殼聚糖及其衍生物促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合研究進(jìn)展

顧 召,夏聯(lián)恒,林 權(quán),王婷萱,高 杰

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

全球約有4.63億糖尿病患者,糖尿病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),預(yù)估2030年將達(dá)5.78億[1],隨著我國(guó)老年人口比重逐年上升,糖尿病患者已遠(yuǎn)超1.45億[2]。約30%糖尿病患者伴發(fā)糖尿病創(chuàng)面,在全身糖代謝異常影響下,局部氧化應(yīng)激損傷、慢性炎癥等因素制約糖尿病創(chuàng)面愈合,形成慢性創(chuàng)面,其中糖尿病足潰瘍是下肢非創(chuàng)傷性截肢的主要原因[3]。糖尿病創(chuàng)面難愈增加創(chuàng)面感染風(fēng)險(xiǎn),感染進(jìn)一步加重可導(dǎo)致患者死亡。臨床上多以“TIME”(tissuenonviable,infection/inflammation,moisture imbalance,egdge of wound)原則,指導(dǎo)糖尿病創(chuàng)面的治療,局部清創(chuàng)后復(fù)雜的炎癥機(jī)制及大量滲出物制約著傳統(tǒng)敷料的應(yīng)用[4]。殼聚糖是制備新型敷料的理想原料,具有良好的生物相容性、表面活性、生物降解性、無(wú)毒性。殼聚糖新型敷料能吸收滲出物,建立創(chuàng)面局部潮濕環(huán)境,為氣體交換提供空間,預(yù)防感染、易清除,通過(guò)負(fù)載多種物質(zhì)有效給藥,促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面組織再生[5]。殼聚糖還具有多種藥學(xué)特性,能從多方面促進(jìn)創(chuàng)面愈合。殼聚糖可以進(jìn)一步衍生化,在保留殼聚糖特有性質(zhì)的基礎(chǔ)上,提升了適應(yīng)傷口環(huán)境的能力,擴(kuò)大了殼聚糖的應(yīng)用范圍。隨著對(duì)殼聚糖及其衍生物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究深入,近年研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖及其衍生物能通過(guò)抗氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)血管生成等方面促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。本文就殼聚糖及其衍生化、藥理作用、殼聚糖及其衍生物促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合展開論述,為殼聚糖及其衍生物促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合提供新思路。

1 殼聚糖及其衍生物

殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物,是一種天然堿性多糖,無(wú)毒,且具有多種生物活性,如生物降解性、生物相容性、抑菌、抗癌、降脂、增強(qiáng)免疫性等。殼聚糖溶解性差,不溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑,限制了殼聚糖的應(yīng)用。殼聚糖分子有C-6位伯羥基、C-3位仲羥基以及C-2位的伯氨基等較強(qiáng)反應(yīng)活性的官能團(tuán),可通過(guò)官能團(tuán)的取代,賦予殼聚糖各種功能特性[6],得到較好生物相容性、生物活性、抑菌活性及其他優(yōu)異活性的殼聚糖衍生物,進(jìn)一步擴(kuò)大殼聚糖應(yīng)用范圍。

