1例由p.Arg35Cys引起遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的研究

唐勇 張福勇 蔣燕珍 吳崇榮 代洪飛 楊紅海

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z20200085）

第一作者簡(jiǎn)介：唐勇，男，副主任技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士， 研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。E-mail：xhero521@163.com

通信作者：楊紅海。E-mail：57179627@qq.com

［本文引用格式］唐勇，張福勇，蔣燕珍，等.1例由p.Arg35Cys引起遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的研究［J］.右江醫(yī)學(xué)，2024，52（3）：215-220.

【摘要】? 目的 ?分析武鳴壯族地區(qū)1例FGA基因雜合突變引起的遺傳性異常纖維蛋白原血癥的表型和基因型，探討其發(fā)病機(jī)制。

方法? 對(duì)先證者家系三代5人進(jìn)行外周血采集，使用凝血分析儀檢測(cè)PT、APTT、FIB、TT等凝血項(xiàng)目，F(xiàn)IB采用PT演算法和Clauss法檢測(cè)；采用DETA抗凝管收集全血，通過(guò)NGS篩選，用Sanger測(cè)序驗(yàn)證FGA、FGB、FGG基因編碼區(qū)突變。

結(jié)果? 先證者及其父親表現(xiàn)出FIB-Clauss法水平降低和凝血酶時(shí)間延長(zhǎng)，而其妹妹和兩個(gè)女兒均正常。高通量基因測(cè)序顯示先證者及其父親檢測(cè)到FGA c.103C>T雜合錯(cuò)義突變，而先證者的妹妹和兩個(gè)女兒未檢測(cè)到該突變。

結(jié)論? 導(dǎo)致該家系成員遺傳性異常纖維蛋白原血癥的分子機(jī)制是FGA c.103C>T雜合錯(cuò)義突變，該突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)中第35位氨基酸由精氨酸變?yōu)榘腚装彼幔╬.Arg35Cys），從而導(dǎo)致遺傳性異常纖維蛋白原血癥。

【關(guān)鍵詞】? 基因突變；家系；遺傳性異常纖維蛋白原血癥

中圖分類號(hào)：R446??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.03.005

A research on 1 case of hereditary abnormal fibrinogenemia family caused by p.Arg35Cys

TANG Yong1， ZHANG Fuyong2， JIANG Yanzhen1， WU Chongrong1， DAI Hongfei1， YANG Honghai1▲

（1. Department of Clinical Laboratory， Nanning Wuming District Hospital of Traditional Chinese

Medicine， Nanning 530199， Guangxi， China; 2. Department of Clinical Laboratory， the First

Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China）

【Abstract】? Objective? To analyze the phenotype and genotype of 1 case of congenital dysfibrinogenemia caused by heterozygous mutation of the FGA gene in Zhuang region of Wuming， so as to explore the pathogenesis of the disease.

Methods? 5 peripheral blood samples from three generations of the proband were collected， and blood coagulation items such as prothrombin （PT）， activated partial thromboplastin（APTT）， fibrinogen （FIB）， and thrombin time （TT） were analyzed by coagulation analyzer， FIB was detected by PT algorithm and Claus method， whole blood was collected by DETA anticoagulant tubes and was screened through NGS， and mutations in the coding regions of the FGA， FGB， and FGG genes were verified by Sanger sequencing.

Results? The proband and his father showed reduced levels of the FIB-Clauss method and prolonged time of thrombin， while his sister and 2 daughters were normal. High-throughput gene sequencing revealed a heterozygous for the FGA c.103 C > T missense mutation detected in the proband and his father， which was not found in the detection of his sister and 2 daughters.

Conclusion? The molecular mechanism that leads to congenital dysfibrinogenemia in members of this family is FGA c.103C>T heterozygous missense mutation， which causes the 35th amino acid in the protein to change from arginine to cysteine （p.Arg35Cys）， resulting in congenital dysfibrinogenemia.

