miR-21-5p 對(duì)川崎病內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的作用及其機(jī)制研究

徐秀娟 俞益萍

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種全身性的、伴有發(fā)熱的急性血管炎癥，好發(fā)于5 歲以下兒童。KD 可導(dǎo)致多種嚴(yán)重并發(fā)癥，如血栓、心肌炎和冠狀動(dòng)脈瘤等，并可能造成永久性冠狀動(dòng)脈損傷，嚴(yán)重危害患者健康甚至造成死亡[1-2]。眾所周知，炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致KD 期間冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙的重要原因[3]。研究表明，細(xì)胞焦亡是細(xì)胞損傷的一種特殊方式，與KD 的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，抑制細(xì)胞焦亡已成為KD 的有效治療手段之一[4]。因此闡明KD內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)于KD 的臨床防治和藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。

miRNA 是一種長(zhǎng)約22 nt 的內(nèi)源性非編碼RNA，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要功能，并且已在多種疾病中被視作潛在的生物標(biāo)志物[5]。miRNA 也與KD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)KD 患者血漿中miR-21 表達(dá)水平升高是KD 的危險(xiǎn)因素[6]，此外一些miRNA 也被發(fā)現(xiàn)參與KD 患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的損傷[7]。miR-21-5p 在多種疾病中發(fā)揮作用[8-9]，并且可以通過(guò)凋亡[10]、自噬[11]、銅死亡[12]等多種途徑影響疾病進(jìn)展。然而，目前有關(guān)miR-21-5p 是否影響KD 期間內(nèi)皮細(xì)胞焦亡及其可能的調(diào)控機(jī)制少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究聚焦miR-21-5p 對(duì)KD 內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的作用及其機(jī)制，以期為KD 的診治提供新的潛在靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 6 周齡雄性C57BL/6 小鼠16只，體重20～22 g，由杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，溫度（24±2）℃，濕度（50±5）%，12 h 明暗循環(huán)光照系統(tǒng)，自由進(jìn)食和飲水，并在正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。小鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（mouse coronary artery endothelial cells，MCAECs）（批號(hào)：CP-M081）、小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7（批號(hào)：CL-0190）均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。本研究經(jīng)浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：ZJCLA-IACUC-20010177）。

1.2 試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：12491015）、FBS（批號(hào)：12484028）、青霉素-鏈霉素（批號(hào)：15070063）、BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（批號(hào)：23235）均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；干酪乳桿菌（lactobacillus casei，LC）（批號(hào)：TS277920）和MRS 肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：TYSW33345）均購(gòu)自寧波泰斯拓生物技術(shù)有限責(zé)任公司；miR-21-5p 模擬物（miR-21-5p mimics）、mimics 陰性對(duì)照物（miR-NC）、miR-21-5p 抑制劑（miR-21-5p inhibitor）和inhibitor 陰性對(duì)照物（inhibitor-NC）均購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)：11668500）購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號(hào)：AKCO003M）購(gòu)自北京盒子生工科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（批號(hào)：40203ES60）購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司；TaqMan MicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：4366596）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；qRT-PCR 試劑盒（批號(hào)：RR82LR）購(gòu)自日本TAKARA公司；MCC950（批號(hào)：HY-12815）購(gòu)自美國(guó)MedChem-Express 公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)：P0018S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；含NLR家族Pyrin 域蛋白3（recombinant NLR family，and Pyrin domain containing protein 3，NLRP3）（批號(hào)：15101S）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-related speckle-like protein，ASC）（批號(hào)：67824T）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白 水 解 酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1）（批號(hào)：24232S）、消皮素D 蛋白（gasdermin D，GSDMD）p30（批號(hào)：39754S）、IL-1β（批號(hào)：12242T）、IL-18（批號(hào)：57058S）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；caspase-1 前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1，pro-caspase-1）（批號(hào)：ab32499）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。離心機(jī)（型號(hào)：Sorvall MTX 150）、CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：Forma?Ⅱ）、生物安全柜（型號(hào)：1300 系列A2）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；熒光定量PCR 儀（型號(hào)：CFX96 Touch?）、酶標(biāo)儀（型號(hào)：imark）、電泳儀（型號(hào)：Universal 164-5070）均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司；熒光倒置顯微鏡（型號(hào)：TiS）購(gòu)自日本尼康公司；多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiScope 6200）購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 LC 細(xì)胞壁提取物（lactobacillus casei cell wall extract，LCWE）的制備 將LC 在乳酸桿菌MRS 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，使用PBS 洗滌。加入4% 十二烷基硫酸鈉（odium dodecyl sulfate，SDS）在37 ℃條件下孵育過(guò)夜，裂解細(xì)菌，用PBS 洗滌細(xì)胞壁片段，并與RNase、DNase 和胰蛋白酶孵育。將細(xì)胞壁片段超聲處理2 h，并在冰浴中冷卻。超聲處理后，細(xì)胞壁片段在4 ℃，6 000 r/min（半徑16 cm）離心20 min。上清液在4 ℃，6 000 r/min（半徑16 cm）離心1 h。以鼠李糖含量為基礎(chǔ)，采用比色苯酚-硫酸法測(cè)定LCWE 濃度。

