美樂桃紅貴腐葡萄酒的釀造及感官特征分析

屈嘉燕，周潤宇，繆成鵬，王群力，張曉紅，高邦牢，江理廣，惠竹梅，4*，王雪飛，4*

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2.山西戎子酒莊有限公司，山西鄉(xiāng)寧 042100；3.福建藍家渡酒莊有限公司，福建上杭 364200；4.陜西葡萄與葡萄酒工程中心，陜西楊凌 712100)

貴腐葡萄酒又稱“液體黃金”，是用灰霉菌侵染的成熟葡萄果實釀造而成的高端甜型葡萄酒，其香氣復雜濃郁、口感甜美、風味獨特，具有較高的產品附加價值[1-2]。貴腐葡萄原料產生的自然條件較為苛刻，需在溫差較大的河流交會山谷處產生，且感染時機難以控制。世界上的自然貴腐酒大多數產自歐洲[3]，著名的貴腐酒有法國波爾多產區(qū)的蘇玳（Sauternes）、匈牙利托卡伊（Tokaji）產區(qū)的奧蘇（Aszú）、德國精選干甜葡萄特級優(yōu)質酒（Trockenbeerenausless）等[4]。

在灰霉菌成功侵染葡萄果實后，早上潮濕的氣候有利于灰霉菌生長，中午過后的干熱天氣使得葡萄果實中的水分從侵染的小孔處蒸發(fā)。在這種獨特的條件下，葡萄漿果逐漸干縮，糖、酸和香氣物質等也得到進一步濃縮[5-6]，最終賦予新鮮葡萄酒柑橘和干果風味，賦予陳年葡萄酒橘皮風味并伴有蜂蜜或者蠟狀的特征[7]。由于自然貴腐作用對氣候條件要求苛刻，且除歐洲傳統(tǒng)的優(yōu)質貴腐酒產區(qū)外，世界上其他的葡萄酒產區(qū)很難發(fā)生自然貴腐作用[8]，這極大的提高了貴腐酒的生產和釀造成本，限制了貴腐酒的產量和消費市場，導致其難以成為大眾消費品。

針對自然貴腐酒對氣候條件的高要求、釀造的高成本以及潛在的市場需求，人工貴腐酒的釀造方法得以研究并取得了一定進展。Sivertsen 等[9]和Magyar 等[10]在成熟或采摘后的葡萄果實表面人工噴灑灰霉菌孢子懸液獲得兩種人工貴腐葡萄原料。Tosi 等[11]將新采摘的葡萄依次進行人工灰霉菌孢子懸液噴灑處理和干化處理，最后對所釀葡萄酒進行香氣分析，發(fā)現(xiàn)灰霉菌的侵染水平和葡萄的干化程度對貴腐酒中揮發(fā)性物質的影響較大，灰霉菌的侵染和干化過程使葡萄酒中酯類、內酯類、萜烯類、C13-去甲類、異戊二烯類、醛酮類和酚類物質等總量增加，且經灰霉菌感染后葡萄汁的酯酶活性升高，貴腐酒中酯類物質的總含量降低。陶永勝等[12]采用人工接種葡萄果實和葡萄汁的方法來釀造貴腐酒，結果表明使用人工貴腐葡萄和人工貴腐葡萄汁所釀酒中的高級醇質量濃度較小，人工貴腐葡萄所釀酒中含有γ-癸內酯、苯乙酸和2-壬酮等特殊香氣物質，人工貴腐葡萄汁所釀酒的香氣更為復雜和典型，具有明顯的焦糖、甜杏、芒果、烘烤等特征。

我國葡萄酒產品以干型酒為主，甜型酒較少，貴腐葡萄酒極少且未能實現(xiàn)批量生產[8，13]，人工貴腐酒生產在我國具有良好的發(fā)展前景。從現(xiàn)有研究來看，前人研究主要集中于人工貴腐葡萄酒的釀造過程及其品質特征分析，未有研究桃紅貴腐葡萄酒產品的報道。因此，本研究在總結前人的研究成果上加以創(chuàng)新，采用人工接種灰霉菌孢子懸液的方式制備貴腐葡萄果實，結合釀造工藝的技術要點進行小容器釀造，通過理化指標檢測、香氣成分分析和感官品鑒，評價桃紅貴腐葡萄酒的品質特征與釀造工藝的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料菌種：健康和自然貴腐的“美樂”（Merlot）葡萄于2021 年9 月采自山西戎子酒莊葡萄園，采后立刻運回實驗室進行處理；灰霉菌（Botrytis cinerea）保藏于西北農林科技大學葡萄酒學院。

