骨性關(guān)節(jié)炎靶向基因治療的研究進(jìn)展△

趙堯燁，劉震東，高延征

（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院脊柱脊髓外科，河南鄭州 450003）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性軟骨退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生［1］。早期OA 采用減輕體重、運(yùn)動(dòng)療法等基礎(chǔ)治療，病情加重后，可采用藥物治療。若病情繼續(xù)加重，基礎(chǔ)和藥物治療無(wú)效時(shí)，則選擇手術(shù)治療［2］。隨著人類(lèi)基因組攜帶的遺傳信息不斷被揭示，為解決OA 提供了新的思路。OA 基因治療是通過(guò)載體把目的基因引入受損的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，使目的基因在關(guān)節(jié)穩(wěn)定、可控、靶向的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)和修復(fù)受損的軟骨［3］。近年來(lái)，OA 基因治療在炎癥及軟骨基質(zhì)代謝、基因遞送系統(tǒng)、小核糖核酸（micro ribonucleic acid,miRNA）及長(zhǎng)非編碼核糖核酸（long non-coding ribonucleic acid, LncRNA）等方面的研究不斷深入。本文就基因治療在OA 中的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，介紹基因治療的相關(guān)研究及應(yīng)用。

1 OA 基因治療策略

1.1 減輕關(guān)節(jié)炎癥并抑制軟骨基質(zhì)降解

白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）是OA發(fā)生的重要炎癥介質(zhì)之一，過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix,ECM）合成和分解代謝失衡，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨破壞［4］。白細(xì)胞介素-1 受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA）可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-1 受體，但不激活炎癥信號(hào)通路，從而抑制IL-1β 作用并延緩關(guān)節(jié)軟骨破壞。Senter 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，改良腺病毒載體FX201 攜帶IL-1RA 基因注射到大鼠OA 模型關(guān)節(jié)后，局部炎癥減輕，同時(shí)軟骨基質(zhì)降解受到抑制。

核因子-κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）通路是OA 重要的炎癥通路，該通路在被IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等因子激活后，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而合成大量趨化因子和細(xì)胞降解酶，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥，造成軟骨破壞［6］。有研究表明，核因子κB 激酶亞基β 抑制因子（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta Gene,IKKβ）在NF-κB 通路激活和許多疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，通過(guò)使用miR-214-3p 靶向抑制IKKβ 表達(dá)，NF-κB 通路激活將受到抑制，進(jìn)而可減緩OA局部炎癥發(fā)生［7］。

基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP-13）是重要的軟骨基質(zhì)降解酶，可以降解基質(zhì)中II 型膠原和蛋白多糖，導(dǎo)致軟骨破壞［8］。Hu等［9］在研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)MMP-13 基因表觀遺傳學(xué)及上下游因子進(jìn)行調(diào)控，可以間接干擾MMP-13的表達(dá)，抑制軟骨基質(zhì)中II 型膠原和蛋白多糖的降解。

低氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α）由軟骨細(xì)胞分解代謝產(chǎn)生，HIF-2α 在OA中表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)MMP-13、具有血小板反應(yīng)蛋白基序4 的去整合素和金屬蛋白酶（disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4, ADAMTS4）等酶類(lèi)合成，進(jìn)而破壞關(guān)節(jié)軟骨［10］。研究顯示，在小鼠miR-455 基因敲除模型中，注射miR-455-5p 和miR-455-3p 可以抑制HIF-2α 表達(dá)，減少炎癥因子合成和軟骨破壞，同時(shí)抑制滑膜炎癥進(jìn)展［11］。還有研究表明，多配體蛋白聚糖-4（syndecan-4, SDC-4）通過(guò)誘導(dǎo)miR-96-5p 表達(dá)，負(fù)性調(diào)控小鼠軟骨組織和軟骨細(xì)胞中HIF-2 合成，最終對(duì)關(guān)節(jié)局部穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞表型產(chǎn)生影響，抑制OA 病理進(jìn)展［12］。

1.2 促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)合成

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族參與軟骨形成，其中TGF-β1 在OA中促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并調(diào)控ECM 合成［13］。Cai 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 通過(guò)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，能夠促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)。此外，韓國(guó)目前已經(jīng)批準(zhǔn)了注射過(guò)表達(dá)TGF-β1 的同種異體軟骨細(xì)胞來(lái)治療OA［15］?？紤]到關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞注射發(fā)揮作用的半衰期短，是否需要重復(fù)給藥以維持適宜的基因濃度尚不清楚。同時(shí)，鑒于關(guān)節(jié)內(nèi)TGF-β1 的長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致滑膜纖維化、骨贅形成和軟骨細(xì)胞肥大，因此，TGF-β1 的瞬時(shí)表達(dá)可能是有益的［16］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）是一種多功能蛋白，可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其屬于TGF-β 超家族［17］。有研究顯示，BMP 2、3、4、6、7 和9 作為生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)軟骨再生［18］。還有研究表明，OA 關(guān)節(jié)局部注射BMP7 過(guò)表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能較好地修復(fù)缺損軟骨［19］。