1.4 動(dòng)物分組和KD 小鼠模型構(gòu)建 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為KD 組和PBS 組，每組8 只。KD 組小鼠單次腹腔注射0.5 mg/kg LCWE 構(gòu)建KD 小鼠模型，PBS組小鼠單次腹腔注射等量無(wú)菌PBS 作為對(duì)照。注射后14 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組抽取6 只小鼠進(jìn)行冠狀動(dòng)脈組織樣本采集。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與KD 體外細(xì)胞模型構(gòu)建 MCAECs和RAW264.7 均接種于含有10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用1 μg/mL LCWE 刺 激RAW264.7 細(xì) 胞12 h 后，將RAW264.7 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基與MCAECs 共孵育12 h，構(gòu)建KD 體外細(xì)胞模型[13]。

1.6 KD 小鼠模型觀測(cè)指標(biāo)

1.6.1 冠狀動(dòng)脈組織病理學(xué)檢測(cè) 以頸椎脫臼法處死小鼠，打開(kāi)胸腔，取出心臟，取小鼠冠狀動(dòng)脈組織，常規(guī)石蠟包埋和切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察冠狀動(dòng)脈組織病理學(xué)變化并拍照。

1.6.2 小鼠冠狀動(dòng)脈組織中焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1、GSDMD p30、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。使用RIPA 裂解緩沖液提取小鼠冠狀動(dòng)脈組織的總蛋白，采用BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。將膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉15 min，與一抗[NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、procaspase-1（1∶1 000）、GSDMD p30（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）]在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后用二抗在室溫下孵育1 h，使用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒使蛋白條帶可視化，通過(guò)Image J 軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6.3 小鼠冠狀動(dòng)脈組織中miR-21-5p 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。通過(guò)Trizol 法提取小鼠冠狀動(dòng)脈組織的總RNA，并檢測(cè)其濃度和純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為5×Evo M-MLVRT Master Mix 2 μL，RNA（1 000 ng，根據(jù)濃度加入相應(yīng)體積），RNase free water 補(bǔ)齊到10 μL；反應(yīng)條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃，反應(yīng)結(jié)束。使用qRT-PCR 試劑盒在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為SYBR Gree Mix 5 μL，cDNA 1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，純水補(bǔ)齊到10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為40。最后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 KD 體外細(xì)胞模型觀測(cè)指標(biāo)

