超臨界CO2萃取石榴籽油及石榴酸甲酯富集

任小娜，李興梅，吳江超，庫(kù)爾班江·艾買提

（1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院,新疆喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆喀什 844000）

石榴為落葉喬木或灌木,是一種傳統(tǒng)的石榴科水果作物[1]。石榴目前在我國(guó)已大面積種植。石榴籽是石榴加工業(yè)的副產(chǎn)物,約占石榴果實(shí)質(zhì)量的12%[2]。石榴籽中含有豐富的油脂類成分,為15%～20%[3],可進(jìn)一步加工制得石榴籽油,其油脂中不飽和脂肪酸含量可達(dá)90% 多[4],石榴酸含量為64%～83%[5]。石榴酸具有“超級(jí)共軛亞油酸”之稱,研究表明石榴酸具有抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功能,有助于預(yù)防和治療肥胖、糖尿病、癌癥和心腦血管疾病等病癥[6-8]。Kohno 等[9]研究發(fā)現(xiàn)石榴籽油可以抑制氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的結(jié)腸腺癌的進(jìn)程,同時(shí)可以減少癌的多重性。Gasmi 等[10]研究表明石榴酸是通過抑制細(xì)胞中的芳香酶抑制類固醇生成。石榴酸還可抑制雌激素反應(yīng)性和雌激素非反應(yīng)性細(xì)胞系中的乳腺癌細(xì)胞增殖[11]。若將石榴籽油中以甘三酯形式存在的石榴酸轉(zhuǎn)換成單酯,便可通過相關(guān)的手段對(duì)石榴酸進(jìn)行富集純化,還有利于增加其穩(wěn)定性。

超臨界CO2萃取技術(shù)具有萃取效率高、安全無毒、萃取劑可以重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn),且CO2具有化學(xué)惰性,能夠很好的保護(hù)不飽和脂肪酸的活性。尿素包合法根據(jù)長(zhǎng)碳鏈脂肪酸的不飽和度實(shí)現(xiàn)對(duì)不飽和脂肪酸的分離、提純,其設(shè)備簡(jiǎn)單、條件溫和、可有效保護(hù)多不飽和脂肪酸的活性,是富集多不飽和脂肪酸的理想方法[12-13]。目前關(guān)于超臨界CO2萃取石榴籽的研究多集中在萃取工藝的研究和萃取油脂的理化性質(zhì)分析,伍亞華等[14]研究得到了超臨界CO2萃取石榴籽油的最佳工藝,僅對(duì)油脂的理化性質(zhì)和體外抗氧化特性進(jìn)行了研究。余瑤盼[15]采用分子蒸餾法從石榴籽油中制備高純度石榴酸乙酯,研究了分子蒸餾法純化石榴酸乙酯的工藝和乙酯的轉(zhuǎn)化率,制備出高純度石榴酸乙酯并對(duì)石榴酸乙酯的抗氧化活性進(jìn)行了研究。尿素包合法是近年來應(yīng)用的分離植物油混合脂肪酸的一個(gè)重要研究方法,此法可以按脂肪酸不飽和程度的差異對(duì)脂肪酸混合物進(jìn)行分離,能夠比較完整地保留物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)和生物活性,可保護(hù)雙鍵不受空氣氧化。本研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)從石榴籽中提取石榴籽油,對(duì)提取油脂的脂肪酸和甘三酯組成和含量進(jìn)行分析；對(duì)商品石榴籽油酯化處理,通過單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)研究尿素包合法富集石榴酸甲酯的最優(yōu)工藝,提升石榴酸甲酯的含量,以期為石榴酸甲酯的純化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜石榴籽:產(chǎn)于新疆喀什；商品石榴籽油:廣州合誠(chéng)三先生物科技有限公司；正己烷、乙腈、異丙醇（均為色譜純）、尿素、乙醚、石油醚（沸程30～60 ℃）、95% 乙醇、甲醇、酚酞、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、淀粉、硫代硫酸鈉、NaOH、無水Na2SO4（均為分析純）:天津市鑫鉑特化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA）:上海亞榮生化儀器廠；電子天平（LE204E/02）:梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；比較測(cè)色儀（WSL-2）:上海昕瑞儀器儀表有限公司；氣相色譜儀（Trace1300）:美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1290-6545）:美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶劑萃取法制備石榴籽油

