FGF23對支氣管上皮細(xì)胞生長、免疫平衡和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

張舒晨 楊旭東 李丹丹 侯新芳 何喜寧

(1.陜西省康復(fù)醫(yī)院兒童康復(fù)科,陜西 西安 710065;2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 西安 710061)

支氣管哮喘作為一種發(fā)病率較高的慢性非傳染性疾病,嚴(yán)重危害人類健康。支氣管哮喘的病理特征主要表現(xiàn)為氣道的炎癥、重塑和高反應(yīng)性[1-2]。其中,氣道重塑在支氣管哮喘發(fā)生過程中的作用不容忽視。在氣道重塑過程中,氣道上皮屏障受損、上皮細(xì)胞黏附減少、上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞分化。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是氣道重塑過程中一個復(fù)雜的重編程過程,為上皮細(xì)胞提供間質(zhì)表型。EMT的發(fā)生是一種多基因調(diào)控的生物學(xué)過程,其通過幾種不同的途徑發(fā)生,在器官發(fā)生、組織修復(fù)、纖維化、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。EMT的發(fā)生涉及上皮標(biāo)志物(E-cadherin)的丟失和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(N-cadherin、α-SMA和vimentin)的增加。TGF-β1在哮喘患者血清中高表達(dá),并且與氣道重塑密切相關(guān)[3]。TGF-β1可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,從而加重氣道重塑[4]。因此,抑制EMT是減輕氣道重塑的關(guān)鍵。

成纖維細(xì)胞生長因子23(Recombinant fibroblast growth factor 23,FGF23)屬于成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)超家族成員,主要通過與成纖維細(xì)胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptor,FGFR)/Klotho復(fù)合物結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)功能[5]?，F(xiàn)有研究證實,FGF23通過激活FGFR4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大生長和增加肝細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[6]。另外,慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)患者血漿中FGF23水平顯著升高,香煙煙霧通過下調(diào)Klotho基因和激活氣道上皮中的FGFR4誘導(dǎo)COPD患者的氣道炎癥,該研究認(rèn)為抑制FGF23或FGFR4可能是針對COPD的一種新的抗炎策略[7]。本課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中FGF23水平升高?；谏鲜鲅芯勘尘?推測FGF23可能參與了哮喘的氣道重塑及EMT。因此,本研究以人支氣管上皮細(xì)胞16HBE為研究對象,旨在揭示FGF23對支氣管上皮細(xì)胞生長和EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司,青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司,Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司,重組TGF-β1購自美國R&D公司,IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10 ELISA試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司,RIPA裂解緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司,BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒、SDS-PAGE、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和TRIzol試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所,PVDF膜購自美國Millipore公司,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Thermo fisher公司,MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司,SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司,Triton X-100購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。本研究中所用的抗體均購自英國Abcam。

1.1.2 實驗細(xì)胞及培養(yǎng) 人支氣管上皮細(xì)胞16HBE購自美國ATCC公司,培養(yǎng)在含8%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2。

1.2 方法

1.2.1 16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染 委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成FGF23-shRNA重組質(zhì)粒及shRNA陰性對照質(zhì)粒(NC-shRNA),使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑對16HBE細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天將16HBE細(xì)胞以每孔1×105個細(xì)胞接種于500 μL不含抗生素的培養(yǎng)基中,用50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋20 pmol NC-shRNA或FGF23-shRNA,用50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋1 μL的Lipofectamine 3000。將上述稀釋液混合制備轉(zhuǎn)染液,輕輕混勻,室溫放置20 min,終體積為100 μL,每孔細(xì)胞中加入100 μL轉(zhuǎn)染液,輕輕搖勻,37 ℃下轉(zhuǎn)染48 h。

1.2.2 細(xì)胞分組和處理 將16HBE細(xì)胞分為對照組、NC-shRNA組、FGF23-shRNA組、TGF-β1組、NC-shRNA+TGF-β1組和FGF23-shRNA+TGF-β1組。對照組和TGF-β1組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,其他組細(xì)胞按照“1.2.1”所述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后,將各組16HBE細(xì)胞按照2 000個/孔(100 μL)的密度接種在96孔板中,對照組、NC-shRNA組和FGF23-shRNA組16HBE細(xì)胞用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng),TGF-β1組、NC-shRNA+TGF-β1組和FGF23-shRNA+TGF-β1組16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分別用含有10 ng/mL的TGF-β1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TGF-β1處理48 h后,去除培養(yǎng)基,加入10 μL的CCK-8試劑和100 μL無血清培養(yǎng)基,37 ℃和5% CO2下孵育4 h。用BioTek微板分光光度計檢測450 nm處的吸光度。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測16HBE細(xì)胞上清液中炎癥因子 16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TGF-β1處理48 h后,收集各組細(xì)胞上清,4 ℃下以500 r/min離心10 min,取上清液。按說明書檢測IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平。