【Keywords】? gene mutation; family; congenital dysfibrinogenemia

遺傳性異常纖維蛋白原血癥（congenital dysfibrinogenemia， CD）是一種遺傳性血液病，由于纖維蛋白原（fibrinogen， FIB）基因缺陷導(dǎo)致FIB分子結(jié)構(gòu)與功能異常，可能引起機(jī)體凝血功能異常。CD患者臨床表現(xiàn)多樣，大部分無(wú)癥狀，少數(shù)出現(xiàn)血栓、出血事件或肺動(dòng)脈高壓等癥狀［1］。CD主要為常染色體顯性或共顯性遺傳，少數(shù)為常染色體隱性遺傳。由于廣泛的臨床癥狀，CD診斷困難［2］，治療方法包括纖維蛋白原替代治療、抗凝、血栓預(yù)防和多學(xué)科團(tuán)隊(duì)方法［3］。目前尚未建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)CD治療方案［2］。本研究發(fā)現(xiàn)1例患者纖維蛋白原異常降低，為探明其原因進(jìn)行家系表型與基因型分析，探討發(fā)病機(jī)制，減少誤診漏診，為該病的研究提供臨床依據(jù)。

1? 對(duì)象與方法

1.1? 對(duì)象

先證者為一名44歲的廣西南寧市武鳴區(qū)壯族男性。入院體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)凝血功能異常，F(xiàn)IB結(jié)果為0.47 g/L， TT為40.4? s，PT演算法纖維蛋白原結(jié)果正常。其血栓彈力圖結(jié)果顯示凝血因子（R）為5.6 min，纖維蛋白原功能（K）為2.9 min，纖維蛋白原功能（ANGLE）為54.6 deg，血小板功能（MA）為56.8 mm，凝血綜合指數(shù)（CI）為-1.4，纖溶指標(biāo)（LY30）為0，纖溶指標(biāo)（EPL）為0，均在正常范圍內(nèi)。肝腎功能、血常規(guī)、D二聚體、纖維蛋白原降解產(chǎn)物（FDP）等結(jié)果均未見異常。體格檢查結(jié)果正常，既往無(wú)滲血不止、出血、黑便、尿血或血栓形成病史，也沒(méi)有家族遺傳病史。其家系圖譜如圖1所示，母親已逝，其資料不詳。

1.2? 方法

1.2.1? 標(biāo)本采集

經(jīng)先證者與家屬簽署知情同意書后，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，采集先證者及先證者的父親、妹妹、兩個(gè)女兒空腹外周靜脈血標(biāo)本各2 mL和4 mL分別置于4支試管。其中1管用枸櫞酸鈉抗凝，分別進(jìn)行凝血相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)；另2管用EDTA抗凝進(jìn)行血常規(guī)項(xiàng)目以及基因項(xiàng)目檢測(cè)，并將該家系的血樣本放置于-80 ℃的冰箱中冰凍保存；4 mL促凝管用于生化項(xiàng)目肝功能檢測(cè)。

1.2.2? 凝血項(xiàng)目檢測(cè)

將收集好的先證者以及家屬的凝血標(biāo)本離心后，按照儀器操作說(shuō)明書使用法國(guó)STA-MAX全自動(dòng)血凝分析儀及其配套試劑進(jìn)行凝血相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)（分析儀及其配套試劑需進(jìn)行質(zhì)控）；SYSMEX CS 2000i全自動(dòng)血凝分析儀及其配套試劑通過(guò)PT演算法測(cè)定FIB結(jié)果。

1.2.3? 血常規(guī)檢測(cè)

將收集好的先證者和家屬的血常規(guī)標(biāo)本混合后，按照儀器操作說(shuō)明書，使用MEK9100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及其配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4? 肝功能檢測(cè)

收集好的先證者及其家屬促凝管標(biāo)本離心分離血清后，使用日立LABOSPECT 008AS全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5? 基因檢測(cè)

將存放在 -80 ℃ 的血樣本送至武漢華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，使用Life Technologies 公司 Ion Torrent PGM 高通量測(cè)序儀篩選 FGA、FGB、FGG 基因編碼區(qū)及其上下游 5bp 范圍內(nèi)的點(diǎn)突變和微小插入/缺失，并使用 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證突變。

參考序列：

FGA：GRCh38， Chromosome 4，NC_000004.12， NM_000508.4；

FGB：GRCh38， Chromosome 4，NC_000004.12， NM_005141.4；

FGG：GRCh38， Chromosome 4，NC_000004.12， NM_000509.5。

參考數(shù)據(jù)庫(kù)：

The Genome Aggregation Database （gnomAD）： http：//gnomad.broadinstitute.org/；

Human Gene Mutation Database （HGMD）：http：//www.hgmd.cf.ac.uk/。

1.2.6? 蛋白模型構(gòu)建

為了描述突變體FIB蛋白的三維結(jié)構(gòu)變化，首先在NCBI上搜索FGA基因的氨基酸序列，將該序列導(dǎo)入SWISS-MODEL生成其野生型分子模型。接著將序列中的第35位氨基酸Arg修改為突變的Cys，再次導(dǎo)入上述工具生成突變型分子模型。最后，使用Swiss-PdbViewer v4.1軟件對(duì)野生型和突變型的分子蛋白模型進(jìn)行評(píng)估。