殼聚糖的?；磻?yīng)主要是利用分子鏈上的氨基和羥基與多種有機(jī)酸及有機(jī)酸衍生物發(fā)生反應(yīng),在分子鏈上引入脂肪基團(tuán)或芳香基團(tuán)[7],破壞分子內(nèi)、分子間氫鍵,提高水溶性,是殼聚糖最常見的衍生化反應(yīng),見圖1。N-?；侵赴被l(fā)生?；纬甚０返姆磻?yīng),當(dāng)C-2位存在保護(hù)基團(tuán)時(shí),?；磻?yīng)發(fā)生在C-6位的羥基上,稱為O-?；?。殼聚糖酰化反應(yīng)能提高殼聚糖的抗菌[8]、抗氧化性[9]。殼聚糖烷基化反應(yīng)原理與?；磻?yīng)基本一致,通過(guò)將烷基引入殼聚糖分子鏈上C-3、C-6位的羥基及C-2位氨基,而形成含烷基的殼聚糖衍生物,見圖1。烷基為疏水基團(tuán),所引入烷基鏈長(zhǎng)度能影響殼聚糖烷基化衍生物的水溶性[10]。烷基化反應(yīng)能提高殼聚糖的凝血及抗菌性[11]。殼聚糖的羧基化反應(yīng)主要是利用氯代鏈烷酸或乙醛酸與殼聚糖分子鏈上氨基與羥基發(fā)生反應(yīng),C-6位的羥基最易取代,其次是C-3位的羥基,難度最大的是C-2位的氨基,見圖1。羧基化殼聚糖具有良好的水溶性,并能溶于堿性溶液。目前,殼聚糖的羧化反應(yīng)研究多集中于羧甲基化反應(yīng),羥甲基化殼聚糖具有抗菌、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、降脂、抗動(dòng)脈硬化、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、降血糖等作用,在生物醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[10]。殼聚糖的衍生化還包括季銨化、硫醇化、羥基烷基化、酯化、磺化等,所制備的殼聚糖衍生物在溶解度、生物活性、材料結(jié)合能力等方面均較殼聚糖有不同程度的提高,拓展了殼聚糖在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖1 殼聚糖官能團(tuán)的取代

2 殼聚糖藥理作用

2.1抗菌作用 殼聚糖抗菌譜廣,能抑制革蘭陽(yáng)性菌,革蘭陰性菌及真菌的生存能力,起到抗菌作用。殼聚糖的抗菌機(jī)制目前尚不明確,主流觀點(diǎn)認(rèn)為殼聚糖胺基正電荷與細(xì)菌表面帶負(fù)電荷的磷壁酸、脂多糖通過(guò)靜電相互作用,改變細(xì)菌表面陰離子分布,影響細(xì)胞壁穩(wěn)定性,破壞細(xì)胞膜,促使細(xì)胞裂解[12-13]。也有觀點(diǎn)認(rèn)為,低分子量殼聚糖能透過(guò)細(xì)胞膜與DNA結(jié)合,影響DNA聚合酶、RNA聚合酶功能,干擾遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,阻礙細(xì)菌增殖[14]。殼聚糖是一種金屬螯合劑,能與細(xì)菌細(xì)胞膜表面金屬離子螯合,破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性,影響細(xì)胞正常功能,螯合金屬離子還影響細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[15]。殼聚糖還可以作為閉塞性化合物在細(xì)菌表面沉積,阻止細(xì)菌與外界物質(zhì)交換導(dǎo)致細(xì)菌死亡。殼聚糖與磷脂相互作用選擇性抑制真菌,抗真菌活性與細(xì)胞質(zhì)膜流動(dòng)呈正相關(guān)。相較抗生素而言,殼聚糖抗菌活性弱,不能有效抑制多種細(xì)菌[16],多項(xiàng)殼聚糖脫乙?；?、分子量大小、溶解介質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖分子量及溶解介質(zhì)pH值改變能增強(qiáng)殼聚糖抗菌活性[17-18]。殼聚糖衍生化研究發(fā)現(xiàn),席夫堿反應(yīng)是提高殼聚糖抗菌活性的最佳方法之一[19]。羧基化反應(yīng)能提高殼聚糖抗菌活性,磺化、季銨化反應(yīng)能增強(qiáng)殼聚糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性,磺化反應(yīng)還可以加強(qiáng)殼聚糖選擇性抑制真菌[20]。

2.2止血作用 帶正電荷的殼聚糖分子與帶負(fù)電荷的紅細(xì)胞,通過(guò)靜電相互作用促進(jìn)紅細(xì)胞聚集,開始凝血過(guò)程,帶正電荷的殼聚糖能活化血小板、吸附血紅蛋白,促使血小板黏附聚集,釋放促凝物質(zhì),提高血小板膜受體糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的表達(dá),抑制纖維蛋白溶解,加速形成纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)[21]。殼聚糖烷基化反應(yīng)能更好地促進(jìn)凝血[22],殼聚糖季銨化反應(yīng)可用于不可壓迫性出血的止血[23]。

