標(biāo)本離心時(shí)間對(duì)凝聚胺介質(zhì)法抗體篩檢試驗(yàn)的影響

尹紅怡，劉 靜，劉樂(lè)霞，張 露，劉井東

（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001）

不規(guī)則抗體篩查在目前的臨床實(shí)踐中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，常用的方法有凝聚胺法、經(jīng)典抗人球蛋白法和微柱凝膠法。其中凝聚胺技術(shù)（MPT）因其快速、靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)在臨床檢驗(yàn)工作中被經(jīng)常使用。在日常血清學(xué)試驗(yàn)中，加入凝聚胺試劑（Polybrene 溶液）后離心可使紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性凝集，此種凝集是可逆的，再加入重懸液（Resuspending 液），若標(biāo)本存在不規(guī)則抗體時(shí)則凝集不散開(kāi)，則表明不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；若標(biāo)本存在不規(guī)則抗體則凝集散開(kāi)，則表明不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)結(jié)果為陰性[1]。本研究采用凝聚胺技術(shù)，使用EDTA-2K 抗凝采血管采血，按照貝索凝聚胺介質(zhì)試劑說(shuō)明書(shū)操作，將變量定為離心時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果觀察時(shí)間為2 min，本研究設(shè)計(jì)了5 組試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝聚胺試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率不同，凝集強(qiáng)度也存在差異，詳細(xì)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采集本院2020 年7 月至2023 年6 月年齡段在16 ～72 歲的患者標(biāo)本，共計(jì)7128 例標(biāo)本。對(duì)所有標(biāo)本均進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)，使用微柱凝膠法和凝聚胺法檢測(cè)，凝聚胺法用顯微鏡復(fù)核結(jié)果。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

凝聚胺介質(zhì)試劑（BASO）、抗體篩選紅細(xì)胞試劑盒（上海血液中心）、人不規(guī)則抗體檢測(cè)用3%紅細(xì)胞試劑盒（奧森多）、血型試劑質(zhì)控試劑盒（上海血液中心）、一次性使用試管（KANGJIAN）、單道可調(diào)移液器（大龍）、醫(yī)用離心機(jī)BASO2020-2、醫(yī)用離心機(jī)BY-320A（北京白洋）、抗人球蛋白（IgG）檢測(cè)卡（奧森多）、全自動(dòng)血型分析系統(tǒng)VISIONMax（奧森多）、光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS-CX33）。

1.2.2 檢測(cè)方法

獲取血樣后，采用醫(yī)用離心機(jī)BY-320A 在室溫下以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min 待用。凝聚胺法：（1）取試管三支，共5 組，各加入被檢血漿2 滴，分別加入3%～5%篩檢紅細(xì)胞各1 滴。（2）用移液器各加LIM 0.65 mL 混勻，再各加Polybrene 溶液2 滴，混勻。（3）用BASO離心機(jī)以3400 r/min 轉(zhuǎn)速（相當(dāng)于1000 g 離心力）離心，分別離心10 s、20 s、30 s、45 s、120 s，然后倒掉上清液，不瀝干，使管底殘留0.1 mL 液體。（4）輕搖試管，目測(cè)紅細(xì)胞是否凝集，如無(wú)凝集，則需重做。（5）最后加入Resuspending 液2 滴，輕搖試管使紅細(xì)胞混合并觀察結(jié)果。微柱凝膠法：嚴(yán)格按照全自動(dòng)血液分析系統(tǒng)的檢測(cè)說(shuō)明書(shū)，規(guī)范進(jìn)行上機(jī)操作，檢測(cè)不規(guī)則抗體。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