將石榴籽清洗,在30 ℃烘箱中烘36 h,然后破碎,用20 目篩網(wǎng)過濾。采用索氏抽提法,沸程30～60 ℃的石油醚作為溶劑,提取石榴籽油。

1.3.2 超臨界CO2法萃取石榴籽油

超臨界CO2萃取石榴籽油參照伍亞華等[14]的方法,略加改動(dòng):萃取壓力30 MPa,萃取溫度30 ℃,萃取時(shí)間30 min。

1.3.3 脂肪酸組成分析及含量測(cè)定

甲酯化方法:參照李桂華[16]的方法進(jìn)行簡(jiǎn)易堿式甲酯化。

脂肪酸組成及分析:參考仲雪娜等[17]的氣相色譜法。

1.3.4 甘三酯成分及含量測(cè)定

將25 mg 的油脂溶解在15 mL 的異丙醇中制備油樣,使用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography,HPLC）系統(tǒng)進(jìn)行分析,并配備四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（quadrupole time of flight mass spectrometer,QToF-MS）。采用Thermo Hypersil Gold 色譜柱（2.1 mm×100 mm,1.9μm）。流動(dòng)相A 為乙腈/甲醇/水（19∶19∶2,體積比）,流動(dòng)相B 為異丙醇。

質(zhì)譜檢測(cè)器（mass spectrum,MS）設(shè)置為正離子ESI模式。氣體溫度為300 ℃,干燥氣體流速為10 L/min,霧化器壓力設(shè)定為207 kPa,毛細(xì)管電壓為4 000 V,掃描范圍為m/z 200～1 500。采用定性分析B.07.00 系統(tǒng)（Agilent）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 石榴籽油理化指標(biāo)測(cè)定

酸值:參考GB 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中酸價(jià)的測(cè)定》。

過氧化值:參考GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測(cè)定》。

色澤:參考GB/T 22460—2008《動(dòng)植物油脂羅維朋色澤的測(cè)定》。

1.3.6 石榴籽油脂肪酸甲酯的制備

稱取一定量的商品石榴籽油加入到燒瓶中于60 ℃攪拌預(yù)熱。然后加入NaOH（油質(zhì)量的0.5%）和甲醇,在70 ℃回流反應(yīng)2.5 h。然后將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,靜置分層去除下層溶液,將上層溶液用70 ℃蒸餾水多次洗滌至中性,減壓旋蒸即可得到石榴籽油脂肪酸甲酯。

1.3.7 尿素包合法富集石榴酸甲酯

以尿素包合溫度、包合時(shí)間、尿素和95% 乙醇質(zhì)量比以及尿素和脂肪酸甲酯質(zhì)量比為單因素,設(shè)置單因素試驗(yàn)。稱取一定質(zhì)量的尿素和95% 乙醇于燒瓶中,并在80 ℃下攪拌加熱回流溶解尿素。稱20 g 石榴籽油脂肪酸甲酯加入到燒瓶中回流1 h。將混合液轉(zhuǎn)移至燒杯中,在特定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行包合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,采用減壓抽濾分離濾液和尿素包合物。濾液用熱水多次洗滌去除尿素和甲醇,最后減壓脫水得到富集的石榴酸甲酯。石榴酸甲酯得率（D,%）按照以下公式計(jì)算。

式中:m為富集的石榴酸甲酯質(zhì)量,g；x1為包合后濾液中石榴酸甲酯的含量,%；x2為脂肪酸甲酯中石榴酸甲酯的含量,%。

1.3.8 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以石榴酸甲酯含量為指標(biāo),設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)尿素包合工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal optimization experiment

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性分析采用SPSS 18 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴籽油的脂肪酸和甘三酯分析

溶劑（石油醚）萃取和超臨界CO2萃取喀什甜石榴籽油的主要脂肪酸及其含量見表2。

表2 溶劑萃取法和超臨界CO2 法萃取石榴籽的主要脂肪酸組成及含量Table 2 Composition and content of main fatty acids in pomegranate seeds by solvent extraction and supercritical CO2 extraction

由表2 可知,兩種萃取方法對(duì)石榴籽油的脂肪酸組成影響不大,主要均為石榴酸、亞油酸、油酸、硬脂酸和棕櫚酸。兩種方法提取的石榴籽油中棕櫚酸、硬脂酸的含量差異不顯著（P>0.05）,油酸、亞油酸和石榴酸的含量有極顯著差異（P<0.01）,石油醚萃取和超臨界CO2萃取所得的石榴酸含量分別為61.75% 和71.09%,說明超臨界CO2萃取方法可以顯著提升油脂中石榴酸的含量,與王林林等[18]的研究結(jié)果一致。

超臨界CO2提取的石榴籽油的主要理化指標(biāo)如表3 所示。

表3 超臨界CO2 法萃取石榴籽油的主要理化指標(biāo)Table 3 Main physicochemical indexes of pomegranate seed oil by supercritical CO2 extraction

由表3 可知,超臨界CO2提取的石榴籽油酸價(jià)符合GB 2716—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)植物油》中對(duì)于酸價(jià)的要求（≤3 mg/g）,而過氧化值指標(biāo)略高于對(duì)于過氧化值的要求（≤0.25 g/100 g）,這可能是由于超臨界CO2提取的石榴籽原油未進(jìn)行保鮮處理,且其中富含多不飽和脂肪酸,在儲(chǔ)藏過程中易發(fā)生氧化所致。