PDA 培養(yǎng)基[12]：土豆汁質量分數20 %、葡萄糖質量分數1.6%、瓊脂粉質量分數2%、硫酸鎂質量分數0.05%、磷酸二氫鉀質量分數0.1%。

儀器設備：GC/MS-QP2020 型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，日本島津公司；安東帕Lyza 5000 葡萄酒分析儀，奧地利安東帕公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰霉菌孢子懸液的制備

灰霉菌孢子懸液的制備參考陶永勝等[14]的方法，略作修改。具體方法為：將灰霉菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，用牙簽挑取菌絲于50 mL離心管中，加入20 mL 無菌水，8000 r/min 渦旋1 min，隨后用4層紗布過濾，將濾液轉入新的50 mL 離心管中，使用血球細胞計數板進行計數，稀釋至孢子終濃度為106cfu/mL。最后在濾液中加入9 g/L氯化鈉、10 g/L蔗糖和0.01%吐溫-80配制成灰霉菌孢子懸液。

1.2.2 貴腐葡萄果實的制備

葡萄果實離體接種參考蘭圓圓[3]方法，略作修改。采集健康、成熟度良好的美樂葡萄果實，均勻噴灑75 %的酒精于表面進行消毒，重復三次。晾干后，將制備好的灰霉菌孢子懸液噴灑在葡萄果穗表面，隨后將果穗裝入感濕培育袋中，設置培養(yǎng)箱溫度24 ℃±2 ℃，濕度75 %，培養(yǎng)至噴施灰霉菌孢子懸液的葡萄果實表面均勻長滿灰霉菌絲。對獲得的葡萄果實進行逐穗挑選，去除干癟果粒，將果穗平鋪于托盤中，40 ℃烘箱中烘至失水率30%～40%，含糖量達270～290 g/L。

對照處理中健康的葡萄果實采用9 g/L 氯化鈉、10 g/L 蔗糖和0.01 %吐溫-80 配制成的無菌溶液噴施，其余步驟同上。對照組處理果實用于釀造美樂甜紅葡萄酒。

美樂自然貴腐酒的葡萄果實采摘于山西戎子酒莊葡萄園。

1.2.3 小容器釀造

采用5 L 廣口玻璃瓶進行發(fā)酵和貯藏，參照牛見明等[15]、王超萍等[1]和杜娟等[16]方法，略作修改。將烘干處理后的葡萄果實迅速除梗破碎、入罐，加入80 mg/L SO2，2 h 后加入20 mg/L 果膠酶（Lallemand EX-V），15～18 ℃浸漬發(fā)酵24 h 后接出自流酒，皮渣帽壓榨取汁。隨后接種2%活化后的釀酒酵母（Lalvin D254），控溫在15～18 ℃進行發(fā)酵，當比重降至1.050 左右時，加入60 mg/L SO2，滿罐密封轉移至4 ℃靜置沉淀。20 d 后，加入1 g/L 經活化的膨潤土，再次滿罐密封，4 ℃靜置，20 d 后虹吸出上層酒液加入100 mg/L 山梨酸鉀滿罐密封，4 ℃長期保存。

1.2.4 葡萄酒理化指標檢測

使用安東帕Lyza 5000 葡萄酒分析儀進行葡萄酒基本理化指標的檢測，所測指標包括乙醇、總糖、葡萄糖、果糖、可滴定酸、蔗糖、丙三醇、揮發(fā)酸、酒石酸、總多酚、蘋果酸、乳酸、葡萄糖酸、pH值、密度、固形物。

1.2.5 香氣成分檢測

參考陶永勝等[12]的方法，采用固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯(lián)用法進行香氣化合物分析。

