加味芎蝎散對咳嗽高敏綜合征大鼠神經(jīng)源性炎癥的影響

孫洮玉,楊 斌,任軍華,樊茂蓉,徐春英,郭慧娟

(1. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京 100700;2. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院,北京 100091)

慢性咳嗽是指時間超過8周,影像學檢查無明顯異常的咳嗽[1]。咳嗽的病因復雜,涉及面廣,治療手段缺乏系統(tǒng)化及精準醫(yī)學支持,有相當比例的咳嗽患者經(jīng)抗生素及鎮(zhèn)咳藥治療后收效甚微,并存在不良反應發(fā)生的可能,對患者心理、工作、學習等造成負面影響?？人愿呙艟C合征是針對慢性咳嗽診治而提出的一個新概念,認為咳嗽并不總是與某種疾病關聯(lián),而是一種具有獨特病理生理學過程的臨床實體,疾病狀況如哮喘、感染、食管反流等多數(shù)作為觸發(fā)因素,而不是咳嗽的直接原因[2]?？人允苎铀韬粑袠锌刂?大腦皮質(zhì)起調(diào)節(jié)作用,咳嗽反射有自己的神經(jīng)調(diào)節(jié)途徑,速激肽網(wǎng)在呼吸道的廣泛存在以及大腦皮質(zhì)炎癥介質(zhì)的釋放均是引發(fā)咳嗽反射的關鍵因素。氣道的神經(jīng)源性炎癥是咳嗽高敏綜合征發(fā)生的核心機制,氣道上皮及氣道平滑肌細胞表面存在大量速激肽受體,是神經(jīng)源性介質(zhì)作用的主要效應細胞,介導氣道血管通透性增強、氣道管腔分泌物增多,分泌炎癥分子;咳嗽反射弧將信號傳入咳嗽中樞,大腦皮質(zhì)釋放白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質(zhì),調(diào)節(jié)咳嗽反應的發(fā)生、持續(xù)[3]。加味芎蝎散是徐榮謙教授由傳統(tǒng)古方芎蝎散加減而來,臨床治療咳嗽變異型哮喘療效顯著[4-5]。前期動物實驗也發(fā)現(xiàn),加味芎蝎散可以調(diào)節(jié)氣道上皮增殖[6]、凋亡[7]、自噬[8]及Th1/Th2比例[9],逆轉(zhuǎn)氣道平滑肌表型轉(zhuǎn)化[10],從而抑制咳嗽反應。本實驗通過建立咳嗽高敏綜合征大鼠模型,觀察肺組織速激肽及受體、大腦皮質(zhì)炎癥介質(zhì)等的表達變化,探討了加味芎蝎散是否可影響神經(jīng)源性炎癥,以進一步明確其作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 36只SPF級雄性SD大鼠,體重(200±20)g,4～6周齡,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)2016-0001。普通飼料喂養(yǎng),自由飲水,保持室溫(22±2)℃、濕度(50±10)%。本實驗通過中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院動物實驗倫理研究委員會審核,倫理批準號:2021XLC015-1。

1.2藥物 加味芎蝎散由川芎5 g、全蝎3 g、蘆根20 g、蓽茇1 g、半夏5 g、細辛1 g、五味子10 g、白前10 g組成,所有藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院孫洮玉副教授鑒定為正品。中藥煎藥機煎制,全蝎炮制入藥,制成含生藥量3.0 g/mL的濃縮液。磷酸可待因片(國藥集團工業(yè)有限公司,國藥準字H11020673,規(guī)格:30 mg/片)。

1.3試劑及儀器 紅塔山過濾嘴香煙(焦油含量10 mg、尼古丁含量1.0 mg、CO含量10 mg),紅塔煙草集團;P物質(zhì)(SP)小鼠單克隆抗體(貨號:ab14184)、瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道(TRPV1)小鼠單克隆抗體(貨號:ab203103)、IL-6小鼠單克隆抗體(貨號:ab9324)、TNF-α小鼠單克隆抗體(貨號:ab220210),英國Abcam公司;降鈣素基因相關肽(CGRP)兔單克隆抗體(貨號:#14959)、IL-1β小鼠單克隆抗體(貨號:#12242),美國CST公司;二抗酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(批號:1919D0516),北京中杉金橋生物技術有限公司;TPl020型全自動脫水機、RM2235型組織切片機,德國Leica公司;HI1220烤片機,德國Leica公司;BX53型光學顯微鏡,日本Olymplus公司。