2.3抗氧化作用 殼聚糖分子鏈上的氨基和羥基能中止自由基參與的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),有效清除人體內(nèi)過(guò)多的自由基,從而起到抗氧化作用。殼聚糖抗氧化活性取決于短鏈分子內(nèi)氫鍵及游離的氨基、羥基[24],多羥基、氨基抗氧化劑具有較好的生物活性。Park等[25]為提高其抗氧化活性,通過(guò)對(duì)不同分子量及脫乙?；瘹ぞ厶沁M(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示低分子量、高脫乙酰化的殼聚糖抗氧化活性更好。有實(shí)驗(yàn)研究將富馬酸甲酯引入到殼聚糖的氨基上,以及與酚酸結(jié)合均能提高殼聚糖的抗氧化活性[26-27]。羧甲基化、酰化、季銨化及接枝共聚物化反應(yīng)均能增強(qiáng)殼聚糖抗氧化活性[28]。

2.4免疫調(diào)節(jié)作用 殼聚糖對(duì)固有免疫、特異性免疫均有作用,作為佐劑能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。多項(xiàng)研究表明,殼聚糖能刺激固有免疫,增加噬中性粒細(xì)胞數(shù)量,保持巨噬細(xì)胞活性,誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,激活多種細(xì)胞的免疫效果,特異性免疫中殼聚糖能增加T淋巴細(xì)胞活性,促使免疫球蛋白濃度增加[29-31]。在殼聚糖分子上引入活性基團(tuán)可以加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)[32],三甲基氯化殼聚糖銨可誘導(dǎo)較強(qiáng)的全身和黏膜免疫反應(yīng)[33],殼聚糖/O-HTCC納米顆粒可增加小鼠抗原提呈細(xì)胞的活性[34]。殼聚糖可作為藥物傳遞系統(tǒng),靶向運(yùn)送藥物,是良好的免疫佐劑,季銨化殼聚糖在免疫佐劑方面有良好的研究空間[35]。除上述功能外,殼聚糖還具有黏膜黏附、鎮(zhèn)痛、降壓、抗膽固醇、抗糖尿病等多種藥理作用,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。

3 殼聚糖及其衍生物作用于糖尿病創(chuàng)面機(jī)制

傷口愈合是復(fù)雜有序的生理過(guò)程,一般分為止血、炎癥、增生、重塑四個(gè)重疊階段。皮膚組織完整性遭到破壞,創(chuàng)面血管反射性收縮,血小板聚集,激活凝血系統(tǒng),形成血凝塊,并釋放生長(zhǎng)因子,啟動(dòng)修復(fù)過(guò)程;止血后,被召集到創(chuàng)面的中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌及壞死組織,建立免疫屏障后,巨噬細(xì)胞釋放多種生長(zhǎng)因子,促進(jìn)血管生成;新生血管與內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞構(gòu)成的肉芽組織填充缺損區(qū)域,促進(jìn)創(chuàng)面愈合;成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的Ⅲ型膠原被Ⅰ型膠原取代,細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化瘢痕,完成創(chuàng)面愈合[36]。糖尿病創(chuàng)面難愈機(jī)制目前尚未明確,多與局部高糖微環(huán)境,氧化應(yīng)激損傷、新生血管障礙、持續(xù)炎癥狀態(tài)及感染等多因素破壞細(xì)胞因子愈合過(guò)程有關(guān),導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合形成慢性創(chuàng)面[37]。

