滋腎清熱利濕化瘀方治療多囊卵巢綜合征的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)研究

金 晶,李佩雙,丁志玲,彭佳華,劉淑娟,梁瑞寧,5

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,江西 南昌 330004;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006;3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)婦產(chǎn)科學(xué)研究所,江西 南昌 330006;4. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖醫(yī)院,江西 南昌 330001;5. 江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一類高度異質(zhì)性疾病,以雄激素過(guò)高、排卵障礙和卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕R床特征,是導(dǎo)致育齡期女性月經(jīng)失調(diào)和不孕的重要原因。目前,治療PCOS大多采用激素、手術(shù)或生活方式干預(yù),但存在治療周期長(zhǎng)、并發(fā)癥多、療效欠佳等問(wèn)題。中醫(yī)藥在治療PCOS中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),主要通過(guò)中藥口服,結(jié)合針灸治療、針?biāo)幗Y(jié)合、中醫(yī)綜合療法以及中西醫(yī)結(jié)合治療等多種方法,整體而觀,辨證論治,因人制宜,從“因”調(diào)節(jié)內(nèi)分泌,補(bǔ)充西醫(yī)治療的不足,其療效確切且副作用小,更有助于緩解PCOS癥狀[1]。

PCOS屬中醫(yī)“閉經(jīng)”、“不孕”、“癥瘕”等范疇,本課題組結(jié)合多年的臨床治療,認(rèn)為PCOS病機(jī)多為腎虛兼濕熱、痰濁、瘀血,也即腎虛為本,痰瘀濕濁等為標(biāo),致沖脈血?dú)狻澳媸ⅰ盵2]。前期研究發(fā)現(xiàn),滋腎清熱利濕化瘀方(Zishen Qingre Lishi Huayu Prescription,ZQLHP)(簡(jiǎn)稱滋腎方)能有效提高PCOS患者自主排卵率及有排卵月經(jīng)的發(fā)生率,并能改善痤瘡及降低血清睪酮水平[3]。盡管滋腎方體現(xiàn)了中藥復(fù)方多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì),但其主要發(fā)揮作用的化學(xué)成分或其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種能夠有效預(yù)測(cè)中藥以及中醫(yī)復(fù)方靶點(diǎn)的研究方法,為中醫(yī)復(fù)方研究提供了新的視角?；诖?本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探索滋腎方干預(yù)PCOS的機(jī)制,為滋腎方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 雌性C57BL/6J小鼠40只,SPF級(jí),3周齡,體質(zhì)量(10±2)g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2藥物 滋腎方(知母10 g,山茱萸10 g,丹參10 g,桃仁10 g,薏苡仁15 g,白芥子10 g,黃柏10 g,玄參10 g,甘草6 g),購(gòu)自于江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院。枸櫞酸氯米芬片,購(gòu)自高特制藥有限公司,批號(hào):Q1102。

1.1.3試劑與儀器 來(lái)曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào):211130KL)。白介素-6(interleukin-6,IL-6)(批號(hào)2209M31)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)(批號(hào)2209M18)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)(批號(hào)2209M29)購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。磷酸化蛋白激酶(phosphorylation AKT serine/threonine kinase,p-AKT)抗體(批號(hào)P2215051),AKT抗體(批號(hào):A3321120),磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylation mitogen-activated protein kinase p38,p-p38MAPK)抗體(批號(hào)8690S),p38MAPK抗體(批號(hào)9216s),磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylation signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)抗體批號(hào)ab76315),STAT3抗體(批號(hào)ab68153),分別購(gòu)于翌圣和Abcam公司。伯樂(lè)電泳儀(Biorad公司);凝膠成像系統(tǒng)(Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1.1 滋腎方活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和BATMAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)檢索滋腎方有效成分。在TCMSP中檢索與成分相關(guān)的靶基因,預(yù)測(cè)藥物有效成分的作用靶點(diǎn)。