1.2.5 Western blot檢測16HBE細(xì)胞中FGF23、Klotho、FGFR4、E-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平 將各組16HBE細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液裂解,裂解物在4 ℃下以15000 r/min離心15 min。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定總蛋白質(zhì)。樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜,采用TBST配制的5%脫脂牛奶封閉處理2 h后,將膜與一抗FGF23(1：1 000)、FGFR4(1：1 000)、Klotho(1：1 000)、E-cadherin(1：3 000)、α-SMA(1：3 000)和β-actin(1：5 000)于4 ℃過夜孵育。然后與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1：3 000)室溫孵育2 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影,β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.6 qRT-PCR檢測16HBE細(xì)胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA表達(dá) 使用TRIzol試劑提取16HBE細(xì)胞中總RNA。使用分光光度計檢測260 nm和280 nm處的光密度比,并使用隨機(jī)引物和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI PRISM 7500實時PCR系統(tǒng)和SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒對PCR擴(kuò)增反應(yīng)。GAPDH作為內(nèi)參,通過2-ΔΔCT確定目標(biāo)mRNA水平。引物序列如下：FGF23,正向：5′-GGCCTGATCCACCTGTACACA-3′,反向：5′-ACCACAAAGCCAGCATCCTCT-3′;FGFR4,正向：5′-GTGCTGCCAGAGGAAGACCT-3′,反向：5′-CAGGAGCACAAGCAGAACCA-3′;Klotho,正向：5′-TGTGACAGCCAATGGAATCG-3′,反向：5′-GGTTGATGTCGTCCAACACG-3′;β-actin,正向：5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′,反向：5′-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3′。

1.2.7 免疫熒光染色檢測16HBE細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達(dá) 16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TGF-β1處理48 h后,接種在蓋玻片上用PBS清洗3次,室溫下用4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌1次,0.5%的Triton X-100處理10 min,PBS洗滌3次,5%牛血清白蛋白孵育30 min。然后將細(xì)胞與一抗E-cadherin(1：500)和N-cadherin(1：500)在4 ℃下孵育過夜,再與Alexa Fluor 647標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1：500稀釋)在室溫黑暗中孵育1 h。細(xì)胞核用DAPI染色15 min。最后在熒光顯微鏡下成像。

2 結(jié)果

2.1 16HBE細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率驗證 對16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-shRNA或FGF23-shRNA后,各組細(xì)胞中FGF23的mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組16HBE細(xì)胞中FGF23的mRNA和蛋白的表達(dá)水平

2.2 FGF23對TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞增殖的影響 對16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-shRNA或FGF23-shRNA,以及TGF-β1處理48 h后,各組16HBE細(xì)胞的增殖能力檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細(xì)胞的OD450nm值降低,TGF-β1組OD450nm值升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細(xì)胞的OD450nm值降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 CCK-8檢測各組16HBE細(xì)胞的增殖情況

2.3 FGF23對TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞上清液中炎癥因子的影響 各組16HBE細(xì)胞上清液中炎癥因子水平檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-10水平升高,IL-4和IL-17水平降低(P<0.05)。與對照組相比,TGF-β1組細(xì)胞上清液中IFN-γ水平降低,IL-4、IL-17和IL-10水平升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-10水平升高,IL-4和IL-17水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組16HBE細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平pg/mL)

2.4 FGF23對TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞EMT的影響 各組16HBE細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高,α-SMA水平降低(P<0.05);與對照組相比,TGF-β1組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低,α-SMA水平升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高,α-SMA水平降低(P<0.05),見圖3。各組16HBE細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin的相對熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細(xì)胞中E-cadherin相對熒光強(qiáng)度升高,N-cadherin相對熒光強(qiáng)度降低(P<0.05);與對照組相比,TGF-β1組細(xì)胞中E-cadherin相對熒光強(qiáng)度降低,N-cadherin相對熒光強(qiáng)度升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細(xì)胞中E-cadherin相對熒光強(qiáng)度升高,N-cadherin相對熒光強(qiáng)度降低(P<0.05),見圖4。

圖3 Western blot檢測各組16HBE細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)水平

圖4 免疫熒光染色檢測各組16HBE細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達(dá)

2.5 FGF23對TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞中FGF23-Klotho-FGFR4信號的影響 各組16HBE細(xì)胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,FGF23-shRNA組細(xì)胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均降低,Klotho的mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與對照組相比,TGF-β1組細(xì)胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均升高,Klotho的mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均降低(P<0.05)。與TGF-β1組相比,FGF23-shRNA+TGF-β1組細(xì)胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均降低,Klotho的mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均升高(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 qRT-PCR檢測各組16HBE細(xì)胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA表達(dá)水平

圖6 Western blot檢測各組16HBE細(xì)胞中FGF23、Klotho、FGFR4的蛋白表達(dá)水平

3 討論

支氣管哮喘屬于一種氣道高反應(yīng)性疾病,支氣管上皮細(xì)胞是機(jī)體隔絕外界環(huán)境的第一道屏障[8]。研究表明,多種外源性刺激可引起支氣管上皮細(xì)胞中具有不同生物學(xué)功能的基因發(fā)生差異表達(dá)、釋放炎癥信號,進(jìn)而引起輔助性T(Th)細(xì)胞的活化、免疫失衡以及EMT的發(fā)生[9]。因此,本研究以16HBE細(xì)胞作為研究對象,觀察FGF23對16HBE細(xì)胞生長、免疫平衡以及EMT的影響。

