微藻鹽脅迫響應(yīng)分子機(jī)制研究進(jìn)展

沈天虹 齊孝博 趙瑞豐 馬欣榮

（1.天津科技大學(xué)省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457； 2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

微藻是一類(lèi)在顯微鏡下才能被識(shí)別的單細(xì)胞類(lèi)群體，由真核微藻和原核藍(lán)藻組成。真核微藻起源多系，并且具有漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史。原核藍(lán)藻，又稱(chēng)藍(lán)細(xì)菌，是地球上出現(xiàn)的最早可以進(jìn)行光合作用的原核宿主。微藻作為初級(jí)生產(chǎn)者之一，廣泛存在于各種自然環(huán)境中，甚至在鹽堿地和鹽湖等極端環(huán)境中也能發(fā)現(xiàn)其蹤跡［1］。作為光合生物，微藻能捕獲環(huán)境中的CO2來(lái)合成主要代謝物，即碳水化合物、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)以及一系列重要的商業(yè)化產(chǎn)品，如藻膽素、類(lèi)胡蘿卜素、甾醇、維生素等［2］。其中，中性脂類(lèi)和碳水化合物被認(rèn)為是適合生物燃料（生物柴油和乙醇）生產(chǎn)的初級(jí)生物分子［3］。因此，微藻被認(rèn)為是一種極具應(yīng)用前景的第三代生物柴油原料［4］。特別是富油新綠藻（Neochloris oleoabundan）、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）等被認(rèn)為是最具產(chǎn)油潛力的能源微藻［5-7］。此外，微藻能夠從工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活廢水中固定氮和磷，吸附重金屬，從而減少水質(zhì)污染［8］。據(jù)研究報(bào)道，利用小球藻屬例如普通小球藻（Chlorella vulgaris）、微小小球藻（Chlorella minutissima）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）進(jìn)行廢水處理的應(yīng)用實(shí)例較多，吸收效果顯著，效率高達(dá)90%以上［9-11］。因此，微藻有著廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景。圖1 簡(jiǎn)要介紹了微藻在不同領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖1 微藻在不同領(lǐng)域的應(yīng)用Fig.1 Applications of microalgae in different fields

然而，育種工作者在對(duì)微藻的擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)鹽度是限制其生物質(zhì)生產(chǎn)力的最重要的環(huán)境因素之一。過(guò)量的鹽分濃度會(huì)對(duì)微藻的生理、生化和代謝產(chǎn)生不利影響［12］。圖2 顯示了微藻中作為模式生物的淡水綠藻，萊茵衣藻（C.reinhardtii）在鹽脅迫下的細(xì)胞形態(tài)、生理、生化和分子水平的變化。

圖2 萊茵衣藻（C.reinhardtii）在受到鹽分脅迫時(shí)形態(tài)、生理、生化和分子水平上的變化Fig.2 Changes in morphology, physiology, biochemistry and molecular level of C.reinhardtii under salt stress

微藻廣泛地分布于陸地、海洋、淡水湖泊等領(lǐng)域，但絕大多數(shù)微藻屬淡水藻，淡水除了需要支持人類(lèi)活動(dòng)、糧食作物生產(chǎn)等之外，在微藻的大規(guī)模培養(yǎng)中也至關(guān)重要［13］。據(jù)估計(jì)，每產(chǎn)生1 kg 微藻生物量大約需要1 t 淡水。目前，地球上淡水資源占總水量的2.8%，而海洋約占地球總量的96.53%［14］。因此，利用海水養(yǎng)殖將減少大規(guī)模養(yǎng)殖微藻的淡水需求。如何讓微藻適應(yīng)海水中的高鹽脅迫并大量繁殖也成為一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。為了對(duì)微藻的耐鹽機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究，有必要采用多組學(xué)技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、分泌組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等，以深入了解并建立一個(gè)完整的微藻耐鹽、抗鹽機(jī)制圖譜［12,15-18］。附表1 簡(jiǎn)要總結(jié)了近10 年來(lái)研究者針對(duì)微藻在鹽脅迫下的“組學(xué)”分析結(jié)果。近些年，研究者們?cè)邴}湖、鹽堿地或者池塘已經(jīng)分離純化到一些新型耐鹽藻，相關(guān)耐鹽藻的基因組測(cè)序和挖掘其耐鹽基因也在有條不紊地進(jìn)行。本文闡述了目前已被研究發(fā)現(xiàn)的兩種不同類(lèi)型的微藻響應(yīng)鹽脅迫機(jī)制，同時(shí)著重總結(jié)了杜氏鹽藻、鹽生隱桿藻、皮克綠球藻等相關(guān)耐鹽藻的應(yīng)用實(shí)例。本文旨在為微藻以及高等植物的耐鹽性能的提高提供重要的理論和分子依據(jù)，并提供可行性策略。最后，討論了一些典型的鹽響應(yīng)基因在優(yōu)良藻種選育中的價(jià)值與應(yīng)用前景，并以萊茵衣藻（C.reinhardtii）為出發(fā)藻，對(duì)構(gòu)建高耐鹽性藻株所面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論。