1.2.1.2 PCOS靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、DisGENET(https://www.disgenet.org/)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.pharmgkb.org)、DRUGBANK(https://go.drugbank.com/)搜索“Polycystic ovary syndrome”檢索疾病靶點(diǎn)。

1.2.1.3 篩選共同靶點(diǎn) 將藥物與疾病獲得的相關(guān)靶點(diǎn)輸入微生信在線平臺(tái)(https://www.bioinformatics.com.cn/),得到共同靶點(diǎn),繪制Venn圖。

1.2.1.4 藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將滋腎方中藥有效成分及方藥疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件,構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖,Network Analyzer插件行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?篩查滋腎方治療PCOS的核心活性成分。

1.2.1.5 構(gòu)建潛在作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將滋腎方與PCOS的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0并應(yīng)用CytoNCA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?按照節(jié)點(diǎn)的Degree值調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的屬性。

1.2.1.6 GO富集與KEGG通路分析 將滋腎方治療PCOS潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(http://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),制作GO功能和KEGG富集分析。篩選出前20名KEGG通路和前10名GO生物學(xué)功能進(jìn)行可視化。

1.2.1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),將重要活性成分與PPI中前3位核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。應(yīng)用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載活性成分2D結(jié)構(gòu),PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中下載靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)。在ChemBio3D軟件優(yōu)化活性成分并存為“mol2”格式。AutoDockVina與PyMOL軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證與可視化制圖。

1.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 動(dòng)物分組及造模給藥 將40只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、滋腎方(ZQLHP)組和枸櫞酸氯米芬(clomiphene citrate,CC)組,每組10只。除正常組外,其余各組小鼠均予以1 mg·kg-1·d-1LET溶液灌胃誘導(dǎo)PCOS小鼠模型[4-5],連續(xù)21 d,正常組給予等容積生理鹽水。造模第11天開始連續(xù)10 d觀察小鼠陰道脫落細(xì)胞的變化,根據(jù)小鼠動(dòng)情周期的變化以及LET造模后,隨機(jī)挑選2只小鼠處死后,HE染色觀察卵巢組織卵泡是否呈囊狀樣改變,以確認(rèn)模型是否構(gòu)建成功。造模成功后,第22天開始給予相應(yīng)劑量藥物灌胃,根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量,滋腎方11.8 g·kg-1·d-1灌胃。枸櫞酸氯米芬組1 mg·kg-1·d-1,正常組和模型組給予等容積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)給藥14 d。

1.2.2.2 蘇木精-伊紅染色觀察卵巢組織病理 對(duì)小鼠卵巢組織進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片和染色等處理后,使用光學(xué)顯微鏡觀察其病理變化。

1.2.2.3 ELISA檢測(cè)IL-6、IL-10和TNF-α水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作,采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A,檢測(cè)小鼠外周血中IL-6、IL-10和TNF-α水平。

1.2.2.4 Western blot檢測(cè)卵巢組織p-AKT、AKT、p-p38MAPK、p38MAPK、 p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá) 取各組小鼠卵巢組織研磨后,RIPA裂解緩沖液中裂解1 h后,超速冷凍離心機(jī)4 ℃,13 000 r·min-1離心30 min取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,根據(jù)β-actin(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、AKT(1 ∶1 000)、p-p38MAPK(1 ∶1 000)、p38MAPK(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)抗體說(shuō)明書進(jìn)行抗體稀釋,4 ℃孵育過(guò)夜后,加入相應(yīng)的二抗,室溫反應(yīng)2 h,ECL超敏溶液顯影,采用ImageJ圖像處理軟件計(jì)算對(duì)應(yīng)凝膠條帶的灰度值,與內(nèi)參的吸光度比值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2.5 免疫組織化學(xué)觀察卵巢組織中p-AKT、p-p38MAPK和p-STAT3蛋白表達(dá) 取各組小鼠卵巢組織,采用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片為4 μm。在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行孵育,冷卻至室溫后,使用5% BSA阻斷非特異性結(jié)合。p-AKT(1 ∶500)、p-p38MAPK(1 ∶500)和p-STAT3(1 ∶500)抗體稀釋后,4 ℃孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育30 min,PBS清洗后,使用DAB顯色。最后使用光學(xué)顯微鏡獲取圖像,并使用ImageJ Pro Plus軟件對(duì)圖像進(jìn)行光密度分析。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

