KLF10在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達及與預后的關系*

李慧 張吳霞 熊燁

(四川大學華西醫(yī)院1.層流研究病房;2.臨床試驗中心;3.腫瘤科,四川 成都 610044)

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細胞異常增殖的惡性腫瘤,其主要特征為免疫失調、骨痛、骨損傷、腎功能衰竭、骨質破壞、細菌性感染等[1-2]。多發(fā)性骨髓瘤是常見的血液系統(tǒng)腫瘤,約占所有惡性腫瘤的1%,約占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[3-4]。鋅指蛋白轉錄因子10(KLF10)是KLFs家族的亞型之一,KLFs家族與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,例如前列腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等[5]。KLF10作為轉錄因子,調節(jié)基因轉錄,細胞增殖、分化,細胞周期,在多種腫瘤中有重要作用[6]。目前為止,多項研究證實了微小RNA-21(miR-21)與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關[7]。迄今,尚缺乏KLF10和miR-21共同在多發(fā)性骨髓瘤中的研究報道。因此,本研究通過測定KLF10和miR-21在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的表達,探究其與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院在2015年1月—2017年1月收治的多發(fā)性骨髓瘤患者126例作為觀察組,另選取同期在我院進行健康體檢的健康者120例作為對照組。觀察組男性65例,女性61例,平均年齡為(60.50±10.52)歲;對照組男性59例,女性61例,平均年齡為(59.85±9.26)歲。收集受試者臨床資料,包括免疫球蛋白分型、Durie-Salmon(DS)分期、重度貧血、美國東部腫瘤協(xié)作組體力狀況(ECOG)評分、骨髓漿細胞比例等。納入標準：①診斷符合中國多發(fā)性骨髓瘤診斷指南(2022年修訂)[8]。②患者初次診斷為多發(fā)性骨髓瘤。③患者、家屬知情同意。排除標準：①已接受其他治療,例如免疫療法等。②患者伴有其他心血管、急慢性感染或者其他惡性腫瘤等。③患者伴有精神疾病,無法配合治療者。本研究通過我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集觀察組患者確診次日清晨空腹靜脈血和對照組體檢者當日的空腹靜脈血5 mL,離心機以4000 r/min離心10 min,分離血清。血清保存在-80 ℃冰箱待測。

1.2.2 主要儀器和試劑 KLF10酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號：XG-H95904)購自上海西格生物科技有限公司,TRIzol試劑(貨號：15596026)購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司,反轉錄試劑盒(貨號：205311)購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司,熒光定量PCR試劑盒(貨號：CR0222)購自賽爾瑞成(北京)生命科學技術有限公司,qRT-PCR儀(型號：MF048-s-01)購自廣州市智取生物科技有限公司。

1.2.3 ELISA檢測血清KLF10水平 采用KLF10 ELISA試劑盒檢測受試者血清KLF10水平,操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.4 qRT-PCR檢測血清miR-21表達水平 使用TRIzol法提取血清中總RNA,采用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA(反轉錄反應體系：總RNA 2 μL、RNase Free dH2O(20 μL)、PrimeScript RT Master Mix(4 μL))后進行qRT-PCR反應,qRT-PCR檢測條件：95 ℃預變性5 min循環(huán)1次,95 ℃變性30 s、55 ℃退火45 s,75 ℃延伸15 s,共循環(huán)35次。以U6為內源對照,以2-ΔΔCt的方法計算miR-21的表達水平。引物由上海烜雅生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 隨訪 對多發(fā)性骨髓瘤患者術后進行為期5年的隨訪。隨訪方式為電話隨訪或復診,隨訪內容為患者生存情況。隨訪終止時間為2022年1月,隨訪終點為患者死亡或到隨訪結束。

2 結果

2.1 兩組血清KLF10、miR-21表達水平 觀察組血清KLF10水平低于對照組,血清miR-21水平高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組血清KLF10、miR-21表達水平

2.2 觀察組血清KLF10、miR-21表達相關性 Pearson分析顯示,觀察組血清KLF10與miR-21水平呈負相關(r=-0.447,P<0.05)。見圖1。

圖1 KLF10與miR-21表達相關性分析

2.3 血清KLF10、miR-21表達與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床病理特征的關系 多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10中位值為26.26 ng/mL,miR-21的中位值為1.34。KLF10≥26.26 ng/mL為高表達,<26.26 ng/mL為低表達;miR-21≥1.34為高表達,<1.34為低表達。分析結果表明,多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10、miR-21水平與患者性別、年齡、免疫球蛋白分型無關(P>0.05),與患者DS分期、是否重度貧血、ECOG評分以及骨髓漿細胞比例有關(P<0.05)。見表3。

表3 KLF10、miR-21水平與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床病理特征的關系[n(×10-2)]

2.4 血清KLF10、miR-21水平與多發(fā)性骨髓瘤患者預后的關系 5年隨訪結果顯示,126例多發(fā)性骨髓瘤患者死亡49例,生存77例,總生存率為61.11%。