1.7.1 細(xì)胞分組處理 （1）根據(jù)是否使用LCWE 處理RAW264.7 細(xì) 胞，將MCAECs 分為L(zhǎng)CWE 組和對(duì) 照 組；（2）在使用LCWE 處理RAW264.7 細(xì)胞的基礎(chǔ)上，根據(jù)轉(zhuǎn)染miR-21-5p inhibitor 或inhibitor-NC，將MCAECs分為L(zhǎng)CWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組。（3）在使用LCWE 處理RAW264.7 細(xì)胞的基礎(chǔ)上，用或不用NLRP3 抑制劑MCC950（終濃度10 μmmol/L，處 理 時(shí) 間 為1 h）預(yù) 處 理；在LCWE 和MCC950 處理的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimics 或miR-NC，根據(jù)以上處理將MCAECs 分為L(zhǎng)CWE 組、LCWE+MCC950 組、LCWE+MCC950+miR-NC 組和LCWE+MCC950+miR-21-5p mimics 組。

1.7.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將MCAECs 置于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%～80%融合度時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。使用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑分別將inhibitor-NC、miR-21-5p inhibitor、miR-NC 和miR-21-5p mimic 加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中孵育6 h 后，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.7.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8 法。將MCAECs 以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到96 孔板中。使用LCWE 刺激后，向培養(yǎng)基中添加10 μL CCK-8 溶液3 h。使用分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)450 nm 處的光密度（optically denser, OD）值。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/OD空白組×100%

1.7.4 細(xì)胞miR-21-5p 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。使用Trizol 法提取各組細(xì)胞的總RNA，并檢測(cè)其濃度和純度。其余步驟參照1.6.3。

1.7.5 細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1、GSDMD p30、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。使用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。其余步驟參照1.6.2。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠冠狀動(dòng)脈組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白和miR-21-5p 表達(dá)水平比較 HE 染色結(jié)果顯示，KD 組小鼠冠狀動(dòng)脈發(fā)生明顯病變，可見(jiàn)冠狀動(dòng)脈血栓形成，纖維組織增生，內(nèi)膜增厚，內(nèi)壁欠光滑，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A），表明KD 模型構(gòu)建成功。Western blot 結(jié)果顯示，KD 組小鼠冠狀動(dòng)脈組織中NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD p30、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平均明顯高于PBS 組（圖1B），提示KD 小鼠NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡增強(qiáng)。同時(shí)，qRT-PCR 結(jié)果顯示，與PBS 組相比，KD 組小鼠冠狀動(dòng)脈組織中miR-21-5p 表達(dá)水平升高（t=19.800，P＜0.001）（圖1C）。

圖1 KD 小鼠冠狀動(dòng)脈中的組織損傷、焦亡相關(guān)蛋白和miR-21-5p 表達(dá)變化（A：兩組小鼠冠狀動(dòng)脈組織病理學(xué)形態(tài)變化的HE 染色圖；B：兩組小鼠冠狀動(dòng)脈組織中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖；C：兩組小鼠冠狀動(dòng)脈組織中miR-21-5p表達(dá)水平比較，aP＜0.01）

2.2 細(xì)胞觀測(cè)指標(biāo)

2.2.1 LCWE 組和對(duì)照組細(xì)胞活力和miR-21-5p 表達(dá)水平比較 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LCWE 組細(xì)胞活力明顯降低（t=8.303，P＜0.001），說(shuō)明細(xì)胞模型構(gòu)建成功（圖2A）。與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致，qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LCWE 組細(xì)胞中miR-21-5p表達(dá)水平明顯升高（t=9.733，P＜0.001）（圖2B），提示miR-21-5p 很可能與KD 密切相關(guān)。

圖2 LCWE 組和對(duì)照組細(xì)胞活力和miR-21-5p 表達(dá)水平比較（A：LCWE 組和對(duì)照組細(xì)胞活力比較；B：LCWE 組和對(duì)照組細(xì)胞miR-21-5p 表達(dá)水平比較）