2.1.1滋腎方有效成分與相關(guān)靶點(diǎn) 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與OB、DL參數(shù)篩選,最終得到滋腎方456個(gè)化合物及其361個(gè)作用靶點(diǎn)。其中知母15個(gè)化合物,山茱萸20個(gè)化合物,丹參59個(gè)化合物,桃仁23個(gè)化合物,薏苡仁9個(gè)化合物,白芥子4個(gè)化合物,黃柏37個(gè)化合物,玄參9個(gè)化合物,甘草280個(gè)化合物。篩出排名前10的化合物信息如Tab1?；谧棠I方有效成分從TCMSP與SWISS平臺(tái)搜集預(yù)測(cè)靶點(diǎn),篩除重復(fù)項(xiàng)后共有361個(gè)藥物靶點(diǎn)。

Tab1 The top 10 compounds with degree values and OB and DL values in formula for ZQLHP

2.1.2PCOS相關(guān)靶點(diǎn)與滋腎方治療的潛在作用靶點(diǎn) 通過(guò)GeneCards、OMIM、DisGENET、PharmGKB和DRUGBANK 5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到PCOS疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 397個(gè),將滋腎方藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集制作韋恩圖,得到125個(gè)交集靶點(diǎn)見(jiàn)Fig1,即滋腎方治療PCOS的潛在作用靶點(diǎn)。

Fig1 Venn diagram of potential targets of action of ZQLHP for treatment of PCOS

2.1.3“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 將滋腎方中活性成分與疾病的125個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.0 軟件,與中藥成分關(guān)聯(lián)進(jìn)行可視化。根據(jù)degree值大小調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的大小并排序,degree與節(jié)點(diǎn)大小成正比,共包括580個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 598條邊(Fig2)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲇?jì)算化合物的度值,列出度值排名前10 位的化合物見(jiàn)Tab2?？梢缘弥纹に?quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)是幾味中藥的共有成分,且OB 值及 DL 值遠(yuǎn)高于篩選標(biāo)準(zhǔn)值,推測(cè)槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等是滋腎方治療PCOS的核心活性成分。

Fig2 Drug-component-target visualization network for treatment of PCOS with ZQLHP

Tab2 Information table of top 10 compounds in formula for ZQLHP

2.1.4滋腎方治療PCOS的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將滋腎方與PCOS相重合的125個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(Fig3),該網(wǎng)絡(luò)共有108個(gè)節(jié)點(diǎn),371條邊;將其結(jié)果導(dǎo)入 Cytoscape3.9.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析,根據(jù)Degree值大小對(duì)125個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行排序,靶點(diǎn)顏色越深代表靶點(diǎn)相關(guān)度越高(Fig4)。同時(shí)利用 CytoNCA 插件工具分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),結(jié)合度值(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closenesss)篩選核心靶點(diǎn),結(jié)果顯示3項(xiàng)參數(shù)均較高的核心靶點(diǎn)有MAPK3、AKT1、STAT3、IL-6、TP53、INS、CASP3等,表明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)圖中貢獻(xiàn)度高,在滋腎方治療PCOS疾病中起到重要作用。

Fig3 PPI protein interaction network for intersecting therapeutic targets

Fig4 Visualization of PPI protein interaction network for intersecting therapeutic targets

2.1.5關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集和KEGG通路富集分析 對(duì)滋腎方治療PCOS的125個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO基因本體論分析,GO 功能富集分析包括生物過(guò)程 (BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)3 個(gè)方面。結(jié)果顯示共富集到663條BP條目,64條CC條目,119條MF條目。其中富集基因數(shù)量最多的條目為negative regulation of apoptotic process,plasma membrane,protein binding,分別分布了31、56、115個(gè)基因。設(shè)置P<0.05,根據(jù)P值排序后,選取排名前10的條目繪制條形圖(Fig5)。