1 微藻響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制

鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境脅迫之一，它會(huì)增加植物滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉積累至毒性水平。因此，植物通過(guò)多種機(jī)制來(lái)適應(yīng)鹽脅迫信號(hào)，例如調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)、激活滲透脅迫途徑、介導(dǎo)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)和細(xì)胞壁組成等［19］。多年來(lái)，研究者們已經(jīng)發(fā)表了多篇關(guān)于各種微生物和高等植物在鹽脅迫下生理反應(yīng)和其具體分子調(diào)控機(jī)制的相關(guān)綜述［19-21］。然而，關(guān)于微藻在鹽脅迫響應(yīng)的相關(guān)綜述卻罕有報(bào)道。鑒于此，本文系統(tǒng)闡述了真核微藻和原核藍(lán)藻響應(yīng)鹽脅迫的具體機(jī)制與各種策略。

1.1 真核微藻響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制

1.1.1 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重組 通過(guò)細(xì)胞膜吸收和輸出離子來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡是微藻應(yīng)對(duì)高鹽脅迫的重要策略之一。高濃度Na+會(huì)干擾其他陽(yáng)離子的吸收，尤其是K+。由于K+在植物中參與許多生理功能，所以在高鹽條件下維持胞質(zhì)K+/Na+比率是至關(guān)重要的［22］。

膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào)可以促使微藻主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)K+，從而賦予藻類(lèi)對(duì)高鹽度的耐受性。Foflonker 等［23］通過(guò)對(duì)皮克綠球藻（Picochlorum SENEW3）基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其中一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是Picochlorum SE3 具有廣泛耐鹽性所必不可少的。例如，與青綠藻（Ostreococcus tauri） 相 比，Picochlorum SE3 的contig_33.g34.t2 所編碼的6 個(gè)基因拷貝與擬南芥（Arabidopsis thaliana）鹽過(guò)度敏感基因AtNHX8 的同源性很高。AtNHX8 編碼一種質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與細(xì)胞內(nèi)Na+的外排。此外，Picochlorum SE3 基因組中編碼一個(gè)已被注釋為Na+/K+?ATP 酶亞基的基因，它參與到鈉從細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)外排且此過(guò)程依賴(lài)ATP。在高pH 條件下，Na+/K+?ATP 酶亞基相比于Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有更好的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)效果［24］。Na+/K+ATP 酶最初被認(rèn)為是動(dòng)物獨(dú)有的，但近來(lái)在一些藻類(lèi)中也發(fā)現(xiàn)了Na+/K+ATP 酶的同源基因，這些藻類(lèi)包括杜氏鹽藻（D.salina）［25］，赤潮異灣藻（Heterosigma akashiwo）［26］和 條 斑 紫 菜（Porphyra yezoensis）［27］。此外，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻（D.salina）能保持細(xì)胞內(nèi)Na+濃度低于外部培養(yǎng)基的濃度［28］，D.salina 的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能催化Na+的向內(nèi)流入，然后通過(guò)Na+?ATP 酶和質(zhì)膜電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)向細(xì)胞外輸出Na+。因此，杜氏藻的這種Na+輸出是一種進(jìn)化的、適應(yīng)高鹽環(huán)境的機(jī)制。有趣的是，似乎與海洋或高耐鹽藻類(lèi)不同，淡水或鹽敏感性微藻不能通過(guò)阻止Na+的攝取，而能通過(guò)積累K+或泵出Na+離子來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)離子濃度，從而將細(xì)胞恢復(fù)到其正常或接近正常的穩(wěn)態(tài)。