生長(zhǎng)和分化因子-5（growth differentiation factor-5,GDF-5）同樣是TGF-β 超家族的成員。有研究表明，通過(guò)調(diào)控配對(duì)樣同源結(jié)構(gòu)域1（paired like homeodomain 1, PITX1） 或鋅指E-盒結(jié)合同源盒1（zinc finger E-box binding homeobox 1, ZEB1）與GDF-5 上游啟動(dòng)子中增強(qiáng)序列結(jié)合，有望提高GDF-5 表達(dá)水平。同時(shí)，GDF-5 在關(guān)節(jié)軟骨形成中起重要作用，GDF-5 蛋白或基因的外源應(yīng)用可促進(jìn)骨和軟骨的分化［20］。也有證據(jù)顯示，GDF-5 在OA 發(fā)生早期表達(dá)上調(diào)，在關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)中發(fā)揮重要作用［21］。

2 基因遞送載體

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在基質(zhì)的包裹下形成致密的軟骨結(jié)構(gòu)，基因需要借助載體穿過(guò)致密的軟骨結(jié)構(gòu)，才能進(jìn)入軟骨細(xì)胞發(fā)揮治療作用。目前常用的載體包括病毒載體和非病毒載體［22］。

2.1 病毒載體

病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞是目前基因遞送的常用方法，病毒載體包括腺病毒、慢病毒等。

腺病毒在體外對(duì)軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高，且轉(zhuǎn)染不受細(xì)胞分裂影響，但在體內(nèi)試驗(yàn)中因誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，導(dǎo)致目的基因作用時(shí)間較短。有研究表明，攜帶IL-1RA 基因的腺病毒載體用于關(guān)節(jié)腔注射后，有效治療了大鼠OA 模型中軟骨缺損［5］。Ji 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)壽蛋白6（sirtuin 6,Sirt6）基因缺乏會(huì)加劇軟骨細(xì)胞衰老和骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，而關(guān)節(jié)內(nèi)注射攜帶Sirt6 基因的腺病毒，可顯著減輕小鼠OA 模型骨關(guān)節(jié)炎癥狀。

慢病毒來(lái)源于人類(lèi)免疫缺陷I 型病毒（human immunodeficiency virus-I,HIV-I），經(jīng)過(guò)改造后，可以介導(dǎo)目的基因插入宿主基因組并穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高且不受細(xì)胞分裂影響。有研究表明，在大鼠OA 模型中，通過(guò)將慢病毒介導(dǎo)的多聚ADP核糖聚合酶-1 ［poly (ADP-ribose) polymerase-1,PARP-1］基因抑制序列導(dǎo)入關(guān)節(jié)腔，能夠降低PARP-1 表達(dá)、抑制軟骨基質(zhì)分解酶的合成、減輕炎癥反應(yīng)和軟骨退變［24］。盡管慢病毒轉(zhuǎn)染有上述優(yōu)勢(shì)，且大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)其不會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，但考慮到慢病毒含有HIV 序列遺傳物質(zhì)，依然可能會(huì)給受試者帶來(lái)一定的心理問(wèn)題。

2.2 非病毒載體

在非病毒載體基因遞送中，傳統(tǒng)方法是通過(guò)電穿孔和超聲波等物理方法將攜帶目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，目前，納米材料及水凝膠遞送外源性核酸逐步取代了傳統(tǒng)方案。與病毒載體相比，非病毒載體避免了病毒載體的免疫原性、致癌效應(yīng)等不足，是一種理想的基因遞送工具［25］。然而，非病毒載體進(jìn)入細(xì)胞后，通常在胞質(zhì)以游離形式存在并表達(dá)目的蛋白，而不插入宿主基因組中，因此基因遞送效率較低［22］。

納米顆粒是介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的新型材料，有研究顯示，負(fù)載整合素β1（integrin beta-1,ITGB1）的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)脂質(zhì)納米顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入軟骨細(xì)胞后，主要定位于胞質(zhì)。在暴露于IL-1β 刺激后，ITGB1 能夠減弱大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡并增強(qiáng)組織修復(fù)［26］。還有研究表明，與商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000 相比，納米顆粒不僅表現(xiàn)出更高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，而且能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移［14］。

此外，介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的新型材料還有水凝膠，其是具有水溶性的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)材料，理化性質(zhì)可變，能夠滿(mǎn)足不同條件下的需求，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如從病理機(jī)制研究到組織再生和疾病治療［27］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b-5p 在OA 中顯著下調(diào)，使用可注射的水凝膠遞送miR-29b-5p 激動(dòng)劑，能夠募集到大量滑膜干細(xì)胞并加速其分化為軟骨細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)軟骨修復(fù)［28］。同時(shí)，Hu 等［29］研究表明，水凝膠能夠協(xié)助含miR-23a-3p 的囊泡作用于軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，miR-23a-3p 通過(guò)抑制磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog,PTEN） 水平并提高蛋白激酶B （protein kinase B,PKB）的表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨再生，修復(fù)軟骨缺損。