3.1抗氧化應(yīng)激損傷 皮膚組織缺損,皮膚屏障遭到破壞,大量在傷口處聚集的免疫細(xì)胞能產(chǎn)生過(guò)氧化物,清除入侵病原微生物,所生成的活性氧含量決定愈合速度,適量活性氧能加速細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等釋放,促進(jìn)血管生成及組織愈合,而大量活性氧則會(huì)造成氧化應(yīng)激損傷,阻礙愈合過(guò)程。糖尿病創(chuàng)面局部高糖微環(huán)境導(dǎo)致非酶促糖基化反應(yīng),產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物,影響細(xì)胞物質(zhì)交換,晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積,增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生的過(guò)量活性氧,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,延遲愈合[38]。高血糖還能直接升高金屬蛋白酶活性,降低金屬蛋白酶抑制因子的表達(dá)與氧化應(yīng)激反應(yīng),降解細(xì)胞外基質(zhì),延遲細(xì)胞遷移和抑制膠原沉積延遲愈合[39]。殼聚糖能有效提高抗氧化酶活性,清除多余自由基,是良好的抗氧化劑。Anushree等[40]用二甲基甲酰胺對(duì)殼聚糖進(jìn)行磷酸化,并進(jìn)行修飾制備磷酸化殼聚糖(PC)。為測(cè)定PC抗氧化性,體外通過(guò)對(duì)鐵還原、脂質(zhì)過(guò)氧化物和超氧化物清除能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示PC具有良好的抗氧化能力。為探究PC在糖尿病創(chuàng)面應(yīng)用潛力,對(duì)糖尿病切除性傷口大鼠模型進(jìn)行干預(yù),通過(guò)傷口測(cè)量、組織病理學(xué)檢測(cè)及傷口中超氧化物歧化酶活性、脂質(zhì)過(guò)氧化物進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示PC在糖尿病創(chuàng)面中具有良好的抗氧化能力,并促進(jìn)創(chuàng)面愈合,PC可作為糖尿病創(chuàng)面愈合的有效治療劑。

3.2調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化 適度炎癥有助于創(chuàng)面愈合,炎癥反應(yīng)早期出現(xiàn)的M1型巨噬細(xì)胞,通過(guò)分泌炎癥因子、炎癥趨化因子,促進(jìn)創(chuàng)面炎癥反應(yīng),增強(qiáng)創(chuàng)面壞死組織和細(xì)胞的清除,防止細(xì)菌侵襲。炎癥反應(yīng)后期創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,剩余巨噬細(xì)胞最終會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細(xì)胞,M2型巨噬細(xì)胞釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)來(lái)促進(jìn)血管生成,也可以釋放血管活性物質(zhì),提高血管生成能力,減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng),使創(chuàng)面局部細(xì)胞得到增殖以及血管化[41]。高血糖、氧化應(yīng)激等因素通過(guò)調(diào)節(jié)表觀遺傳密碼導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化功能障礙,M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量和比例增高,使糖尿病創(chuàng)面處于慢性炎癥狀態(tài),延遲愈合[42]。殼聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞極化具有調(diào)控作用[43]。朱萌等[44]為驗(yàn)證水溶性殼聚糖制備敷料能力及在慢性創(chuàng)面的功能,對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾,制備水溶性殼聚糖,將聚乙烯醇、明膠、水溶性殼聚糖,以循環(huán)凍融法制備水溶性殼聚糖水凝膠敷料,通過(guò)干預(yù)糖尿病小鼠感染全層皮膚缺損創(chuàng)面,發(fā)現(xiàn)水溶性殼聚糖水凝膠敷料能有效控制創(chuàng)面感染,促進(jìn)創(chuàng)面愈合,且新生組織血管密度較高,通過(guò)比較Raw264.7巨噬細(xì)胞中CD206陽(yáng)性細(xì)胞百分率,證明水溶性殼聚糖凝膠敷料可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化,從而修復(fù)慢性創(chuàng)面。