1.1.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累 真核藻類(lèi)大多具有剛性細(xì)胞壁，其改變細(xì)胞體積的能力有限，因此很大程度上依賴(lài)有機(jī)溶劑進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)［29］。這些有機(jī)溶劑，通常是指在高濃度下具有中性電荷和低毒性的有機(jī)小分子［30］。甘油是常見(jiàn)的有效相容性溶質(zhì)之一，由大多數(shù)鹽敏感性藻類(lèi)物種在高鹽脅迫下產(chǎn)生。它是一種終產(chǎn)物代謝物，因此生產(chǎn)和蓄積不會(huì)干擾其他代謝途徑。同時(shí)，甘油是分子量最小的有機(jī)滲透溶質(zhì)，因其滲透性太高使得其在原核生物中幾乎無(wú)法存留，只能部分存在于真核生物中［31］。有研究表明，萊茵衣藻（C.reinhardtii）在受到200 mmol/L NaCl 脅迫時(shí)，會(huì)在早期（2-4 h）快速積累甘油以應(yīng)對(duì)滲透脅迫［15］。同樣的，在高鹽脅迫下，杜氏鹽藻（D.salina）也積累大量甘油，并且它細(xì)胞內(nèi)積累的甘油含量能與外部鹽濃度成比例［32］。因此，杜氏鹽藻也常常被用作研究植物滲透調(diào)節(jié)模式的光合生物之一［33］。脯氨酸是另一種滲透主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，特別在高等植物和藻類(lèi)中，隨著鹽度的增加，其濃度也呈線(xiàn)性增加。和甘油一樣，它的分子量很低，帶中性電荷，而且具有較高可溶性。鹽脅迫下，微藻中脯氨酸的生物積累可能與△1?吡咯啉?5?羧酸合成酶（P5CS）有關(guān)［12］。除脯氨酸外，其他氨基酸如賴(lài)氨酸和亮氨酸也參與促進(jìn)真核綠藻如萊茵衣藻（C.reinhardtii）在高鹽條件下的生長(zhǎng)［34］。然而，關(guān)于這些氨基酸在滲透調(diào)節(jié)中的具體作用的研究并不多。而藍(lán)藻在高鹽條件下積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與真核微藻有一定的不同，下文會(huì)做具體闡述。

1.1.3 抗氧化防御通路的誘導(dǎo) 高鹽會(huì)誘發(fā)微生物體內(nèi)離子滲透和氧化應(yīng)激［35］。微藻在鹽脅迫下會(huì)產(chǎn)生各種活性氧（ROS），包括單線(xiàn)態(tài)氧（1O2）、超氧化物（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）［36］。ROS 在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)中充當(dāng)二級(jí)信使，激發(fā)各種非生物和生物脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，高ROS 的積累同時(shí)也會(huì)破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，影響細(xì)胞代謝和正常生理功能［37］。

為了清除過(guò)量的有毒ROS，微藻尤其是真核綠藻，能自身進(jìn)化形成多種ROS 防御途徑。各種抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）和過(guò)氧化物酶（POD）等以及非酶分子起到重要作用。其中，SOD 是抵抗ROS 的第一道防線(xiàn)，將超氧自由基置換為分子氧和過(guò)氧化氫來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激［38］。同時(shí)，H2O2后續(xù)可以被CAT、POD 或APX 分解為H2O 和O2［39］。除了酶促抗氧化系統(tǒng)中的相關(guān)酶具有ROS的解毒作用，一些非酶分子如抗壞血酸、谷胱甘肽、類(lèi)胡蘿卜素等，也可以作為抗氧化系統(tǒng)中的組分來(lái)緩解微藻細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷［37］。此外，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（AGC）被認(rèn)為是連接抗氧化劑和抗氧化酶循環(huán)來(lái)分解H2O2的基本代謝途徑［40］。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）是植物中催化氧化型抗壞血酸（AsA）轉(zhuǎn)化為還原型AsA 的關(guān)鍵酶之一。MDAR 通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸的還原狀態(tài)，在植物抗氧化脅迫反應(yīng)中起重要作用［41］。值得一提的是，Lin 等［42］研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增強(qiáng)脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性能促進(jìn)AsA 的再生，進(jìn)而調(diào)節(jié)萊茵衣藻抗氧化脅迫的AGC 循環(huán)活性。近期，Choi等［43］發(fā)現(xiàn)在氧化脅迫條件下誘導(dǎo)的堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子BLZ8 可以通過(guò)碳濃縮機(jī)制（CCM）來(lái)保護(hù)萊茵衣藻（C.reinhardtii）免受ROS的傷害。該研究結(jié)果為陸生植物如何通過(guò)CCM 途徑應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫提供了理論依據(jù)。

1.1.4 中樞代謝途徑的適應(yīng) 大多數(shù)真核微藻都屬淡水綠藻，在高鹽度環(huán)境中呈現(xiàn)出發(fā)育遲緩，超過(guò)一定的鹽度閾值，一般無(wú)法生存。這些淡水藻株通常利用各種中樞代謝途徑，包括糖酵解、肯尼迪途徑和卡爾文循環(huán)來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫［29］。