凝聚胺法陽(yáng)性結(jié)果：凝集不散開(kāi)，仍出現(xiàn)顆粒性或塊狀凝集，是紅細(xì)胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，其中4+為紅細(xì)胞凝集成一大塊，背景清晰；3+為紅細(xì)胞凝集成數(shù)個(gè)小塊，背景尚清晰；2+為紅細(xì)胞凝塊分散成數(shù)個(gè)小塊，背景可見(jiàn)游離紅細(xì)胞；1+為肉眼可見(jiàn)大顆粒，周?chē)休^多游離紅細(xì)胞。鏡下陽(yáng)性：凝集散開(kāi)，滴入玻片用光學(xué)顯微鏡觀察是否凝集，鏡下聚集成團(tuán)狀，是紅細(xì)胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)；陰性結(jié)果：凝集散開(kāi)，滴入玻片用光學(xué)顯微鏡觀察是否凝集，鏡下不凝集表示由Polybrene 溶液引起的非特異性凝集。詳見(jiàn)圖1。質(zhì)控措施：試驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化，確保試驗(yàn)操作步驟的一致性，包括試劑的準(zhǔn)備、滴加順序和數(shù)量、觀察時(shí)間點(diǎn)等。對(duì)照試驗(yàn)：使用已知陽(yáng)性和陰性樣本進(jìn)行對(duì)照，以驗(yàn)證試驗(yàn)過(guò)程的有效性和可靠性。重復(fù)性：對(duì)關(guān)鍵樣本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以確保結(jié)果的一致性和可重復(fù)性。顯微鏡校準(zhǔn)：確保顯微鏡的清晰度和放大倍數(shù)準(zhǔn)確，以便準(zhǔn)確觀察紅細(xì)胞的凝集情況。記錄和報(bào)告：詳細(xì)記錄試驗(yàn)觀察結(jié)果，并在報(bào)告中明確指出凝集的程度和評(píng)級(jí)。微柱凝膠法：以全自動(dòng)血型分析系統(tǒng)判別，并經(jīng)人工審核結(jié)果。

圖1 凝聚胺法結(jié)果判定圖

1.4 觀察指標(biāo)

檢測(cè)后，比較凝聚胺法不同離心時(shí)間的陽(yáng)性檢出率和凝集強(qiáng)度。比較微柱凝膠法與凝聚胺法的檢測(cè)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS 22.0 軟件對(duì)本文數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不規(guī)則抗體靈敏度、結(jié)果的陽(yáng)性率用例數(shù)和%表示，采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝聚胺法不同離心時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果分析

在5 組不同時(shí)間的凝聚胺試驗(yàn)中，離心時(shí)間10 s 時(shí)，陽(yáng)性檢出率77.6%（66/85），20 s 時(shí)，陽(yáng)性檢出率80.0%（68/85），30 s 時(shí)，陽(yáng)性檢出率89.4%（76/85），45 s 時(shí)，陽(yáng)性檢出率84.7%（72/85），120 s 時(shí)，陽(yáng)性檢出率85.9%（73/85），其中χ2值為4.391，P值為0.036。詳見(jiàn)表1。

表1 凝聚胺法不同離心時(shí)間陽(yáng)性率比較[%（例）]

2.2 抗-E 和抗-D 不同離心時(shí)間后強(qiáng)度比較

在血型試劑質(zhì)控試劑盒的抗體凝集強(qiáng)度檢測(cè)時(shí)，其中抗-D 的凝集強(qiáng)度和20 s 組、30 s 組、45 s 組結(jié)果一致，低于120 s 組的結(jié)果；而10 s 組抗-E 的凝集強(qiáng)度是-，20 s 組的凝集強(qiáng)度是+（用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果），直到30 s 組之后三組的凝集強(qiáng)度可以用肉眼直接觀察到明顯的凝集，強(qiáng)度達(dá)到++。詳見(jiàn)表2。由此可見(jiàn)，10 s 的離心時(shí)間不能滿足臨床試驗(yàn)需要。

2.3 血漿微柱凝膠法與凝聚胺法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

檢測(cè)后經(jīng)對(duì)比可知，微柱凝膠法陽(yáng)性例數(shù)82 例，凝聚胺法綜合陽(yáng)性例數(shù)76 例，由表3 計(jì)算可知，兩種方法的真陽(yáng)性率（靈敏度）對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 血漿微柱凝膠法與凝聚胺法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比[%（例）]