1.4實驗方法 隨機選取6只大鼠作為正常組,剩余大鼠參照文獻[11-12]實驗方法進行咳嗽高敏綜合征造模:每天于固定時間將大鼠放入自制的動物飼養(yǎng)敞箱(長40 cm、寬40 cm、高30 cm),箱子接近頂部同時點燃10支香煙,然后箱子上方蓋上用來封閉的木板,60 min后取出大鼠,該場景用來模擬大鼠的被動吸煙狀態(tài),2次/d,持續(xù)2周后抽取大鼠行咳嗽反應檢測,以確定是否造模成功。將造模成功大鼠隨機分成模型組、加味芎蝎散高劑量組、加味芎蝎散中劑量組、加味芎蝎散低劑量組、磷酸可待因組,每組6只。按照大鼠/人體表面積法換算,加味芎蝎散高、中、低劑量組分別給予加味芎蝎散12 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)、3 g/(kg·d)灌胃,磷酸可待因組給予磷酸可待因10 mg/(kg·d)灌胃,正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃3周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1咳嗽次數(shù) 在灌胃1周、2周、3周末,分別將各組大鼠放入密閉箱內(nèi),霧化吸入濃度104 mol/L的辣椒素溶液,持續(xù)1 min,取出后記錄3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

1.5.2肺組織病理形態(tài) 末次灌胃結(jié)束后,以氯胺酮(3 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,頸椎脫臼法處死,迅速剖取左肺,置入10%中性福爾馬林溶液中固定后,常規(guī)脫水、包埋、切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察。

1.5.3大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞存活狀態(tài) 取大鼠大腦組織,置入10%中性福爾馬林溶液中固定,石蠟包埋,4 μm切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精入水,常溫下用0.1%尼氏染色液染色50 min,染色結(jié)束后流水洗滌、脫水、透明、封片,顯微鏡觀察神經(jīng)細胞染色情況(尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一,廣泛存在于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi),與堿性染料結(jié)合顯示出藍紫色,能反映細胞的存活狀態(tài))。

1.5.4支氣管組織中SP、CGRP、TRPV1蛋白及大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達情況 采用免疫組化法檢測:肺組織及腦組織石蠟切片脫蠟至水后,檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓修復抗原3 min,10% H2O2室溫封閉10 min,PBS洗滌后加入一抗(濃度分別為1∶300,1∶200,1∶100,1∶200,1∶50,1∶200),用PBS代替一抗做陰性對照,4 ℃冰箱孵育過夜。次日PBS充分洗滌后,加入即用型二抗PV6000,室溫孵育30 min,PBS沖洗,DAB顯色,鏡下觀察目標細胞著色情況,自來水終止反應,充分洗滌后蘇木精復染、鹽酸酒精分化、氨水反藍、梯度酒精脫水、封片。在光學顯微鏡下,每張切片選取3個高倍視野,醫(yī)學圖像分析軟件(Image Pro-plus 6.0)分析測定每張圖像的積分光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠咳嗽次數(shù)比較 實驗過程中,正常組大鼠的咳嗽次數(shù)少且未見明顯波動;模型組大鼠灌胃1周、2周、3周末的咳嗽次數(shù)均明顯多于正常組(P均<0.05),且隨時間遷移呈緩慢增多趨勢;加味芎蝎散高、中劑量組及磷酸可待因組大鼠灌胃2周、3周末的咳嗽次數(shù)均明顯少于模型組(P均<0.05),此3個給藥組大鼠的咳嗽次數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);加味芎蝎散低劑量組大鼠的咳嗽次數(shù)有減少,但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)比較次)