超臨界CO2法萃取石榴籽油的主要甘三酯組成及含量見表4。

表4 超臨界CO2 法萃取石榴籽油的主要甘三酯組成及含量Table 4 Composition and content of main triglycerides in pomegranate seed oil by supercritical CO2 extraction

由表4 可知,共檢測(cè)出14 種甘三酯,其中PuPuPu含量最高,為19.73%,其次為PuPuS（15.98%）、PuPuO（15.42%）和PuPuL（15.23%）,4 種甘三酯的含量之和為66.36%。石榴籽油中的甘三酯主要以三不飽和脂肪酸甘三酯為主,含量可達(dá)52.47%,其次是二不飽和單飽和脂肪酸甘三酯,為41.68%,由于石榴籽油中不飽和脂肪酸含量達(dá)到90%以上,因此二飽和單不飽和甘三酯和三飽和甘三酯含量很少,不到10%。

2.2 尿素包合法富集石榴酸甲酯

2.2.1 石榴籽油及其脂肪酸甲酯的脂肪酸組成對(duì)比分析

石榴籽油及其脂肪酸甲酯的脂肪酸組成和相對(duì)含量見表5。

表5 石榴籽油及其脂肪酸甲酯中脂肪酸組成、含量及甲酯化率Table 5 Composition，content and methyl ester rate of pomegranate seed oil and its fatty acid methyl ester

由表5 可知,甲酯化前后兩者的脂肪酸組成一致,對(duì)甲酯化前后脂肪酸組成數(shù)據(jù)采用SPSS 18 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,石榴籽油和其甲酯化后產(chǎn)品中的各脂肪酸相對(duì)含量沒有顯著差異（P>0.05）,說明本研究采用的甲酯化方法基本上將石榴籽油中的甘三酯完全甲酯化,不會(huì)影響石榴籽油中各脂肪酸的相對(duì)含量,石榴籽油甲酯可以作為尿素包合法富集石榴酸甲酯的原料。

2.2.2 包合溫度對(duì)包合反應(yīng)的影響

包合溫度對(duì)石榴酸甲酯含量及得率的影響如圖1所示。

圖1 包合溫度對(duì)包合反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of inclusion temperature on inclusion reaction

由圖1 可知,隨著包合溫度的升高,石榴酸甲酯的含量和得率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。石榴酸甲酯的得率在-5 ℃時(shí)達(dá)到最大,為24.42%。當(dāng)包合溫度太低時(shí)會(huì)導(dǎo)致尿素迅速結(jié)晶,飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸甲酯不能被完全包埋進(jìn)去。同時(shí),含量高的石榴酸甲酯也可能被尿素晶體夾帶,所以在較低的包合溫度下石榴酸甲酯的含量降低；包合溫度太高時(shí),尿素的結(jié)晶量減少,包合反應(yīng)效果差。在包合溫度為5 ℃時(shí),石榴酸甲酯的含量達(dá)到最高,為82.14%。綜合石榴酸甲酯的含量和得率兩個(gè)因素考慮,選擇包合溫度為0、5、10 ℃進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 尿素和脂肪酸甲酯質(zhì)量比對(duì)包合反應(yīng)的影響

尿素和脂肪酸甲酯質(zhì)量比對(duì)石榴酸甲酯含量及得率的影響見圖2。

圖2 尿素和脂肪酸甲酯質(zhì)量比對(duì)包合反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of ratio of urea to methyl ester on inclusion reaction

由圖2 可知,隨著尿素用量的增加,石榴酸甲酯的含量和得率均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。在尿素和脂肪酸甲酯質(zhì)量比為0.5∶1 時(shí),石榴酸甲酯的含量和得率最高,分別為78.24%和41.11%,與曹少謙等[19]的研究不同。這可能是因?yàn)槭褡延椭酗柡椭舅岬暮康?不足10%,因此包合試驗(yàn)需要的尿素量很少。增加尿素的含量會(huì)造成尿素過量,使包合反應(yīng)容易向逆反應(yīng)進(jìn)行,同時(shí),在抽濾時(shí)石榴酸甲酯也會(huì)被夾帶出去,因此得率和含量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。因此,選擇尿素和脂肪酸甲酯0.3∶1、0.5∶1、1.0∶1 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4 包合時(shí)間對(duì)包合反應(yīng)的影響

包合時(shí)間對(duì)石榴酸甲酯含量及得率的影響見圖3。

圖3 包合時(shí)間對(duì)包合反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of inclusion time on inclusion reaction