2? 結(jié)? 果

2.1? 血常規(guī)、肝功能、凝血項(xiàng)目

先證者以及家屬血常規(guī)、肝功能、D二聚體和FDP檢查結(jié)果均正常，因肝臟疾病引起的FIB缺陷以及纖溶亢進(jìn)引起的FIB消耗可以排除。先證者的妹妹及女兒凝血功能各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；而先證者與其父親PT結(jié)果均為輕度延長(zhǎng)，TT結(jié)果延長(zhǎng)，F(xiàn)IB-Clauss法結(jié)果降低，F(xiàn)IB演算法結(jié)果正常。具體結(jié)果見表1，表2，表3。

2.2? 基因檢測(cè)結(jié)果

先證者及其父親FIB FGA基因中發(fā)現(xiàn)了c.103C>T雜合錯(cuò)義突變。該突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)第35位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔╬.Arg35Cys）。值得注意的是，先證者的妹妹和女兒的基因結(jié)果均為正常，未檢測(cè)到任何異常突變。據(jù)gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，該突變?cè)谌巳褐械念l率為3.23E-05，在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中也有相關(guān)病例報(bào)道（CM930249）。綜合考慮，該突變被認(rèn)為具有可能致病性。具體的檢測(cè)結(jié)果見表4，測(cè)序結(jié)果見圖2和圖3。

2.3? 突變蛋白分子建模

對(duì)p.Arg35Cys 突變的分子模型和結(jié)構(gòu)分析，圖4A 中白色箭頭所指的是野生型 FIB 蛋白 Aα 的第35位氨基酸精氨酸（Arg）。該氨基酸突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）后，蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變（圖4B 紅色箭頭所指），可能影響凝血酶對(duì)纖維蛋白原肽 A 的裂解，導(dǎo)致纖維蛋白肽 A 的釋放延長(zhǎng)或出現(xiàn)缺陷。

3? 討? 論

纖維蛋白原，又稱凝血因子Ⅰ，主要由肝細(xì)胞分泌［4］。其分子量為340 kD的糖蛋白，能相互結(jié)合形成纖維蛋白凝塊并介導(dǎo)血小板聚集，在維持機(jī)體止凝血平衡方面發(fā)揮著重要作用［5］。FIB異常性疾病通?？煞譃閮深悾阂活愂撬幬镆鸬墨@得性異常，另一類是由FIB編碼基因缺陷引起的遺傳性凝血功能異常疾病［6］。遺傳性的FIB異常相對(duì)較罕見，發(fā)病率約為1/106，可分為兩種類型［7］：Ⅰ型為FIB水平降低或缺陷，包括低纖維蛋白原血癥和無(wú)纖維蛋白原血癥；Ⅱ型為FIB分子結(jié)構(gòu)或功能異常，包括低異常纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥［8］。CD屬于Ⅱ型纖維蛋白原缺陷癥。

FIB是由多肽鏈Aα、Bβ、γ構(gòu)成的二聚體［9］，同源基因FGA、FGB和FGG按順序編碼形成FIB的3條肽鏈［5］，編碼基因如出現(xiàn)大片段缺失、框移突變、無(wú)義突變、錯(cuò)義突變等缺陷可導(dǎo)致FIB分子結(jié)構(gòu)和功能異常，導(dǎo)致纖維蛋白單體聚合障礙、ⅩⅢ因子介導(dǎo)的交聯(lián)障礙或纖維蛋白肽A/B釋放障礙［10］。本家系先證者在入院體檢凝血檢查中發(fā)現(xiàn)PT 19.7 s，APTT 36.2 s，F(xiàn)IB 0.47 g/L，TT 40.4 s，除FIB活性明顯降低、TT延長(zhǎng)外，無(wú)其他臨床癥狀。基因檢測(cè)結(jié)果顯示患者FIB的FGA基因發(fā)生c.103C>T雜合錯(cuò)義突變，并導(dǎo)致第35位氨基酸從精氨酸突變成半胱氨酸（p.Arg35Cys）。據(jù)研究顯示α鏈上凝血酶裂解位點(diǎn)是R35，錯(cuò)義突變是該點(diǎn)位常見突變之一，從而引起了異常纖維蛋白原血癥［11］。從纖維蛋白原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//site.geht.org/base-de-donnees-fibrinogene/）也可以證實(shí)。此外，該突變可導(dǎo)致纖維蛋白肽A釋放延長(zhǎng)或缺陷，以及隨后的多聚化延遲，最終導(dǎo)致FIB出現(xiàn)異常和TT延長(zhǎng)，臨床上常無(wú)血栓或出血表現(xiàn)［6］。該家系中的先證者臨床癥狀與研究一致。

