重樓皂苷Ⅶ調(diào)控ROS誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡和自噬

楊 凡, 邵軼群, 賈默然, 聶偉東, 王田田, 彭 煜

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200080)

膀胱癌(bladder cancer, BC)是世界上最常見(jiàn)的一種泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。目前,BC的治療包括根治性膀胱切除術(shù)、放療和化療。然而,約有5%的患者在診斷時(shí)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。晚期或轉(zhuǎn)移性BC的治愈效果差、預(yù)后差,接受一線鉑類(lèi)化療的患者1年總生存率僅為36%[2]。因此,迫切需要有效抑制BC而又有較低毒副作用的藥物。

重樓皂苷Ⅶ(paris saponin Ⅶ, PSII)是一種從傳統(tǒng)中草藥延齡草中分離出來(lái)的甾體皂苷,已經(jīng)成為了一種潛在的抗癌劑。PSII通過(guò)抑制小鼠肺腺癌的基質(zhì)金屬酶來(lái)抑制肺癌轉(zhuǎn)移,激活caspase-2和線粒體的功能障礙誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞的凋亡[3-4]。然而,目前PSII對(duì)BC發(fā)生的影響及其內(nèi)在機(jī)制仍不清楚。在這項(xiàng)研究中,我們的目的為探究PSII在體外對(duì)BC細(xì)胞的潛在細(xì)胞毒性作用及其作用機(jī)制,以期為BC的治療和新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

T24和5637細(xì)胞株購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。PSII購(gòu)于四川省維克奇;N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine, NAC)、 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)購(gòu)于MedChemExpress;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,DCFH-DA熒光探針購(gòu)于上海翌圣;Bax、Bcl-2、LCB-II、Beclin 和P62一抗購(gòu)買(mǎi)于Cell signing technology;MitoSOXTM線粒體超氧化物指示劑購(gòu)買(mǎi)于賽默飛。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)T24和5637細(xì)胞培養(yǎng)于用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素),細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 PSII處理24 h后使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于12孔板,過(guò)夜貼壁后,加入PSII進(jìn)行干預(yù);培養(yǎng)12 d后,用4%多聚甲醛固定,隨后加入結(jié)晶紫溶液染色,拍照。

2.4 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡PSII處理24 h后,加入Annexin V和PI染液,孵育15 min后,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染構(gòu)建GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。加入PSII后,使用共聚焦進(jìn)行拍照。

2.6 Western blot檢測(cè)使用RIPA裂解細(xì)胞,BCA試劑盒測(cè)定總蛋白的濃度。使用SDS-PAGE凝膠電泳方法分離蛋白,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用5% BCA封閉1 h,4 ℃孵育一抗過(guò)夜。

2.7 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞ROS和線粒體ROS不同濃度PSII孵育24 h。收集細(xì)胞,加入DCFH-DA或MitoSox Red (5 μmol·L-1),37 ℃孵育30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.8 ROS抑制劑NAC干預(yù)實(shí)驗(yàn)預(yù)給藥PSII 2 h,隨后NAC干預(yù)22 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每孔加入CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。

3 結(jié)果

3.1 PSII增強(qiáng)BC細(xì)胞毒PSII處理后,顯著降低細(xì)胞存活率,并且具有濃度依賴(lài)性。IC50值分別為7.76、9.88 μmol·L-1。同時(shí),與對(duì)照組相比,PSII明顯降低細(xì)胞克隆形成能力。

3.2 PSII誘導(dǎo)BC細(xì)胞凋亡與空白組相比,PSII組細(xì)胞凋亡增加。Western blot結(jié)果顯示, PSII組細(xì)胞Bax與Bcl-2的比值明顯減少(P<0.05)。

3.3 PSII增強(qiáng)T24細(xì)胞中自噬流PSII處理后細(xì)胞顯示明顯的熒光信號(hào),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。

3.4 PSII刺激BC細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平PSII處理后,顯著增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá),降低p62蛋白表達(dá)(P<0.05)。

3.5 PSII誘導(dǎo)T24細(xì)胞中及線粒體ROS產(chǎn)生PSII促進(jìn)T24細(xì)胞及線粒體產(chǎn)生ROS,且具有顯著性差異(P<0.05)。

3.6 清除ROS減輕PSII誘導(dǎo)的T24細(xì)胞凋亡和自噬NAC干預(yù)后,PSII的促細(xì)胞凋亡效果被減弱。與PSII組比較,PSII+NAC組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),P62蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

4 討論

過(guò)度的自噬被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤抑制途徑,能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞的程序性死亡[5]。在自噬體的形成過(guò)程中,LC3-Ⅰ被修飾并轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ,LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比例與自噬程度有關(guān)。Beclin1調(diào)控自噬體的形成和成熟。同時(shí),P62蛋白在自噬體的形成過(guò)程中被降解,P62蛋白的表達(dá)與自噬活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。腺病毒感染的目標(biāo)細(xì)胞可以有效地表達(dá)紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)和LC3B蛋白的融合蛋白[6]。通過(guò)觀察GFP-mRFP-LC3B融合蛋白的顏色,顯示細(xì)胞的自噬流。有證據(jù)表明,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激啟動(dòng)凋亡途徑,從而導(dǎo)致BC細(xì)胞的死亡[7]。因此,ROS水平可能是大量導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤化合物的關(guān)鍵指標(biāo)。

綜上所述,PSII能夠顯著抑制BC細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡和自噬,其機(jī)制與ROS密切相關(guān)。該研究擴(kuò)展了對(duì)PSII在抗腫瘤方面的研究,為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)PSII提供了參考。