香氣成分萃?。菏褂肈VB/CAR/PDMS 萃取纖維（50/30 μm 涂層厚度，2 cm，可伸縮長度）進行香氣成分萃取。在裝有磁力攪拌子的20 mL 頂空瓶中加入8 mL 酒樣、2 g NaCl 和50 μL 內標液（0.4 mg/L，2-辛醇），啟動攪拌子，在40 ℃水浴中穩(wěn)定10 min，隨后用萃取頭吸附40 min，將萃取頭放入GC進樣口熱解析5 min。

GC-MS 分析條件：樣品注射體積為1μL，不分流進樣，氦氣（純度99.999 %）為載氣，氦氣流速為1 mL/min。柱升溫程序：3 ℃/min從40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min從130 ℃升至250 ℃，保持8 min。連接桿溫度為230 ℃，進樣口溫度為250 ℃，離子源溫度為250 ℃。質譜采用電子源電離轟擊，掃描范圍為33～450 u，掃描速率0.2 次/s，電子源電壓為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，檢測器電壓為350 V。

定性定量分析：采用樣品質譜與標準品質譜對比、樣品的保留時間與標準品的保留時間對比，結合NIST 17 譜庫查詢進行香氣化合物的定性分析，采用內標-標準曲線法進行香氣化合物的定量分析。以2-辛醇為內標物質，采用五點法繪制標準曲線。

1.2.6 感官量化評價

葡萄酒感官量化分析采用Tao 等[17]的方法，略作修改。評價小組由30名經培訓人員組成，品嘗前進行標準味感物質和香氣物質訓練。品嘗時一次分析3 款酒樣，取適量酒樣于品嘗杯中，以其色澤、氣味、口感為評價指標，采用5 點標度法對感知的感官特征量化。

1.3 數據處理

所得實驗數據結果采用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析和多重比較（Duncan 新復極差法，P ＜0.05），利用Origin pro 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 人工貴腐果實的制備

人工接種侵染的美樂葡萄果實在感染初期果面發(fā)病不明顯，果梗上可見少量菌絲（圖1），感染中期部分果實表面產生菌絲，感染后期大部分果穗感染明顯，果實表面布滿菌絲和孢子。經烘箱40 ℃處理后，果穗明顯皺縮，體積變小。

圖1 人工接種后葡萄果實的貴腐化過程

2.2 不同桃紅貴腐葡萄酒的基礎理化指標

理化指標是評價葡萄酒質量的基本依據，受葡萄品種、生長環(huán)境、葡萄酒釀造及陳釀工藝的影響[18]，主要包括酒精度、總糖、揮發(fā)酸等。從所得結果來看（表1），三款酒樣的乙醇含量為13.07%vol～14.14%vol，在乙醇和密度方面沒有明顯差異；自然貴腐酒和人工貴腐酒的基本理化指標較為接近。從自然貴腐酒與人工貴腐酒的對比來看，自然貴腐酒在可滴定酸含量上高于人工貴腐酒，其余指標上兩者之間沒有明顯差異。

表1 不同酒樣的基礎理化指標

前人研究發(fā)現(xiàn)成熟的葡萄果實在被灰霉菌侵染后，由于灰霉菌的生長代謝作用會使得葡萄果實的成分發(fā)生變化，其中葡萄糖酸含量會升高，酒石酸含量會下降[13，19]，但也有學者[20]研究發(fā)現(xiàn)灰霉菌感染對葡萄酒中酒石酸和蘋果酸的含量沒有顯著影響。從本實驗結果來看（表2），自然貴腐酒和人工貴腐酒的葡萄糖酸含量顯著高于對照酒樣，自然貴腐酒的酒石酸含量顯著高于對照酒樣。

表2 不同酒樣中酸的含量

酒樣糖含量如表3 所示，自然貴腐酒與人工貴腐酒之間無明顯差異，與對照酒樣之間差異顯著。在總糖含量上，美樂甜紅葡萄酒（對照）達到了半甜葡萄酒的標準，自然貴腐酒與人工貴腐酒均達到了甜型葡萄酒的標準。

表3 不同酒樣中糖的含量 (g/L)

2.3 不同桃紅貴腐葡萄酒的香氣組分分析

葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的分析在葡萄酒質量和特征方面起到了決定性作用[21]。從單個香氣成分實際氣味貢獻來看，用氣味活度值（odour activity value，OAV）表示葡萄酒中各香氣化合物對主體香氣成分的貢獻是目前使用較多的方法，當OAV＞1 時，該香氣化合物對葡萄酒香氣起直接作用，當OAV＜1 時，嗅覺器官對此化合物的氣味無明顯感覺[22-23]。