3 討論

為保證輸血安全，臨床需要在輸血前進(jìn)行血型檢測(cè)、不規(guī)則抗體篩查、交叉配血試驗(yàn)，其結(jié)果越準(zhǔn)確越能減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生[2]。凝聚胺法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，試驗(yàn)時(shí)間短，這是它的優(yōu)點(diǎn)。本研究中120 s 組的陽(yáng)性檢出率和凝集強(qiáng)度雖然更高，但耗時(shí)長(zhǎng)，不利于發(fā)揮凝聚胺法的優(yōu)點(diǎn)；30 s 組和45 s 組陽(yáng)性率也相對(duì)較高，一些較弱的凝集亦能檢測(cè)出來(lái)，不容易漏檢不規(guī)則抗體，耗時(shí)短，提高了試驗(yàn)的特異性和檢出率，能有效提高輸血治療的安全性[3]。微柱凝膠法操作簡(jiǎn)單，不易受人工因素影響，陽(yáng)性檢出率高，結(jié)果可以長(zhǎng)期保持，易于自動(dòng)化操作，是較為理想的不規(guī)則抗體檢測(cè)方法[4]。我們運(yùn)用血清學(xué)的方法檢測(cè)不規(guī)則抗體，實(shí)際是對(duì)特定抗原抗體的檢測(cè)，通常以凝集強(qiáng)度作為判斷的指標(biāo)，在IgG 類抗體中，除部分抗體如IgG 抗-A、抗-B、抗-D、抗-M等外，大多數(shù)的IgG 類抗體不能使紅細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集，這時(shí)候就需要在試驗(yàn)中加入某種介質(zhì)[5]。通常臨床實(shí)驗(yàn)室使用的方法有凝聚胺法和微柱凝膠法，經(jīng)典抗人球蛋白法操作繁瑣，易受到實(shí)驗(yàn)者的影響，在這里不做研究。凝聚胺是一種高價(jià)陽(yáng)離子季銨鹽多聚物，它溶解后產(chǎn)生的正電荷可以中和紅細(xì)胞膜表面的唾液酸所產(chǎn)生的負(fù)電荷，縮短紅細(xì)胞間距，使紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性凝集[6]。這種非特異性凝集是可逆的，若沒(méi)有不規(guī)則抗體存在，則在加入重懸液后凝集消失；若標(biāo)本中存在不規(guī)則抗體，則凝集不消失。微柱凝膠法是將試驗(yàn)需要用到的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液制作成凝膠，采用微觀柱作為容器灌注，使紅細(xì)胞凝膠顆粒分子過(guò)濾，這樣凝集的紅細(xì)胞便被保留在了微柱中，操作者可通過(guò)肉眼讀取凝集結(jié)果[7]。

分析凝聚胺法和微柱凝膠法可以發(fā)現(xiàn)，微柱凝膠法陽(yáng)性檢出率高于凝聚胺法，且靈敏度也高于凝聚胺法，同時(shí)這兩種檢測(cè)方法都存在假陽(yáng)性。凝聚胺法容易受到冷凝集素、肝素、試劑存放時(shí)間的影響，本次研究均使用EDTA采血管，但如果患者使用了肝素治療，依然可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響[8]。而微柱凝膠法容易受到蛋白凝集和血小板聚集的影響，在交叉配血試驗(yàn)中血小板聚集會(huì)造成假陽(yáng)性，如果受到蛋白凝集的影響，可以在試驗(yàn)過(guò)程中使用生理鹽水稀釋血漿后再進(jìn)行檢測(cè)，以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)[9]。

醫(yī)務(wù)人員要在臨床工作中做好輸血前的篩查試驗(yàn)，不同情況下采用不同的檢測(cè)方法以保證試驗(yàn)的安全性和時(shí)效性。如對(duì)于急診需要緊急輸血的患者，使用微柱凝膠法進(jìn)行交叉配血和抗體篩查，雖然其陽(yáng)性檢出率更高，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。這時(shí)簡(jiǎn)便快速又有效的凝聚胺法就是更好的選擇。對(duì)于通過(guò)輸血來(lái)改善貧血的患者來(lái)說(shuō)，有充足的時(shí)間可以進(jìn)行臨床檢驗(yàn)，這時(shí)微柱凝膠法和凝聚胺法均可采用。對(duì)于需要輸血的兒童，因其ABO 及Lewis 等血型系統(tǒng)未發(fā)育完全，故在使用凝聚胺法檢測(cè)時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。一些血液病患者、長(zhǎng)期輸血患者、多次妊娠者更易產(chǎn)生不規(guī)則抗體，尤其在抗原或抗體較弱時(shí)，這種情況下進(jìn)行抗體篩查時(shí)用微柱凝膠法的檢出陽(yáng)性率更高，而使用凝聚胺法檢測(cè)時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。但對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者，使用CD38 單抗進(jìn)行治療時(shí)，生理鹽水稀釋不能消除微柱凝膠法的假陽(yáng)性結(jié)果，需要進(jìn)行二硫蘇糖醇處理。但此法耗時(shí)長(zhǎng)，易發(fā)生溶血，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用效果不佳。凝聚胺法能夠不受MM 治療藥物和本身蛋白凝集的影響，是較為理想的檢測(cè)方法[10]。

綜上所述，凝聚胺法在臨床輸血治療中是不可或缺的方法之一，其操作便捷、有較高的靈敏度，臨床工作中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的檢測(cè)方法[11-12]。而改良試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)的離心時(shí)間達(dá)到30 s 或45 s，在本次研究的不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)中，能提高凝聚胺法的陽(yáng)性檢出率，有利于提高臨床輸血的安全性。至于相關(guān)的交叉配血試驗(yàn)，推測(cè)也能提高其陽(yáng)性檢出率，但缺乏進(jìn)一步研究試驗(yàn)。