Fig5 GO analysis of intersectional therapeutic targets of ZQLHP for PCOS

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)做125個(gè)交集靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析,共富集出156條KEGG通路。結(jié)合顯著性程度與Count值,滋腎方治療PCOS的潛在作用靶點(diǎn)主要在PI3K-Akt signaling pathway,TNF signaling pathway,pathways in cancer等信號(hào)通路,設(shè)置P<0.01,根據(jù)P值與Count值排序后選取排名前 20 位的條目繪制氣泡圖(Fig6)。

Fig6 Visualization of PPI protein interaction networks for intersecting therapeutic targets

2.1.6分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)前期結(jié)果,取排名前3化合物與關(guān)鍵交集靶點(diǎn)行分子對(duì)接,即槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇與STAT3、AKT1、MAPK3。結(jié)果顯示滋腎方核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均小于-5.0 kcal·mol-1,表明配體與受體蛋白結(jié)合穩(wěn)定,藥物關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)具有良好親和力,在疾病治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。見(jiàn)結(jié)合能(Tab3)與分子對(duì)接圖(Fig7)。

Fig7 Diagram of molecular docking between core ingredients and key targets of ZQLHP

Tab3 The binding ability of key components of ZQLHP to target gene molecules

2.2 動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1滋腎方對(duì)PCOS小鼠體重、卵巢組織病理學(xué)影響 如Fig8所示。與正常組比較,模型組小鼠體質(zhì)量增加(P<0.05),與模型組比較,ZQLHP組小鼠體質(zhì)量降低(P<0.01)。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),正常組可見(jiàn)卵泡的顆粒細(xì)胞層較多且排列緊密,內(nèi)可見(jiàn)卵母細(xì)胞。模型組卵巢切片可見(jiàn)顆粒細(xì)胞層數(shù)減少,小卵泡和閉鎖卵泡數(shù)量增多,黃體數(shù)量減少。與模型組相比,各治療組給藥14 d后內(nèi)見(jiàn)黃體,顆粒細(xì)胞排列正常及不同等級(jí)發(fā)育的優(yōu)勢(shì)卵泡。各組卵巢組織黃體及囊性卵泡數(shù)量統(tǒng)計(jì)可見(jiàn),與正常組相比,模型組黃體數(shù)量下降(P<0.01),囊性卵泡數(shù)量明顯升高(P<0.05),與模型組相比,給藥組黃體數(shù)量增加(P<0.01),囊性卵泡數(shù)量明顯減少(P<0.05),ZQLHP組與CC組無(wú)差異,結(jié)果提示ZQLHP可明顯緩解PCOS小鼠卵巢病理?yè)p傷。

Fig8 Evaluation of efficacy of ZQLHP in PCOS model

2.2.2滋腎方對(duì)PCOS小鼠IL-6、IL-10和TNF-α水平的影響 如Fig9所示,與正常組比較,模型組小鼠IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01),IL-10水平下降(P<0.01);給藥治療后與模型組比較,IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05,P<0.01),IL-10水平上升(P<0.01),ZQLHP組與CC組無(wú)差異。

Fig9 Effect of ZQLHP on levels of IL-6, IL-10 and TNF-α in PCOS model

2.2.3滋腎方對(duì)PCOS小鼠AKT/p38MAPK/STAT3蛋白的影響 如Fig10和Fig11所示,與正常組比較,模型組小鼠卵巢組織中p-AKT蛋白表達(dá)量下降(P<0.05或P<0.01),p-p38MAPK和p-STAT3蛋白表達(dá)上升(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,給藥組小鼠卵巢組織p-AKT蛋白表達(dá)上升(P<0.05或P<0.01)、p-p38MAPK和p-STAT3蛋白表達(dá)量下降(P<0.05或P<0.01),ZQLHP組與CC組無(wú)差異。