2.2.2 LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組中miR-21-5p 表達(dá)水平和NLRP3 炎癥小體激活水平比較 qRT-PCR 結(jié)果顯示，與LCWE+inhibitor-NC 組相比，LCWE+miR-21-5p inhibitor 組miR-21-5p表達(dá)水平降低（t=7.019，P=0.002），這表明miR-21-5p inhibitor 被成功構(gòu)建及轉(zhuǎn)染（圖3A）。Western blot 結(jié)果顯示，與LCWE+inhibitor-NC 組相比，LCWE+miR-21-5p inhibitor 組NLRP3 和ASC 蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖3B），這表明下調(diào)miR-21-5p 可以抑制LCWE 刺激內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體激活。

圖3 LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組中miR-21-5p 表達(dá)水平和NLRP3 激活水平比較（A：LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞miR-21-5p 表達(dá)水平比較，與LCWE+inhibitor-NC 組比較，aP＜0.01；B：LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞NLRP3、ASC 蛋白表達(dá)的電泳圖）

2.2.3 LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力和LDH 活性比較 Western blot 進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與LCWE+inhibitor-NC 組相比，LCWE+miR-21-5p inhibitor 組caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)均明顯降低（圖4A）。CCK-8 結(jié)果表明，與LCWE+inhibitor-NC 組相比，LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞活力升高（t=4.035，P=0.016）（圖4B）。同時(shí)，與LCWE+inhibitor-NC 組相比，LCWE+miR-21-5p inhibitor 組LDH 活性降低（t=3.661，P=0.022）（圖4C）。以上結(jié)果說(shuō)明，下調(diào)miR-21-5p 抑制LCWE 刺激內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡。

圖4 LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力和LDH 活性比較（A：LCWE+ inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖；B：LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞活力比較，與LCWE+inhibitor-NC 組比較，aP＜0.01；C：LCWE+inhibitor-NC 組和LCWE+miR-21-5p inhibitor 組細(xì)胞LDH 活性比較，與LCWE+inhibitor-NC 組比較，aP＜0.05）

2.2.4 miR-21-5p 通過(guò)激活NLRP3 炎癥小體誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡

2.2.4.1 LCWE+miR-NC 組和LCWE+miR-21-5p mimics 組miR-21-5p 表達(dá)水平比較 qRT-PCR 結(jié)果顯示，與LCWE+miR-NC 組相比，LCWE+miR-21-5p mimics組miR-21-5p 表達(dá)水平升高（t=13.740，P＜0.001）（圖5A），表明miR-21-5p mimics 被成功構(gòu)建和轉(zhuǎn)染。

圖5 miR-21-5p mimics 通過(guò)激活NLRP3 炎癥小體誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡（A：LCWE+miR-NC 組和miR-21-5p mimics 組細(xì)胞miR-21-5p 表達(dá)水平比較，與LCWE+miR-NC 組比較，aP＜0.01；B：4 組細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖；C：4 組細(xì)胞中LDH 活性比較，與LCWE 組比較，aP＜0.01，與LCWE+MCC950+miR-NC 組比較，aP＜0.01；D：4 組細(xì)胞活力比較，與LCWE 組比較，bP＜0.01，與LCWE+MCC950+miR-NC 組比較，bP＜0.01）