蛋白質(zhì)組學(xué)表明，萊茵衣藻（C.reinhardtii）和極地雪藻（C.nivalis）在應(yīng)對(duì)0.2 mol/L NaCl 脅迫時(shí)，卡爾文循環(huán)中的核酮糖?1, 5?二磷酸羧化酶小亞基（RuBisCO）在萊茵衣藻（C.reinhardtii）中的表達(dá)豐度降低。同時(shí)，RuBisCO 激活酶在這兩種微藻中的表達(dá)豐度也隨著鹽濃度增加而下降。RuBisCO 活性在C.reinhardtii 受到鹽脅迫時(shí)的降低說(shuō)明了其光合活性也在下降［18］。此外，在0.2 mol/L NaCl 環(huán)境中，C.nivalis 在3 d 后積累的碳水化合物總量達(dá)到細(xì)胞干重的10.4%，12 d 后積累的脂肪酸達(dá)到52.0%，這也表明了高鹽可以成為C.nivalis 脂質(zhì)積累的誘發(fā)劑。C.nivalis 也因其對(duì)環(huán)境變化的魯棒性和生物加工的低溫要求等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是一種有潛力的生產(chǎn)生物燃料的藻類(lèi)生物資源之一［44］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)表明，C.reinhardtii 中參與碳水化合物（葡萄糖、淀粉和可溶性糖等）的相關(guān)基因表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)［15］，例如參與葡萄糖代謝的UDP?葡萄糖焦磷酸化酶UGP1/2、UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶UGT?80 在早期鹽脅迫下的表達(dá)顯著增強(qiáng)。

1.1.5 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的感知 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在微生物中很常見(jiàn)，可以幫助生物體感知和響應(yīng)環(huán)境脅迫［45］。該系統(tǒng)中，鈣離子（Ca2+）在許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、非生物和生物脅迫等［46］。其中，鈣依賴(lài)蛋白激酶（CDPKs）被認(rèn)為是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的鈣（Ca2+）傳感器。Li等［47］從C.reinhardtii 基因組中鑒定出15 個(gè)CrCD?PK 基因，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)CrCDPKs 在氮缺乏和鹽脅迫下被顯著誘導(dǎo)。此外，絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）通過(guò)磷酸化反應(yīng)形成信號(hào)級(jí)聯(lián)的一部分，在所有真核生物中都保守存在。MAPK 級(jí)聯(lián)主要由3 種蛋白 組 成：MAPKKKs、MAPKKs 和MAPKs［48］。 有研究發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻（D.salina）中的MAPKK1（MEK1）有兩種剪接方式，分別是DsMEK1?X1、DsMEK1?X2，其中DsMEK1?X1 通過(guò)減少氧化損傷來(lái)響應(yīng)鹽脅迫，而DsMEK1?X2 通過(guò)調(diào)節(jié)甘油合成來(lái)維持滲透壓平衡進(jìn)而抵御鹽脅迫［49］。整體說(shuō)來(lái)，真核微藻中關(guān)于鹽脅迫下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的研究較少，仍處于探索階段。

1.2 原核藍(lán)藻響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制

1.2.1 活性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié) 和真核微藻一樣，通過(guò)表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)維持藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)離子平衡是微藻抗鹽脅迫的重要策略之一，已在藍(lán)藻中鑒定并表征了一系列與耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。到目前為止，在耐鹽藍(lán)藻鹽生隱桿藻（A.halophytica）中發(fā)現(xiàn)并證明了幾種具有耐鹽功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如nhap基因編碼的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［50］、假定F0F1 型Na+?ATP 合酶操縱子（ApNa+?ATP）［51］和類(lèi)Mrp 簇Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［52］，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能相應(yīng)的提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。此外，維持細(xì)胞內(nèi)高鉀水平是降低Na+對(duì)細(xì)胞毒性作用的另一種策略。有研究者發(fā)現(xiàn)集胞藻（Synechocystis sp.PCC 6803）中與鹽相關(guān)的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要由Ktr 和Kdp 系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)［53］。正是基于這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)，一些藍(lán)藻才能夠在應(yīng)對(duì)鹽脅迫時(shí)維持良好的細(xì)胞活性。