Blanco-ulate 等[24]研究發(fā)現(xiàn)貴腐菌的感染會對賽美容葡萄果實的發(fā)育及代謝活動產生影響，會使葡萄果實的花色苷、萜烯類物質及脂肪酸香氣前體物質的生物合成明顯升高。從所得實驗結果來看，在酯類物質方面，自然貴腐酒和人工貴腐酒中的乙酸乙酯含量高于美樂甜紅葡萄酒，這與陶永勝等[12]的研究結果相符，可能是由于灰霉菌的侵染使得葡萄汁中乙酸濃度較高，最終使葡萄酒中乙酸乙酯含量較高；在醇類物質方面，三個酒樣中1-戊醇、苯乙醇和3-甲硫基丙醇在含量方面差異不顯著，而苯乙醇被認為是美樂葡萄品種的特征香氣物質[18]；在酸類物質方面，人工貴腐酒在醋酸含量上低于自然貴腐酒，在辛酸含量上顯著高于自然貴腐酒，使得人工貴腐酒與自然貴腐酒相比醋味較淡、澀味稍重，在其他香氣成分上，自然貴腐酒中的壬醛含量高于另外兩個酒樣，這是因為相比于醇類或者酯類物質，醛類物質在植物抵抗真菌的侵染方面發(fā)揮重要作用[25]，導致灰霉菌侵染后的葡萄果實釀造的葡萄酒中醛類物質增多。

在關于貴腐酒香氣物質的研究中，有學者研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中硫醇的含量對貴腐酒的香氣有一定影響[7]，3-巰基己醇主要貢獻酒中的柑橘味[26]。也有學者研究發(fā)現(xiàn)δ-內酯類和γ-內酯類對貴腐酒香氣有顯著影響[27-28]。Genovese等[29]和Sivertsen等[9]研究發(fā)現(xiàn)貴腐酒在蜂蜜、杏仁、杏和成熟花朵等香氣描述詞匯上得分更高，而蜂蜜、干無花果和杏仁等香氣被認為是貴腐甜酒的典型香氣。在貴腐葡萄酒的特征香氣物質方面，本研究所得到的人工貴腐酒與自然貴腐酒雖然存在差異，但從所得結果來看（表4），人工貴腐酒具有花香、檸檬味、苦杏仁味等和貴腐葡萄酒相關的香氣特征[6]。

表4 不同酒樣的香氣分析

2.4 不同桃紅貴腐酒的感官品鑒

葡萄酒的感官評價是指通過眼、口、鼻、舌等感覺器官從顏色、氣味、口感等方面對葡萄酒進行綜合評價[39]。將三個酒樣的感官品鑒結果進行PCA 分析（圖2），發(fā)現(xiàn)第一主成分貢獻率為38.7 %，第二成分貢獻率為31.9 %，累計貢獻率為70.6 %。通過主成分分析圖可以發(fā)現(xiàn)自然貴腐酒與人工貴腐酒之間差異較小，主要為蜂蜜、杏仁、烤面包以及山楂花等香氣，而美樂甜紅葡萄酒（對照）與前兩個酒樣之間存在著顯著差異，表明人工貴腐酒的香氣更接近于自然貴腐酒，具有一定程度的貴腐葡萄酒香氣特征。

圖2 不同酒樣的感官品鑒主成分分析

3 結論

本研究借鑒前人的研究成果，采用人工離體接種灰霉菌的方式，結合桃紅葡萄酒和貴腐葡萄酒的釀造工藝，釀造得到桃紅貴腐葡萄酒。所得的人工貴腐酒各項理化指標更接近于自然貴腐葡萄酒，且人工貴腐酒和自然貴腐酒在糖含量上均達到了甜型葡萄酒的標準；在香氣成分和感官品鑒上，人工貴腐酒接近于自然貴腐酒，具有花香、杏仁、檸檬、奶油以及山楂花等香氣。本研究中的人工桃紅貴腐葡萄酒兼具了桃紅葡萄酒的活躍果香與貴腐葡萄酒的甜潤口感和濃郁香氣，表明了人工桃紅貴腐葡萄酒釀造技術具有可行性。