械性損傷［26］；（2）NETs 亦能夠招募炎癥細胞，促進炎癥介質的釋放，誘導并加重肺組織局部炎癥反應，導致肺組織的炎性損傷［26］；（3）NETs 可以激活凝血，誘發(fā)微血栓生成，沉積于肺組織微血管中，誘發(fā)肺微循環(huán)障礙導致肺損傷。

綜上所述，老年髖部骨折患者術后外周血中NETs 含量升高是肺部感染的危險因素，監(jiān)測外周血中NETs 含量對術后肺部感染有較高的診斷價值。但本研究為小樣本單個中心研究，人群代表性差，需要多中心、大樣本的研究來進一步驗證。