2.2各組大鼠肺組織病理形態(tài)比較 正常組大鼠支氣管黏膜結(jié)構(gòu)正常,上皮細胞未見變性,平滑肌排列有序,未見增厚,管壁未見炎細胞浸潤;模型組大鼠支氣管管腔擴張,黏膜上皮輕度變性,平滑肌層增生且排列無序,管壁充血、水腫,可見大量炎細胞浸潤。與模型組比較,各藥物組病變均有不同程度的減輕,其中加味芎蝎散組高、中劑量組黏膜上皮變性明顯減輕,平滑肌組織排列較有序,炎細胞浸潤減少;加味芎蝎散低劑量組與磷酸可待因組炎性反應明顯減輕,黏膜上皮變性及平滑肌增生改變不明顯。見圖1。

圖1 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠肺組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.3各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞存活狀態(tài)比較正常組神經(jīng)元細胞胞體形態(tài)正常,排列均勻,胞質(zhì)豐盈,尼氏體明顯;模型組神經(jīng)元細胞部分分布稀疏,形態(tài)不規(guī)則,尼氏體變少;與模型組比較,各藥物組細胞分布較密集,形態(tài)較規(guī)則,尼氏體增多,以加味芎蝎散組高、中劑量組和磷酸可待因組改善更明顯。見圖2。

圖2 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞存活狀態(tài)(尼氏染色,×200)

2.4各組大鼠支氣管黏膜組織中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達情況比較 SP、CGRP、TRPV1陽性表達呈黃色至棕黃色,主要表達在支氣管黏膜上皮細胞胞漿及胞膜,部分間質(zhì)神經(jīng)纖維及血管內(nèi)皮細胞上亦有表達,本次實驗僅統(tǒng)計黏膜上皮部分。模型組大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達積分光密度值均明顯高于正常組(P均<0.05),加味芎蝎散組高、中劑量組大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表達積分光密度值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3～5及表2。

圖3 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中SP蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

圖4 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中CGRP蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

圖5 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中TRPV1蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

表2 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠支氣管組織中SP、CGRP及TRPV1蛋白表達積分光密度值比較

2.5各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達情況比較 IL-6、IL-1β表達在神經(jīng)細胞胞漿,為黃棕色顆粒狀。模型組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達積分光密度值均明顯高于正常組(P均<0.05),各藥物組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達積分光密度值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖6、圖7及表3。

圖6 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6表達情況(免疫組化染色,×200)

圖7 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-1β表達情況(免疫組化染色,×200)

表3 正常組和咳嗽高敏綜合征各組大鼠大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達積分光密度值比較

3 討 論

咳嗽是呼吸系統(tǒng)重要的防御機制,可以及時清除氣道分泌及呼吸道異物;當其功能失調(diào)時,表現(xiàn)為咳嗽不可抗拒的發(fā)作,甚至對輕微的環(huán)境刺激都產(chǎn)生高敏反應?？人砸呀?jīng)成為全球普遍存在的醫(yī)學問題,亞太國家的一項調(diào)查顯示,約10%的成年人被咳嗽困擾,老年人所占比重較大[13]。一項針對老年人的調(diào)查發(fā)現(xiàn),慢性持續(xù)性咳嗽對精神健康的影響與中風或帕金森病相當[14]。盡管對慢性咳嗽有細致的診療方案,但仍有12%～42%的患者無法解釋病因或難以治愈。此外,缺乏有效和安全的治療咳嗽藥物,歐洲進行的一項調(diào)查研究顯示,慢性咳嗽患者止咳藥治療有效率僅為57%,而無效率達到36%[15],這一數(shù)據(jù)也說明在治療咳嗽方面需要尋求更為有效的治療藥物和治療策略。

咳嗽高敏綜合征概念來源于2014年7月在倫敦舉行的第八屆國際咳嗽會議。傳統(tǒng)觀點認為,咳嗽依托于疾病,通常與其病因密切相關。而咳嗽高敏綜合征概念的基礎是咳嗽神經(jīng)通路,認為疾病僅僅起到觸發(fā)作用,而不是咳嗽的直接原因,強調(diào)咳嗽反射通過外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)共同調(diào)控保持平衡,外周刺激信號主要通過迷走神經(jīng)介導,而大腦中樞在咳嗽反射調(diào)控過程中發(fā)揮著更重要的作用[16]。