3 MiRNA

MiRNA 是一類(lèi)含19～25 個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過(guò)與mRNA3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)翻譯沉默或降解mRNA，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡和個(gè)體發(fā)育等過(guò)程［30］。miRNA 具有高度保守性，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中與其他基因相獨(dú)立，自身不翻譯蛋白質(zhì)，而參與多種代謝過(guò)程。MiRNA 在OA 的進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，Zhang 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，miR-17 在OA 軟骨細(xì)胞中表達(dá)減少并導(dǎo)致OA 的進(jìn)展。通過(guò)補(bǔ)充外源性miR-17 或經(jīng)GDF-5 內(nèi)源性誘導(dǎo)，可以靶向抑制MMP3、MMP 13、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2,NOS2）等分解代謝因子表達(dá)，繼而有效預(yù)防OA。還有研究表明，miR-214-3p 同樣在OA中表達(dá)水平下調(diào)，通過(guò)在OA 小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射miR-214-3p 激動(dòng)劑，可下調(diào)IKK-β 表達(dá)并導(dǎo)致NF-kB通路激活障礙，進(jìn)而發(fā)揮軟骨保護(hù)作用［7］。

以上研究表明，miRNA 在OA 中通過(guò)減輕關(guān)節(jié)炎癥并抑制軟骨基質(zhì)降解，促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成等方式修復(fù)軟骨缺損，然而有部分miRNA 會(huì)加速軟骨細(xì)胞的凋亡，對(duì)OA 不發(fā)揮正性保護(hù)作用。例如，miR-146a-5p 在OA 患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織中高表達(dá)，通過(guò)靶向抑制內(nèi)吞銜接蛋白（endocytic adaptor protein,NUMB）表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡并減少軟骨細(xì)胞的自噬。關(guān)節(jié)內(nèi)注射miR-146a-5p 拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)miR-146a-5p 對(duì)OA 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和自噬的影響［32］。同時(shí)，Lu 等［33］研究表明，miR-99b-5p 在OA 軟骨中表達(dá)顯著上調(diào)，其負(fù)性調(diào)控含乳脂肪球EGF 和因子V/VIII 結(jié)構(gòu)域基因（milk fat globule EGF and factor V/VIII domain containing, MFGE8）表達(dá)，MFG-E8 水平下降會(huì)導(dǎo)致小鼠進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨損傷、大量骨贅形成和滑膜增生?？傊琺iRNA 在OA 中發(fā)揮正性保護(hù)作用，還是促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，加速軟骨退變，仍有許多問(wèn)題值得研究和探討。

4 LncRNA

LncRNA 可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，減少miRNA和下游基因結(jié)合，進(jìn)而增加下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在OA 病理進(jìn)程中起著重要作用，LncRNA 已成為OA 早期診斷和有效治療的靶點(diǎn)［34］。Wang 等［35］研究結(jié)果顯示，LncRNA THUMPD3-AS1 在OA 軟骨組織和IL-1β 刺激的軟骨細(xì)胞系中下調(diào)。LncRNA THUMPD3-AS1 過(guò)表達(dá)能夠減輕細(xì)胞凋亡并促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而敲低則具有相反作用。此外，Tian 等［36］研究證實(shí)，與正常組織和軟骨細(xì)胞相比，OA 組織和IL-1β 處理的軟骨細(xì)胞中LncRNA SNHG7 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)其下游靶點(diǎn)miR-34a-5p 上調(diào)，LncRNA SNHG7 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和自噬。

5 總結(jié)與展望

目前許多學(xué)者已經(jīng)對(duì)OA 基因治療靶點(diǎn)及載體進(jìn)行了深入研究，同時(shí)在各種動(dòng)物模型上評(píng)估了基因治療的效果?；蛑委熃柚《净蚍遣《据d體將目的基因?qū)胪俗冴P(guān)節(jié)，通過(guò)減輕關(guān)節(jié)局部炎癥、抑制軟骨基質(zhì)降解和促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成等方式，減輕OA 的癥狀，為OA 治療提供了新的思路。然而，在組織局部微環(huán)境中，炎癥通路激活可能是組織修復(fù)所必需的，抑制炎癥信號(hào)傳導(dǎo)可能打破微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重和組織損傷。因此，調(diào)控病變關(guān)節(jié)中目的基因表達(dá)水平和維持時(shí)間，減少基因治療副作用，進(jìn)而提高治療效果，需要對(duì)其中的精細(xì)調(diào)控機(jī)制不斷研究和認(rèn)知。進(jìn)一步的研究也將為局部軟骨組織達(dá)到最佳修復(fù)狀態(tài)提供新的思路。此外，單一或復(fù)合基因治療的發(fā)現(xiàn)與不斷發(fā)展的遞送技術(shù)相結(jié)合，有望早日實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，造?；颊摺?/p>