前期研究表明，女性CD患病率高于男性。這可能是因?yàn)榕酝ǔ１仨毥邮艹Ｒ?guī)術(shù)前檢查，如妊娠和產(chǎn)科手術(shù)，從而更容易發(fā)現(xiàn)凝血功能異常并就診［9］。本研究對(duì)先證者及其父親、妹妹和女兒進(jìn)行了相關(guān)項(xiàng)目檢查。結(jié)果顯示先證者及家系成員的血常規(guī)和肝功能正常，排除了因肝臟疾病引起的FIB缺陷，D-二聚體和FDP也正常，排除了因纖溶亢進(jìn)導(dǎo)致的FIB消耗。凝血功能結(jié)果顯示家系中的女兒和妹妹正常，而先證者及其父親的PT略有延長(zhǎng)，TT延長(zhǎng)，F(xiàn)IB活性降低。基因檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)僅其父親的FIB FGA基因c.103C>T存在雜合錯(cuò)義突變，而妹妹和女兒的基因正常，未出現(xiàn)突變。MOSESSON等發(fā)現(xiàn)［12］，F(xiàn)IB中的Arg變?yōu)镃ys可增加患者血栓形成的易感性。然而，本研究暫未發(fā)現(xiàn)先證者及家系成員出現(xiàn)血栓。但統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，CD患者發(fā)生靜脈血栓的中位年齡為34歲，而發(fā)生動(dòng)脈血栓的中位年齡為49歲［13］，大出血主要發(fā)生在20～40歲［14］。因此，仍需要警惕該先證者發(fā)生血栓和出血風(fēng)險(xiǎn)，并需要長(zhǎng)期進(jìn)行血液科隨訪。FIB基因分析是診斷CD的重要手段，但檢出FIB相關(guān)基因突變并不等于確診CD，也可見于遺傳性低（無(wú)）纖維蛋白原血癥。因此，確診CD尚需結(jié)合FIB的Clauss法和PT演算法結(jié)果，以及患者的臨床表現(xiàn)和家系調(diào)查綜合診斷。故該病容易漏診、誤診。特別是僅單獨(dú)采用Clauss法檢測(cè)FIB水平常導(dǎo)致該病易被誤診為遺傳性低纖維蛋白原血癥。一些患者在受到創(chuàng)傷時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的出血或血栓，甚至危及生命或死亡［15］。通過(guò)對(duì)該病的認(rèn)知，有助于提升臨床診療水平，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并干預(yù)，避免誤診和漏診。

本研究樣本來(lái)源為受檢者血液或體細(xì)胞，而非生殖細(xì)胞，因此不能排除嵌合現(xiàn)象所致的解讀偏差。如果檢測(cè)結(jié)果提示為自發(fā)變異位點(diǎn)，該情況下并不排除父母生殖腺嵌合變異的存在。由于人類疾病認(rèn)識(shí)的局限性和本檢測(cè)Panel所包含基因數(shù)量的限制，如未檢出FGA、FGB、FGG基因的致病位點(diǎn)，即為陰性結(jié)果，但并不能排除患遺傳性異常纖維蛋白原血癥的可能性。由于對(duì)基因認(rèn)識(shí)的不足，對(duì)檢出的特定基因突變，在某些情況下可能并非引起該疾病的致病突變，尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

綜上所述，通過(guò)本家系的研究，了解其分子發(fā)病機(jī)制、表型與基因的相關(guān)性，為臨床對(duì)該病的診斷以及治療提供重要的依據(jù)。

參? 考? 文? 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-05-10? 修回日期：2023-09-28）

（編輯：梁明佩）