血清KLF10低表達組死亡33例(52.38%),生存30例(47.62%);血清KLF10高表達組死亡16例(25.40%),生存47例(74.60%)。血清miR-21低表達組死亡15例(23.81%),生存48例(76.19%);血清miR-21高表達組死亡34例(53.97%),生存29例(46.03%)。Kaplan-Meier生存曲線表明,多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10低表達組生存率低于高表達組(χ2=9.651,P=0.032);血清miR-21高表達組生存率低于低表達組(χ2=12.056,P=0.0024)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析KLF10、miR-21與多發(fā)性骨髓瘤患者預后的關系

2.5 Cox回歸分析影響多發(fā)性骨髓瘤患者預后的因素 以多發(fā)性骨髓瘤患者生存狀態(tài)為因變量(死亡=1,存活=0),以患者血清KLF10水平(低表達=1,高表達=0)、miR-21水平(高表達=1,低表達=0)、DS分期(Ⅲ期=1、Ⅰ～Ⅱ期=0)、是否重度貧血(有=1,無=0)、ECOG評分(>3分=1,≤3分=0)以及骨髓漿細胞比例(>30%=1,≤30%=0)為自變量進行COX回歸分析。單因素COX回歸分析顯示,血清KLF10低表達、血清miR-21高表達、DS分期Ⅲ期、重度貧血、ECOG評分>3分和骨髓漿細胞比例>30%均為影響多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預后的危險因素(P<0.05)。多因素COX回歸分析結果顯示,血清KLF10低表達、血清miR-21高表達、DS分期Ⅲ期、重度貧血、ECOG評分>3分和骨髓漿細胞比例>30%是影響多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預后的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 COX回歸分析影響多發(fā)性骨髓瘤患者預后的危險因素

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種骨髓漿細胞惡性增殖的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,可引起多種臟器功能損傷[9-11]。多發(fā)性骨髓瘤的主要臨床癥狀為骨痛、骨質疏松、貧血、感染、腎功能衰竭等[12-14]。隨著對多發(fā)性骨髓瘤的深入研究,以及治療策略改善、開發(fā)新藥等,多發(fā)性骨髓瘤患者生存期明顯提升,但由于其異質性、耐藥性、易復發(fā)等特點,目前其死亡率、復發(fā)率依然較高,且多發(fā)性骨髓瘤仍無法治愈,嚴重影響患者生活質量[15-16]。多發(fā)性骨髓瘤的具體發(fā)病機制尚不完全清楚,可能與電離輻射、感染、遺傳因素等多種機制有關[17]。

KLFs家族有17種亞型,其成員的異常表達與多種實體瘤、血液瘤關系密切,參與了癌細胞的增殖、分化、侵襲、轉移等過程[18]。KLF10屬于KLFs家族,是一種腫瘤抑制因子,具有調節(jié)癌細胞增殖、凋亡和炎癥反應等功能,在抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡中起重要作用[19]。有研究表明,在多發(fā)性骨髓瘤中KLF10低表達[20]。Lin等[21]研究發(fā)現,KLF10在胃癌中呈低表達,可作為胃癌的獨立預后因素。Yeh等[22]最近研究發(fā)現,KLF10在口腔鱗狀細胞癌中低表達,可作為其獨立預后因素。miRNA是一類內源性非編碼微小RNA,長度在18～25個核苷酸,在機體組織分化、免疫及各種疾病的調控中具有重要作用[7]。miR-21是miRNA的一種,在多種生物學功能中發(fā)揮作用,例如免疫反應、骨骼再生、成骨分化、癌癥等[23]。Handa等[24]研究發(fā)現,多發(fā)性骨髓瘤外泌體中miR-21呈高表達,促進骨髓瘤細胞的發(fā)展。還有研究發(fā)現,多發(fā)性骨髓瘤患者漿細胞中miR-21呈高表達,促進了腫瘤發(fā)展[25]。本研究結果顯示,觀察組血清KLF10水平低于對照組,血清miR-21水平高于對照組,提示二者參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Pearson相關性分析顯示,觀察組血清KLF10與miR-21水平呈負相關,提示miR-21可能通過負向調控KLF10的表達在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮作用。分析血清KLF10、miR-21水平與患者臨床病理特征的關系發(fā)現,多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10、miR-21水平均與患者DS分期、是否重度貧血、ECOG評分以及骨髓漿細胞比例有關,進一步提示二者與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系,下一步可開展實驗驗證二者關系,為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新思路。Kaplan-Meier生存曲線分析表明,多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10低表達組生存率低于高表達組,血清miR-21高表達組生存率低于低表達組。多因素COX回歸分析顯示,血清KLF10低表達、血清miR-21高表達、DS分期Ⅲ期、重度貧血、ECOG評分>3分和骨髓漿細胞比例>30%是影響多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預后的危險因素,提示血清KLF10、miR-21表達具有評估多發(fā)性骨髓瘤患者預后的作用,臨床可通過監(jiān)測患者血清KLF10、miR-21水平,合理制定治療方案,提高患者生存期和生活質量。

4 結論

多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10表達下調,miR-21表達上調,二者表達水平與患者臨床病理特征相關,且二者是多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預后的危險因素,與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。后續(xù)研究將擴大樣本量,深入探究二者相互作用關系以及多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制,為臨床治療提供依據。