2.2.4.2 4 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力和LDH 活性比較 使用MCC950 進(jìn)行干預(yù)，Western blot 結(jié)果顯示，MCC950 處理下調(diào)LCWE 刺激MCAECs 中NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD p30、IL-1β 和IL-18 的蛋白表達(dá)，然而進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimics 逆轉(zhuǎn)MCC950 的上述作用（圖5B）。同時(shí)，CCK-8 和LDH 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與LCWE 組相 比，LCWE+MCC950 組細(xì)胞活力增加（t=5.613，P=0.005）、LDH 活性降低（t=6.173，P=0.004）；然而與LCWE+MCC950+miR-NC 組相比，LCWE+MCC950+miR-21-5p mimics 組細(xì)胞活力降低（t=4.810，P=0.009），LDH 活性增加（t=7.444，P=0.002）（圖5C-D）。以上結(jié)果表明，miR-21-5p 通過(guò)激活NLRP3 炎癥小體促進(jìn)LCWE刺激的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞位于組織和血液循環(huán)之間的交界處，是維持正常全身生理功能的關(guān)鍵因素之一。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷會(huì)促進(jìn)多種心血管疾病和代謝疾病的發(fā)生[14]。目前，在KD 期間因內(nèi)皮細(xì)胞損傷而引發(fā)的多種嚴(yán)重心血管并發(fā)癥仍是世界性難題[15]。深入研究KD 中內(nèi)皮細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制對(duì)臨床診療具有重要的理論價(jià)值和意義。

miRNA 與KD 密切相關(guān)，一項(xiàng)生物信息學(xué)研究指出，KD 患者外周血中miR-355、miR-2911 可以作為KD診斷的生物學(xué)標(biāo)志物[16]。臨床研究也表明，miRNA-122 與KD 患者的系統(tǒng)性炎癥有關(guān)[17]。近年來(lái)，miR-21-5p 與心血管疾病之間的關(guān)系已得到廣泛研究。有臨床研究表明，急性腦梗死患者血清中miR-21-5p表達(dá)與血清中IL-6、IL-8 含量呈正相關(guān)[18]。另一項(xiàng)臨床研究顯示，中度組、重度組動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miR-21-5p 水平明顯高于輕度組[19]。本研究發(fā)現(xiàn)KD 模型小鼠冠狀動(dòng)脈組織和LCWE 刺激的MCAECs模型中miR-21-5p 表達(dá)水平均明顯升高，而抑制miR-21-5p 則有效改善LCWE 刺激的MCAECs 細(xì)胞活力降低。表明miR-21-5p 很可能在KD 中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

細(xì)胞焦亡是一種炎性細(xì)胞死亡，主要特征是細(xì)胞膜穿孔、釋放促炎因子以及細(xì)胞裂解。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，細(xì)胞焦亡會(huì)引發(fā)心血管系統(tǒng)損傷，進(jìn)而促進(jìn)多種心血管疾病進(jìn)展，例如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注損傷以及KD[20-21]。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，NLRP3-IL-1β 通路是KD 主要驅(qū)動(dòng)因素[22]。NLRP3 是一種免疫受體，可識(shí)別來(lái)自細(xì)胞損傷、死亡、病原體等的刺激，NLRP3 蛋白激活后募集ASC 蛋白，隨后ASC 蛋白募集pro-caspase-1，并誘導(dǎo)其活化為caspase-1，合成由NLRP3、ASC 和pro-caspase-1 組成的NLRP3 炎癥小體（多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，誘導(dǎo)細(xì)胞在炎性和應(yīng)激的病理?xiàng)l件下死亡），并分泌炎性細(xì)胞因子如IL-1β 和IL-18，促進(jìn)焦亡[23-24]。NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是經(jīng)典焦亡途徑之一。NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的焦亡會(huì)導(dǎo)致多種內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙[25]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-21-5p 能明顯上調(diào)細(xì)胞焦亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)KD 模型小鼠冠狀動(dòng)脈組織中miR-21-5p 表達(dá)、NLRP3 炎癥小體以及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白均明顯升高。而在LCWE 刺激的MCAECs 中，抑制miR-21-5p 下調(diào)NLRP3 炎癥小體以及細(xì)胞焦亡。本研究進(jìn)一步通過(guò)MCC950 和miR-21-5p mimics 處理證明了miR-21-5p 是通過(guò)促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的激活進(jìn)而促進(jìn)KD 血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。

綜上所述，本研究闡明了miR-21-5p 與NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在KD 疾病進(jìn)展中的作用，為KD 的診斷和治療提供了一個(gè)有力的靶點(diǎn)，并且為KD的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。