由圖3 可知,隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng),石榴酸甲酯含量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)。在包合時(shí)間為15 h 時(shí),石榴酸甲酯含量達(dá)到最大值,為78.02%。這是因?yàn)槭褡延椭惺袼岬暮扛?在較短的時(shí)間基本上就可以完成對(duì)飽和脂肪酸甲酯的包合,若再繼續(xù)延長(zhǎng)包合反應(yīng)的時(shí)間,尿素晶體增加,在抽濾時(shí)可能會(huì)夾帶石榴酸甲酯[20]；包合反應(yīng)是平衡反應(yīng),過長(zhǎng)的包合時(shí)間也會(huì)讓反應(yīng)向解包合反應(yīng)方向進(jìn)行,造成石榴酸甲酯的含量和得率的降低。在包合時(shí)間為25 h 時(shí),雖然石榴酸甲酯的得率相對(duì)較高,但是含量較低,綜合考慮,選擇包合時(shí)間10、15、20 h 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.5 尿素和95%乙醇質(zhì)量比對(duì)包合反應(yīng)的影響

尿素和95% 乙醇質(zhì)量比對(duì)石榴酸甲酯含量及得率的影響見圖4。

圖4 尿素和95%乙醇質(zhì)量比對(duì)包合反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of ratio of urea to 95% ethanol on inclusion reaction

由圖4 可知,當(dāng)尿素和95% 乙醇質(zhì)量比為1∶4時(shí),石榴酸甲酯的含量最高,為79.04%。此時(shí)石榴酸甲酯也有較好的得率,為49.90%。這是因?yàn)楫?dāng)95%乙醇的用量少時(shí),尿素不能完全溶解,包合效果不好,因混合脂肪酸中石榴酸甲酯的含量較高,在抽濾時(shí)尿素晶體也會(huì)夾帶石榴酸甲酯；當(dāng)乙醇過量時(shí),尿素濃度偏低,使包合反應(yīng)向逆反應(yīng)進(jìn)行,造成石榴酸甲酯的含量偏低[21]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,綜合經(jīng)濟(jì)性因素,選擇尿素和95%乙醇質(zhì)量比1∶3、1∶4、1∶5 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以石榴酸甲酯含量為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)確定最優(yōu)尿素包合條件。正交試驗(yàn)及結(jié)果見表6。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of orthogonal optimization experiment

由表6 可知,4 個(gè)影響因素中對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大的是包合時(shí)間,其次是尿素與脂肪酸甲酯質(zhì)量比,再次是包合溫度,影響最小的則是尿素與95%乙醇質(zhì)量比。根據(jù)正交試驗(yàn)可知尿素包合試驗(yàn)的最優(yōu)組合為尿素包合溫度為5 ℃,包合時(shí)間為20 h,尿素與脂肪酸甲酯的質(zhì)量比為1.0∶1,尿素和95%乙醇的質(zhì)量比為1∶5。在最優(yōu)條件下通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到石榴酸甲酯的得率為39.2%,石榴酸甲酯的含量為78.82%,與未包合前相比,石榴酸含量提高了10.06%。余瑤盼等[22]使用分子蒸餾法在最佳的工藝條件下將石榴酸乙酯的含量提高了14.55%,純度達(dá)到95.23%。本研究采用的尿素包合法成本低、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和,但富集后產(chǎn)品中石榴酸甲酯的純度不如分子蒸餾法。這可能是因?yàn)槭褡延椭惺袼岬暮枯^高,已超過60%,尿素包合法和分子蒸餾的分離原理的差異,導(dǎo)致尿素包合法富集的石榴酸甲酯的純度不如分子蒸餾法。

3 結(jié)論

超臨界CO2萃取的石榴籽油的主要脂肪酸組成與有機(jī)溶劑（石油醚）萃取和市售商品石榴籽油相一致,但其石榴酸含量為71.09%,高于二者中石榴酸含量,表明超臨界CO2萃取技術(shù)可以獲得石榴酸含量相對(duì)高的石榴籽油。在超臨界CO2萃取的石榴籽油中檢測(cè)出14 種甘三酯成分,三不飽和脂肪酸甘三酯占50%以上,其中PuPuPu 含量最高,為19.73%。通過單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn),對(duì)石榴籽油脂肪酸甲酯進(jìn)行尿素包合富集研究,得到最佳的富集工藝,即尿素包合溫度為5 ℃,包合時(shí)間為20 h,尿素與脂肪酸甲酯的質(zhì)量比為1.0∶1,尿素和95%乙醇的質(zhì)量比為1∶5。在最佳的富集工藝條件下石榴酸甲酯含量為78.82%,提高了10.06%。本研究中尿素包合法操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件溫和,但是富集的石榴酸甲酯的得率仍有進(jìn)一步提升的空間。