1.2.2 相容性溶質(zhì)的積累 與真核微藻在鹽脅迫下積累甘油不同，藍(lán)藻通常通過(guò)積累蔗糖、甘油葡萄糖苷和甘氨酸甜菜堿等相容性溶質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)高鹽脅迫［54］，而細(xì)長(zhǎng)聚球藻（S.elongatus UTEX 2973）則在鹽脅迫下能夠產(chǎn)生蔗糖（0.17 g/L）作為唯一的相容性溶質(zhì)［55］。此外，甘氨酸甜菜堿能夠在高鹽度和干旱等脅迫條件下通過(guò)生物合成［56］。生物體內(nèi)甜菜堿的生物合成途徑主要以膽堿為底物進(jìn)行的兩步氧化反應(yīng)。研究者也嘗試著將膽堿兩步氧化反應(yīng)所涉及的關(guān)鍵酶膽堿脫氫酶（BetA）和甜菜堿乙醛脫氫酶（BetB）外源引入到相關(guān)淡水微藻中，然而效果并不明顯［57-58］。幸運(yùn)的是，有研究報(bào)道從鹽生隱桿藻（A.halophytica）細(xì)胞中分離得到兩個(gè)N?甲基轉(zhuǎn)移酶，這兩個(gè)N?甲基轉(zhuǎn)移酶能夠催化以甘氨酸為底物，通過(guò)三步甲基化最終合成甘氨酸甜菜堿［59］。近年來(lái)，也有研究者將鹽生隱桿藻（A.halophytica）的甘氨酸甜菜堿合成途徑引入到魚(yú)腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）和煙草（tobacco）中，都取得了不錯(cuò)的抗鹽效果［60］?？傊?，相容性溶質(zhì)在高濃度鹽分下能使不同的酶有效運(yùn)作，在平衡外界介質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)之間的滲透壓中起著重要的作用［29］。

1.2.3 脂質(zhì)和烷烴的積累 一些藍(lán)藻能在鹽脅迫下積累脂質(zhì)和烷烴。例如，在鹽脅迫下聚球藻（Synechococcus sp.PCC 7942）脂質(zhì)積累增加并且其脂肪酸組成發(fā)生變化；在10、50、100、250 和500 mmol/L NaCl 條 件 下，Synechococcus sp.PCC 7942 的飽和脂肪酸（SFA）相比于對(duì)照組，分別降低了82.79%、12.67%、5.77%、74.18% 和4.58%；而 不飽和脂肪酸分別增加了102.72%、16.05%、7.67%、49.14%和6.17%［61］。由于不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸具有更低的熔點(diǎn)以維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，因此不飽和脂肪酸的增加可能是藍(lán)藻抵抗鹽脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)。在鹽脅迫下，聚球藻（Synechococcus sp.PCC 6311）體內(nèi)不飽和脂肪酸和磷脂酰甘油比例增加［62］。Ritter 和Yopp［63］又觀察到，當(dāng)耐鹽藍(lán)藻（A.halophytica）暴露于鹽脅迫時(shí)，單/雙半乳糖二?；视偷谋壤l(fā)生變化，這種鹽脅迫下極性脂質(zhì)的變化可能會(huì)減少鈉的流入并減少鹽脅迫下藍(lán)藻光合作用的損害［64］。此外，Yamamori 等［65］構(gòu)建了淡水藍(lán)藻聚球藻（Synechococcus sp.PCC 7942）中烷烴合成基因的缺失突變體。該突變體不能產(chǎn)生烷烴，并在低鹽度下表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)表型。但是，突變體變得對(duì)鹽敏感。然而，來(lái)自鹽生隱桿藻（A.halophytica）的烷烴合成基因在Synechococcus sp.PCC 7942 中過(guò)量表達(dá)時(shí)，該缺失突變體恢復(fù)了生長(zhǎng)缺陷并且其能在高鹽脅迫下產(chǎn)生大量的烷烴。

1.2.4 胞內(nèi)第二信使的調(diào)節(jié) 第二信使是由特定外部刺激調(diào)節(jié)而產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，細(xì)胞能通過(guò)依靠第二信使對(duì)環(huán)境變化做出快速反應(yīng)。已經(jīng)在藍(lán)藻中確定了一系列第二信使，它們?cè)诮閷?dǎo)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)失衡和環(huán)境溫度變化的反應(yīng)途徑中發(fā)揮作 用［66］， 如cyclic?di?AMP（c?di?AMP） 和cyclic?di?GMP（c?di?GMP）［67-68］。有研究表明，在鹽脅迫下，c?di?AMP 水平在集胞藻（Synechocystis sp）和聚球藻（Synechococcus sp.PCC 7942）中沒(méi)有變化，而在Fremyella diplosiphon 中較低，在魚(yú)腥藻（Anabae?na sp）中較高。同時(shí)，在山梨糖醇誘導(dǎo)的滲透脅迫下，c?di?AMP 水 平 在Synechocystis sp.PCC 6803 和F.diplosiphon 中都有一定增長(zhǎng)，在Anabaena sp.和Synechococcus sp.PCC 7942 中 卻 不 受 影 響［69］。與c?di?AMP 相比，c?di?GMP 于近年來(lái)才漸漸出現(xiàn)在一些微生物的報(bào)道中：在藍(lán)藻中，c?di?GMP 在趨光性和細(xì)胞聚集方面發(fā)揮作用［70］；而關(guān)于第二信使在藍(lán)藻中的研究仍處于初級(jí)階段，需要進(jìn)一步探索。