3.3促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 骨髓源性巨噬細(xì)胞能轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞合成膠原和細(xì)胞外基質(zhì),參與肉芽組織生成,巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而成的成纖維細(xì)胞主導(dǎo)創(chuàng)面愈合[45-46]。糖尿病創(chuàng)面愈合過(guò)程中,巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化受抑制,創(chuàng)面膠原沉積受限,影響創(chuàng)面愈合。硫酸殼聚糖(SCS)是一種肝素樣物質(zhì),通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化及炎癥因子分泌促進(jìn)骨修復(fù)。為驗(yàn)證SCS在慢性糖尿病創(chuàng)面中的效果,Shen等[47]制備了一種摻雜SCS的Ⅰ型膠原(ColⅠ/SCS)水凝膠,其可通過(guò)減少小鼠慢性糖尿病創(chuàng)面M1型巨噬細(xì)胞極化,白細(xì)胞介素(IL)-6的產(chǎn)生,增加了IL-4和TGF-β1的產(chǎn)生,加速炎癥消退;此外,ColⅠ/SCS水凝膠還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,從而促進(jìn)傷口組織中膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的形成。

3.4促進(jìn)血管生成 血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及基底層細(xì)胞激活,有助于創(chuàng)面血管生成及創(chuàng)面恢復(fù),高血糖是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的潛在因素,在持續(xù)性炎癥狀態(tài)下,生長(zhǎng)因子缺乏,影響糖尿病創(chuàng)面細(xì)胞增殖及血管化[48]。Gao等[49]采用殼聚糖凝膠干預(yù)糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面模型,發(fā)現(xiàn)殼聚糖凝膠能促進(jìn)血管生成及創(chuàng)面愈合,通過(guò)對(duì)創(chuàng)面肉芽組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞RNA測(cè)序,發(fā)現(xiàn)殼聚糖通過(guò)誘導(dǎo)CAV1高水平表達(dá),促進(jìn)Wnt信號(hào)通路活性,加速血管生成。

3.5抑制生物膜活性 通過(guò)宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假單胞菌、大腸桿菌、真菌等微生物感染能延遲糖尿病創(chuàng)面愈合[50]。糖尿病創(chuàng)面病原微生物感染常以生物膜形式存在,生物膜能保護(hù)病原微生物免受抗菌藥物和免疫系統(tǒng)的影響,通過(guò)群體感應(yīng)改變微生物的增殖速度、代謝活動(dòng),持續(xù)刺激先天免疫系統(tǒng),導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面延遲愈合[51]。多項(xiàng)關(guān)于殼聚糖抗菌作用研究表明,殼聚糖納米微粒能抑制細(xì)菌、真菌生物膜活性[52-53],可能與促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合有關(guān)。

4 討論與展望

糖尿病創(chuàng)面難愈是全球醫(yī)療系統(tǒng)面臨的棘手問(wèn)題,殼聚糖具有抗菌、抗氧化、止血、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用,因其固有理化性質(zhì)限制了殼聚糖的應(yīng)用。殼聚糖分子鏈上反應(yīng)活性的官能團(tuán)可通過(guò)?；?、烷基化、羥基化等反應(yīng),制備溶解性、藥理活性更強(qiáng)的殼聚糖衍生物,進(jìn)一步擴(kuò)大殼聚糖在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用。多學(xué)科研究表明,殼聚糖及其衍生物能通過(guò)抗氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、加速血管生成、抑制生物膜活性,促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合[54]。殼聚糖及其衍生物促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合與殼聚糖的抗菌、抗氧化等作用有關(guān),其具體信號(hào)通路尚未明確,作用機(jī)制有待深入研究。

殼聚糖在自然界中含量豐富,獲取簡(jiǎn)便,具有靶向傳遞、無(wú)毒、可生物降解等多種作用,廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)療領(lǐng)域。殼聚糖作為生物聚合物在皮膚、骨、腎臟、神經(jīng)、肝臟、傷口愈合等方面已顯示出應(yīng)用潛力,具有廣闊應(yīng)用前景。近年來(lái),組織工程學(xué)研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖在神經(jīng)修復(fù)中具有正向作用,部分殼聚糖衍生物能增強(qiáng)干細(xì)胞增殖、分化潛能,殼聚糖及其衍生物促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合可作為新的研究方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。