Fig11 Effect of ZQLHP on expression levels of p-AKT, p-p38MAPK and p-STAT3 proteins in PCOS model mice (immunohistochemistry, ×400)

3 討論

PCOS是青春期與育齡期婦女最為常見(jiàn)的代謝內(nèi)分泌疾病,流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國(guó)育齡期女性患病率為5.6%,PCOS患者約占不孕人群的1/3[6]。追溯古籍,尚無(wú)PCOS病名相關(guān)的記載,然根據(jù)其癥狀可將其劃分為中醫(yī)“閉經(jīng)”、“不孕”、“癥瘕”等范疇?！缎ＷD人良方》有載:“婦人病有三十六種,皆由沖任勞損而致”,由此可知,沖任損傷是婦科疾病之總因。我們根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為,PCOS病位主要在腎與沖任,本病病機(jī)以腎陰虧虛為主,腎陰虧損則腎臟氣化不及,血脈失養(yǎng),燥熱內(nèi)生,水津不化釀生痰濁、濕熱、瘀血之邪,痰熱濕瘀內(nèi)阻于沖任為本病之標(biāo)[7-8]。因此,本方以滋腎清熱利濕化瘀為治法,方中山茱萸酸溫補(bǔ)益肝腎,知母、黃柏、玄參滋陰清熱,佐以白芥子、薏苡仁健脾利濕,桃仁、丹參活血通經(jīng),甘草調(diào)和藥性。諸藥共同使用,共奏滋陰清熱,活血通經(jīng)之功,使腎陰得養(yǎng)、虛熱得清,血脈通暢,從而使治療效果得到進(jìn)一步的提高。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)滋腎方灌胃干預(yù)后,PCOS小鼠體質(zhì)量下降,卵巢病理?yè)p傷改善,黃體個(gè)數(shù)增多,囊性卵泡數(shù)量減少,顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯改善。以上結(jié)果提示滋腎方能夠改善PCOS小鼠癥狀及體征,這與長(zhǎng)期臨床實(shí)踐一致。