通過(guò)對(duì)這兩類(lèi)微藻鹽響應(yīng)機(jī)制的總結(jié)發(fā)現(xiàn)，真核藻和藍(lán)藻都能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)響應(yīng)鹽脅迫。其中值得注意的是，真核微藻通常積累甘油、脯氨酸等物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)高鹽損傷，而藍(lán)藻往往通過(guò)甘氨酸甜菜堿和蔗糖等滲透調(diào)節(jié)劑來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡。在面對(duì)高鹽脅迫時(shí)，都能觸發(fā)這兩種微藻的氧化應(yīng)激，而一些真核微藻特別是淡水綠藻中的一些抗氧化酶能有效清除氧化應(yīng)激過(guò)程中所產(chǎn)生的活性氧（ROS）。此外，一些真核微藻能夠利用糖酵解、肯尼迪途徑和卡爾文循環(huán)等中樞代謝途徑來(lái)應(yīng)對(duì)高鹽脅迫, 而一些藍(lán)藻如聚球藻等則通過(guò)積累脂質(zhì)和烷烴等生物大分子來(lái)抵抗鹽脅迫。一些信號(hào)蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫中起著至關(guān)重要的作用，真核微藻中的Ca2+傳感器和信號(hào)級(jí)聯(lián)蛋白激酶能在鹽脅迫下被顯著誘導(dǎo)，而對(duì)于藍(lán)藻而言，胞內(nèi)第二信使例如c?di?AMP和c?di?GMP 等水平會(huì)在鹽脅迫下有顯著變化。由此可見(jiàn)，不同微藻可以通過(guò)多種機(jī)制來(lái)適應(yīng)高鹽的極端環(huán)境，了解這些機(jī)制有助于微藻應(yīng)答鹽脅迫的系統(tǒng)化網(wǎng)絡(luò)的建立。除了上述提到的多種機(jī)制外，還有其他與鹽脅迫相關(guān)的基因或蛋白在這里未做具體闡述。因此，繼續(xù)探索微藻適應(yīng)鹽脅迫的策略意義重大。未來(lái)應(yīng)該繼續(xù)挖掘耐鹽基因/機(jī)制，進(jìn)而更高效地提高微藻的耐鹽性能。

2 天然耐鹽藻的開(kāi)發(fā)利用研究進(jìn)展

高鹽離子滲透和氧化脅迫會(huì)使微藻生長(zhǎng)遲緩［29］。因此，研究者們通過(guò)各種手段來(lái)增加微藻的耐鹽性。已有研究表明，適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（adaptive laboratory evolution，ALE）是一種提高微生物極端環(huán)境耐受性的有效方法之一［71］。在一項(xiàng)研究中，萊茵衣藻（C.reinhardtii CC?503）通過(guò)在含有200 mmol/L NaCl 的液體TAP 培養(yǎng)基中連續(xù)傳代馴化培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)1 255 代后，進(jìn)化鹽（evolved salt，ES）細(xì)胞在高鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度與起始細(xì)胞（progenitor cells）相當(dāng)［72］。Kato 等［73］采用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化和誘變相結(jié)合的方法來(lái)試圖提高衣藻（Chlamydomonas sp.JSC4）在高鹽條件下的生物量。經(jīng)過(guò)在5%和7%海鹽下的長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)，獲得了在7%海鹽下也生長(zhǎng)良好的耐鹽藻株（KNA?001 和 KHI10?50/40?100）。雖然ALE 被證明是可行的，但是在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)微藻進(jìn)行長(zhǎng)期高鹽馴化不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且還存在效率低和ALE 機(jī)制分析不清晰等問(wèn)題。