辣椒素是辣椒的有效成分,可引起機體疼痛、燒灼感以及咳嗽,研究中一般作為咳嗽的誘發(fā)劑。TRPV1是辣椒素的受體,廣泛存在于氣道壁感覺神經(jīng)元、氣道平滑肌和支氣管黏膜上皮細胞中,其在慢性咳嗽患者中表達增加[17]。最近的一項臨床試驗探討了TRPV1拮抗劑SB-705498對辣椒素誘導咳嗽反應的影響,發(fā)現(xiàn)盡管TRPV1拮抗劑可以降低咳嗽反射對辣椒素的敏感性,但是24 h咳嗽次數(shù)、患者自評咳嗽嚴重程度、咳嗽沖動和咳嗽特異性生活質(zhì)量相對于安慰劑組未見明顯差異[18]。神經(jīng)源性炎癥過程需要神經(jīng)遞質(zhì)介導,SP和CGRP是具有多種生物活性的速激肽,二者可通過刺激感覺神經(jīng)末梢介導神經(jīng)源性炎癥發(fā)生,引起鈣內(nèi)流、支氣管平滑肌收縮、氣道上皮損傷、黏液分泌及血管通透性增加、血漿滲出等多種生物學表現(xiàn)[19-20]。白細胞介素參與機體的炎癥反應、信息傳遞、免疫細胞激活以及介導淋巴細胞增殖和分化等多種作用,IL-6和IL-1β是白細胞介素家族中介導中樞神經(jīng)炎癥的主要促炎分子,據(jù)研究多種中藥或其有效成分可降低IL-6、IL-1β水平,增加皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量,減輕神經(jīng)損傷[21-23]。本實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠出現(xiàn)了病理組織結(jié)構(gòu)性損傷,上皮變性,平滑肌層增生、紊亂,且伴有炎細胞浸潤等;大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞中尼氏體變少;支氣管黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1和大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達上調(diào)。提示煙熏建立的咳嗽高敏綜合征模型可引發(fā)腦組織的功能性損傷,這可能與神經(jīng)炎癥有關,但目前未見到有關咳嗽與腦組織關系的報道,其深層機制有待進一步探索。

中醫(yī)學認為咳嗽屬于“久咳”“頑咳”范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》提出“五臟六腑皆令人咳,非獨肺也”,認為咳嗽作為癥狀,與其他臟器的功能障礙有密切聯(lián)系。中醫(yī)既往對咳嗽辨證分型較多,現(xiàn)刪繁就簡,一般分為外感咳嗽和內(nèi)傷咳嗽兩大類,其病因病機多為外邪所傷,臟腑虛損等而致祛邪不盡,留伏于內(nèi),成為伏邪,復因外邪引動,內(nèi)外合邪,肺氣上逆而作咳嗽[24]。芎蝎散源自宋代陳文中《小兒病源方論》的家傳累世名方,原方為川芎、蓽茇各1兩,蝎稍去毒尖1錢,細辛、半夏各2錢。加味芎蝎散是在前人基礎上加白前、五味子、蘆根等藥而成方,方中川芎活血行氣、祛風止咳;全蝎搜風通絡,以散肺風;配合細辛、蓽茇、半夏溫肺化痰止咳;白前降氣止咳;五味子斂肺止咳;蘆根清肺止咳。該方在臨床使用中療效確切,不良反應率低。本實驗結(jié)果顯示,與模型組比較,加味芎蝎散高、中劑量組大鼠咳嗽次數(shù)明顯減少,病理變化均有不同程度的減輕,支氣管組織中SP、CGRP、TRPV1和大腦皮質(zhì)中IL-6、IL-1β表達積分光密度值均明顯降低。證實加味芎蝎散方可以減少咳嗽高敏綜合征大鼠的咳嗽次數(shù),減輕肺組織炎癥,保護腦神經(jīng)元,下調(diào)神經(jīng)源性炎癥因子表達。

綜上所述,加味芎蝎散方可以抑制咳嗽高敏綜合征大鼠的咳嗽反射,減輕肺組織和腦神經(jīng)元損傷,其作用機制可能與抑制神經(jīng)源性炎癥有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。