PCOS確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但炎癥因子、內(nèi)分泌、代謝紊亂和顆粒細(xì)胞增殖凋亡等在其進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示,滋腎方中共篩出456個(gè)活性成分,作用于361個(gè)靶點(diǎn)對(duì)PCOS發(fā)揮作用,包括槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等。研究表明槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善代謝功能、降低血清膽固醇等作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能降低肥胖患者巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的基因表達(dá)水平,降低胰島素抵抗作用,緩解PCOS癥狀[10]。同時(shí),槲皮素通過(guò)下調(diào)TNF-α和IL-6提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量,促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育[11]。β-谷甾醇可通過(guò)抑制IL-6、TNF-α和IL-1β的水平發(fā)揮抗炎作用。β-谷甾醇一項(xiàng)糞菌移植實(shí)驗(yàn)研究表明,β-谷甾醇可以調(diào)節(jié)PCOS子宮內(nèi)膜容受性,協(xié)調(diào)性激素平衡,從而影響PCOS的病理過(guò)程[12]。此外,趙帥等[13]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、抑制凋亡,其機(jī)制與AKT信號(hào)有關(guān)。豆甾醇也可通過(guò)抑制IL-6和IL-1等炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。慢性低度炎癥已被證實(shí)與PCOS的發(fā)生有關(guān),促炎與抗炎因子的失調(diào)可延遲卵泡成熟并誘導(dǎo)類固醇生成異常[14]。本實(shí)驗(yàn)研究同樣發(fā)現(xiàn),與正常組相比,PCOS模型組小鼠血清TNF-α和IL-6上調(diào),IL-10表達(dá)下調(diào),滋腎方干預(yù)逆轉(zhuǎn)了TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)趨勢(shì),進(jìn)一步證實(shí),活化的TNF-α和IL-6細(xì)胞因子是誘導(dǎo)慢性炎性PCOS的關(guān)鍵因素,由此可見(jiàn),平衡促炎與抗炎因子對(duì)于PCOS轉(zhuǎn)歸與預(yù)后密切相關(guān)。提示平衡促炎與抗炎因子對(duì)于PCOS轉(zhuǎn)歸與預(yù)后至關(guān)重要。因此,推測(cè)滋腎方的關(guān)鍵活性成分可能是通過(guò)抗炎機(jī)制發(fā)揮作用。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)及KEGG富集分析得到滋腎方治療PCOS的核心靶點(diǎn)主要包括MAPK3、AKT1、STAT3、IL-6、TP53、INS、CASP3等,潛在作用靶點(diǎn)主要富集在PI3K/AKT、TNF和癌癥相關(guān)通路。研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵巢中存在異常停滯生長(zhǎng)的不成熟卵泡,AKT信號(hào)的激活有助于在卵泡發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞的成熟。此外,AKT信號(hào)通路中相關(guān)因子的改變會(huì)直接影響到卵巢組織的胰島素傳導(dǎo)以及糖代謝[15]。Hafizi等[16]研究表明PCOS與非PCOS患者減數(shù)分裂II期卵母細(xì)胞中,AKT1、AKT2無(wú)明顯差異,然給藥干預(yù)后AKT表達(dá)水平出現(xiàn)差異,AKT1、AKT2表現(xiàn)出與藥物的高度親和力。MAPK家族成員有4種,p38MAPK作為重要一員,磷酸化后被激活,發(fā)揮調(diào)控炎癥反應(yīng)及細(xì)胞免疫的作用,是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。STAT3是STATs家族成員之一,研究發(fā)現(xiàn)在小鼠顆粒細(xì)胞分化過(guò)程中,STAT3是調(diào)節(jié)黃體生成素受體的關(guān)鍵信號(hào)。TNF-α和IL-6促炎細(xì)胞因子過(guò)度釋放可導(dǎo)致p38MAPK、STAT3激活,進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17],徐琴等[18]的研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制p38MAPK可以改善PCOS模型大鼠炎癥反應(yīng)。p38MAPK、STAT3被多種因子激活,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程以及與免疫反應(yīng)相關(guān)的炎性細(xì)胞因子分泌,從而影響宿主后發(fā)生炎癥反應(yīng)。此外,研究發(fā)現(xiàn),STAT3是AKT通路介導(dǎo)下游信號(hào)所必需的關(guān)鍵因子,抑制STAT3活性會(huì)反饋性激活A(yù)KT活性。分子對(duì)接驗(yàn)證表明槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇與AKT、MAPK、STAT3結(jié)合活性較佳。實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí),與正常組相比,PCOS模型組小鼠卵巢組織p-AKT表達(dá)水平下調(diào),p-p38MAPK和p-STAT3表達(dá)水平升高,經(jīng)滋腎方灌胃治療后,p-AKT表達(dá)水平上調(diào),p-p38MAPK和p-STAT3表達(dá)水平下降。

綜上,本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“滋腎方成分—靶點(diǎn)—PCOS”網(wǎng)絡(luò),以期獲得滋腎方對(duì)PCOS的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)所獲得的重要靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明滋腎方能夠有效改善PCOS小鼠癥狀及體征,平衡促炎、 抗炎因子的水平,可能是通過(guò)提高p-AKT表達(dá)水平和降低p-p38MAPK和p-STAT3表達(dá)水平,干預(yù)其下游的效應(yīng)細(xì)胞來(lái)參與PCOS病理進(jìn)展,進(jìn)而改善PCOS。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,為滋腎方治療PCOS提供了科學(xué)依據(jù),并為滋腎方藥理機(jī)制研究提供了參考價(jià)值。然而,鑒于對(duì)PCOS病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不完善,且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)存在局限性,本研究預(yù)測(cè)結(jié)果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和探索。

(致謝:本文作者非常感謝以下老師提供的幫助,梁瑞寧教授構(gòu)思并設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn),生殖醫(yī)學(xué)科劉淑娟主任提供了寶貴建議,劉端勇教授對(duì)于本文手稿進(jìn)行了的指導(dǎo)。)