植物轉(zhuǎn)基因手段也是提高淡水藻株耐鹽能力的另一條可行途徑。來(lái)源于微藻的且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明與耐鹽相關(guān)的基因已總結(jié)于附表2 中。近期，科學(xué)家們也在不斷開(kāi)發(fā)天然耐鹽藻，挖掘它們潛在的耐鹽基因，為植物耐鹽工程的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。例如杜氏鹽藻（D.salina）就是一種極好的天然耐鹽藻，它能夠在0.05-5.5 mol/L 左右的飽和NaCl 濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好［74］，D.salina 又能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甘油濃度維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓［75］。Gong 等［76］為了鑒定杜氏鹽藻中具有潛在耐鹽作用的新基因，建立了D.salina cDNA 文庫(kù)，并通過(guò)電穿孔將D.salina cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化進(jìn)雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的雨生紅球藻在不同鹽濃度的平板中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)化子的表型變化。其中Ds?26?16 過(guò)表達(dá)雨生紅球藻藻株生長(zhǎng)良好，且該基因被認(rèn)為是潛在的鹽脅迫響應(yīng)候選基因。過(guò)表達(dá)Ds?26?16 的轉(zhuǎn)基因煙草（tobacco）葉表面積、莖高、根長(zhǎng)、總?cè)~綠素和葡萄糖含量都顯著增加。杜氏鹽藻已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如耐鹽機(jī)理研究、廢水處理、重組蛋白表達(dá)、生物燃料生產(chǎn)和天然材料制備等，在生物工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。除了杜氏鹽藻外，從美國(guó)太陽(yáng)湖分離出來(lái)的耐鹽藍(lán)藻鹽生隱桿藻（A.halophytica）可以在0.25-3.0 mol/L NaCl 的鹽度范圍和外界高達(dá)pH 11.0 的極端堿性條件下生長(zhǎng)［77］。在過(guò)去的近20 年間，科學(xué)家們也鑒定并克隆得到A.halophytica 的一些耐鹽基因［50-51,59］（附表2），例如表達(dá)ApNhap 編碼的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠使淡水藍(lán)藻聚球藻細(xì)胞（Synechococcus sp.PCC 7942）在0.65 mol/L NaCl 鹽激下持續(xù)生長(zhǎng)10 h，并且可以在含有0.5 mol/L NaCl 的條件下正常存活和生長(zhǎng)。遺憾的是，已被認(rèn)可的相當(dāng)一部分天然耐鹽藻的遺傳轉(zhuǎn)化手段還未被建立，基因組測(cè)序也并未完成，有些微藻的耐鹽機(jī)制的解析也并不明朗，這也為后續(xù)的遺傳育種工作增加了難度。

3 總結(jié)與展望

作為最嚴(yán)重的非生物脅迫之一，高鹽極大地削弱了全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，高鹽嚴(yán)重影響了植物的正常生理/生化機(jī)制。植物生理/生化調(diào)控、轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)制和表觀遺傳變化能夠隨著時(shí)間的推移顯著影響物種的表型和分布［78］。在鹽脅迫下，微藻的各種鹽應(yīng)答機(jī)制的正常運(yùn)作對(duì)其在脅迫條件下的健康生長(zhǎng)顯得尤為重要。

幾種負(fù)責(zé) Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子穩(wěn)態(tài)、ROS 清除系統(tǒng)等基因/蛋白質(zhì)已被報(bào)道用于提高微藻乃至高等植物的耐鹽性。值得注意的是，從耐鹽藻的開(kāi)發(fā)總結(jié)中發(fā)現(xiàn)在淡水固氮藍(lán)藻魚(yú)腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）通過(guò)三親轉(zhuǎn)化法表達(dá)來(lái)自鹽生隱桿藻（A.halophytica）甘氨酸甜菜堿合成途徑中的關(guān)鍵酶ApGSMT?DMT，轉(zhuǎn)化子細(xì)胞獲得了一定耐鹽性［54］。Anabaena sp.作為光合固氮藻株在熱帶稻田的碳氮循環(huán)中起著重要作用，然而，魚(yú)腥藻對(duì)鹽極度敏感。因此，通過(guò)基因改造提高魚(yú)腥藻細(xì)胞的耐鹽性具有重要意義。獲得鹽耐受性的工程魚(yú)腥藻不僅能在不添加任何外來(lái)物質(zhì)的情況下從頭合成甜菜堿，且甜菜堿含量能隨著鹽濃度的增加而提高，這也為魚(yú)腥藻在固氮減排和清潔生產(chǎn)提供了強(qiáng)大助力。微藻中一些典型的鹽響應(yīng)基因資源不僅在微藻育種中發(fā)揮著重要作用，也可以用于提高一些例如煙草（tobacco）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等高等植物的抗逆性。來(lái)自A.halophytica 的DnaK1基因在煙草中過(guò)量表達(dá)時(shí)，經(jīng)0.6 mol/L NaCl 處理3 d 后，轉(zhuǎn)基因煙草的固碳能力比對(duì)照細(xì)胞高約50%；在40℃的培養(yǎng)溫度下，有82% 的轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽，而只有27% 的對(duì)照種子發(fā)芽［79］。通過(guò)這些實(shí)例不難看出微藻的鹽響應(yīng)基因?qū)χ参镌诿{迫條件下的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)隨著氣候變化如長(zhǎng)時(shí)間的熱浪、高強(qiáng)度的降雨和高二氧化碳濃度等對(duì)植物的生長(zhǎng)都產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響，一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、熱休克蛋白和抗氧化酶不僅在植物耐鹽性中起作用，在其他的非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用。因此，微藻中鹽響應(yīng)基因資源的挖掘?qū)Ω纳浦参锟鼓嫘阅?、增?qiáng)微藻生產(chǎn)力和維持生態(tài)平衡至關(guān)重要。同時(shí)，前文提到在一定鹽脅迫下，微藻能將細(xì)胞資源轉(zhuǎn)向脂質(zhì)積累，如油脂、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、蝦青素等，說(shuō)明一些抗鹽性能良好的藻株又是豐富的脂質(zhì)資源。