FGF23是FGFs超家族成員,具有調(diào)控機(jī)體膽汁酸平衡、維持穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝等作用,FGF23主要通過與Klotho(FGF23的共同受體)及其受體FGFR結(jié)合來調(diào)節(jié)生物學(xué)效應(yīng)[10]。Krick等[7]研究表明,COPD患者血漿FGF23水平升高,FGF23可通過激活FGFR4增加人支氣管上皮細(xì)胞中IL-1β的釋放,從而加劇炎癥反應(yīng),導(dǎo)致免疫失衡。本研究前期實驗發(fā)現(xiàn)哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中FGF23水平升高。研究表明,支氣管上皮細(xì)胞再經(jīng)香煙煙霧等外界刺激后會發(fā)生異常增殖,以及促炎細(xì)胞因子的過量分泌[11]。此外,TGF-β1可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[4]。為了進(jìn)一步研究FGF23在哮喘發(fā)生過程中發(fā)揮的作用,本研究觀察下調(diào)FGF23對TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明,TGF-β1誘導(dǎo)了16HBE細(xì)胞的異常增殖,而下調(diào)FGF23則可抑制16HBE細(xì)胞的增殖。目前,也有文獻(xiàn)表明FGF23可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖[12]。綜上提示,FGF23具有促進(jìn)肺組織細(xì)胞增殖的作用,而抑制FGF23則可能是防止氣道重塑的一種策略。

當(dāng)受到外界刺激后,支氣管上皮細(xì)胞會分泌白介素、趨化因子和生長因子等一系列細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子可傳遞炎癥信號、募集多種炎癥細(xì)胞,從而引起機(jī)體免疫失衡,加重哮喘的嚴(yán)重程度[13]。在哮喘的發(fā)生發(fā)展中,Th細(xì)胞相關(guān)免疫功能紊亂起著重要作用。Th細(xì)胞分為4種亞型：分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞,分泌IL-4的Th2細(xì)胞,分泌IL-17的Th17細(xì)胞,以及分泌IL-10的Treg細(xì)胞[14]。目前,專家普遍認(rèn)為Th1/Th2和Treg/Th17的失衡是導(dǎo)致哮喘加重的關(guān)鍵因素。Th1細(xì)胞可以抑制肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的分化和增殖,Th2型細(xì)胞因子可阻止Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子[15-16]。IFN-γ是促進(jìn)Th0向Th1分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子,而IL-4是誘導(dǎo)Th2分化的關(guān)鍵因子,可推動嗜酸性粒細(xì)胞在哮喘患者肺部的聚集[17]。IL-17和IL-10在功能上相互拮抗,IL-17可募集中性粒細(xì)胞并吸引嗜酸性粒細(xì)胞,進(jìn)一步加劇哮喘發(fā)作[18]。據(jù)報道,哮喘患者血清中IL-4和IL-17水平升高,而IFN-γ和IL-10降低[19]。本研究結(jié)果顯示,下調(diào)FGF23表達(dá)升高了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-10的水平,而降低了IL-4和IL-17水平。這些結(jié)果表明FGF23可能通過改善Th1/Th2和Treg/Th17失衡來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫,從而抑制哮喘相關(guān)炎癥。

氣道重塑是支氣管哮喘的關(guān)鍵病理特征,在氣道重塑過程中,支氣管上皮細(xì)胞通過發(fā)生EMT來誘發(fā)氣道重塑[20]。EMT表現(xiàn)為E-cadherin等上皮標(biāo)記物的丟失,以及α-SMA和N-cadherin等間充質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,下調(diào)FGF23表達(dá)升高了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平,并抑制了α-SMA和N-cadherin的表達(dá),從而抑制16HBE細(xì)胞的EMT。

已有研究表明,COPD患者氣道中Klotho表達(dá)減少[21],Klotho作為協(xié)同因子與FGFR結(jié)合形成FGFR-Klotho復(fù)合物[22],啟動FGF23信號下游分子FGFR4,在缺少Klotho的情況下,FGF23可以激活FGFR4并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大生長和增加肝細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[6]。此外,Klotho基因敲除的小鼠氣道炎癥加劇,肺內(nèi)FGFR4表達(dá)增加,而Klotho基因的過度表達(dá)則可減輕氣道炎癥[7]。本研究結(jié)果表明,下調(diào)FGF23抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞中FGFR4的表達(dá),并促進(jìn)了Klotho的表達(dá)。這些結(jié)果提示通過抑制FGF23-Klotho-FGFR4信號通路可能是治療哮喘的一種有效途徑。

4 結(jié)論

下調(diào)FGF23抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的生長和EMT,并改糾正了Th1/Th2和Treg/Th17的失衡。FGF23-Klotho-FGFR4信號可能是哮喘治療的一種分子靶標(biāo)。