隨著這些鹽脅迫響應(yīng)基因的陸續(xù)發(fā)掘，目前也已經(jīng)選育出許多優(yōu)秀的轉(zhuǎn)基因藻株，然而迄今為止，只有少數(shù)幾種耐鹽微藻能夠被生物利用，因?yàn)榧?xì)胞表型通常是受多基因調(diào)控，單基因或單代謝通路的簡(jiǎn)單操作可能不會(huì)對(duì)植物實(shí)現(xiàn)精確有效的實(shí)時(shí)調(diào)控，也就無(wú)法通過(guò)單一操作來(lái)大幅度提升微藻的耐鹽性。此外，上文總結(jié)發(fā)現(xiàn)許多天然耐鹽藻的基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)化手段并不完整，某些在耐鹽藻中被挖掘的耐鹽基因的調(diào)控機(jī)制也并不明朗。試圖進(jìn)一步深入探討這些耐鹽微藻特殊抗逆基因的功能需要構(gòu)建合適的分子生物學(xué)平臺(tái)，萊茵衣藻便是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。萊茵衣藻作為基礎(chǔ)科學(xué)和應(yīng)用生理學(xué)和生物化學(xué)的模型已經(jīng)被研究了超過(guò)40 年［80］。同時(shí)，萊茵衣藻具有細(xì)胞核基因組、葉綠體基因組和線(xiàn)粒體基因組3 套遺傳系統(tǒng)，基因組測(cè)序也已完成。它的核基因組中編碼C.reinhardtii 還含有一系列與脅迫相關(guān)的基因，因此可以被廣泛用于研究脅迫誘導(dǎo)的反應(yīng)機(jī)制。它能夠在光能自養(yǎng)或異養(yǎng)條件下快速生長(zhǎng)，適合經(jīng)典的遺傳分析。在萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)可以通過(guò)過(guò)表達(dá)基因、RNA 干擾和CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)來(lái)揭示耐鹽基因的功能［81-82］。萊茵衣藻在不同脅迫下的響應(yīng)使其也能成為表征高等植物復(fù)雜脅迫轉(zhuǎn)錄組的理想系統(tǒng)。因此，C.reinhardtii 是可以作為研究光合生物中細(xì)胞鹽脅迫反應(yīng)分子機(jī)制的良好模式生物。

目前在微藻中僅鑒定并克隆得到了有限的一些耐鹽基因。因此，為了推進(jìn)微藻耐鹽工程的發(fā)展，除了利用多組學(xué)方法（即基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等）來(lái)探究鹽脅迫條件下與微藻表型相關(guān)的脅迫應(yīng)答基因、蛋白質(zhì)、代謝物和代謝途徑外；不同基因組編輯工具，如成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR 相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas）和CRISPR/Cpf1 等工具也需要同時(shí)被充分發(fā)揮作用，共同推進(jìn)微藻以及高等植物的抗鹽工程的發(fā)展。隨著合成生物學(xué)和人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)關(guān)鍵抗逆元件進(jìn)行靶向改造和理性設(shè)計(jì)將對(duì)微藻鹽脅迫研究的可持續(xù)發(fā)展和應(yīng)用具有極大的意義。

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