腸侵襲性大腸埃希菌噬菌體DK-13 的生物學(xué)特性及應(yīng)用

王夢(mèng)雅 劉家齊 姜海霖 李菁華 趙春燕 黃紅蘭

（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，長春 130021）

大腸埃希菌（Escherichia coli, E.coli）屬于革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界中，絕大多數(shù)屬于正常菌群，但其在具有某些特定毒力因子時(shí)具有致病性，能引起人和動(dòng)物共同感染［1］。且可通過污染被屠宰動(dòng)物或其他動(dòng)物源性食品等途徑從食物鏈感染人體［2］，可引起腹部絞痛，帶血和黏液的腹瀉等癥狀［3］?？股匾恢笔强咕闹匾侄沃?，但由于抗生素的濫用，耐藥菌株的大量出現(xiàn)，導(dǎo)致了未來沒有針對(duì)耐藥菌的藥物可用的情況［4］。因此迫切需要開發(fā)具有替代作用的新的抗菌策略［5］。

噬菌體在自然界中種類繁多，具有高度多樣化，基本感染現(xiàn)存的所有細(xì)菌［6］。其基因組編碼的蛋白質(zhì)可用于食品安全防治、耐藥菌株引起的感染治療等［7］。噬菌體還被發(fā)現(xiàn)在對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的牲畜的殺菌方面有較好的效果，從而限制病原體進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)，還可用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的病原體［8］。例如，噬菌體產(chǎn)品SalmoFreshTM和EcoShiledTM已被開發(fā)并批準(zhǔn)用于食品工業(yè)，以抑制食源性微生物［9-10］。噬菌體裂解細(xì)菌的功效已經(jīng)在各種研究中得到證實(shí)，使用噬菌體成為用于食品安全防治的有效方法［11-12］。由于多數(shù)噬菌體裂解宿主菌的專一性，需篩選并分離新的噬菌體以擴(kuò)增噬菌體庫以增加宿主范圍，為未來雞尾酒噬菌體制劑應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考［13］。

本研究分離得到一株特異性較強(qiáng)的能裂解腸侵襲性大腸埃希菌的噬菌體，是一種潛伏期短、裂解效率高、耐高溫以及耐酸堿的烈性噬菌體，具有應(yīng)用于食品安全防治的潛力，為以后解決食品污染問題提供了一種新的解決策略。另外本研究還進(jìn)行全基因組測(cè)序并分析預(yù)測(cè)了裂解宿主菌的相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究噬菌體應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和污水樣品 宿主菌腸侵襲性大腸埃希菌D1 從污染肉制品分離，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存，經(jīng)PCR 鑒定為腸侵襲性大腸埃希菌，實(shí)驗(yàn)所用其他大腸埃希菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存［14］。污水樣品采集于吉林大學(xué)第一醫(yī)院污水處理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基、主要試劑和儀器 營養(yǎng)瓊脂（NA）、營養(yǎng)肉湯（NB）、改良克氏雙糖鐵培養(yǎng)基管，青島高科園海博技術(shù)有限公司；聚乙二醇（PEG8000），Beijing Biotopped Science； DNaseI 酶，RNaseA 酶，大連TaKaRa 公司；SM 緩沖液，武漢卡諾斯科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris 堿,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；無水乙醇、冰醋酸，天津市化學(xué)試劑有限公司；硫酸，錦州古城化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，湖北鑫潤德化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 宿主菌的分離與鑒定 吸取20 μL EIEC 凍干粉溶解液加入10 mL NB 中，37℃，160 r/min 培養(yǎng)5 h 后，用無菌接種環(huán)蘸取菌液進(jìn)行分區(qū)劃線，過夜37℃培養(yǎng)，第2 天觀察形態(tài)，挑取單菌落加入NB中培養(yǎng)后保存。挑取EIEC 單菌落進(jìn)行PCR 確認(rèn)試驗(yàn)以鑒定。

1.2.2 裂解性噬菌體的初步篩選 將未經(jīng)處理的醫(yī)院污水取出300 mL 加入1.8 g 固體CaCl2（0.6%）靜置30 min，5 000 r/min 離 心10 min，取100 mL 的污水上清液和100 mL NB，并與5 mL EIEC 的新鮮菌液混合，37℃培養(yǎng)過夜。次日5 000 r/min 離心3 min，經(jīng)0.45 μm 濾器過濾后得到噬菌體初提液。取500 μL EIEC 菌液加入試管中，再加入5 mL 半固體培養(yǎng)基（50℃左右），凝固后在表面中心處滴加2-3滴噬菌體初提液，晾干后倒置放入培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)過夜。次日觀察平板中心是否出現(xiàn)噬菌斑。

1.2.3 噬菌體的分離純化及測(cè)定滴度 挑出形態(tài)最好的噬菌斑加入宿主菌液中培養(yǎng)8 h，5 000 r/min 離心3 min，所得上清液用0.45 μm 濾器過濾，得到噬菌體純化液。取100 μL 噬菌體液倍比稀釋液與100 μL 宿主菌液混合于試管中，再加入5 mL 半固體培養(yǎng)基（50℃左右），混勻后倒在瓊脂平板上，凝固后37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日觀察平板上的噬菌斑形態(tài)，挑取單個(gè)噬菌斑重復(fù)上述操作7-10 次，最終得到純化后的純種噬菌體。

將純化后的噬菌體液進(jìn)行倍比稀釋，重復(fù)一次純化的步驟，37℃恒溫培養(yǎng)過夜后，次日觀察并記錄各稀釋梯度平板上噬菌斑的數(shù)量，依據(jù)公式算出噬菌體的滴度。

1.2.4 噬菌體形態(tài)觀察 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［15］中關(guān)于噬菌體顆粒的PEG/NaCl 沉淀提取法進(jìn)行噬菌體純化顆粒制備，噬菌體顆粒溶于SM 緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆茫挥秘?fù)染色法對(duì)噬菌體顆粒進(jìn)行染色，取20 μL 噬菌體顆粒與20 μL 濃度為0.5%的戊二醛混合，滴在銅網(wǎng)上靜置15 min，使噬菌體顆粒固定。用2%的磷鎢酸對(duì)噬菌體顆粒進(jìn)行負(fù)染色1-2 min，用濾紙吸干多余液體，用透射電鏡在80 kV 電壓下觀察。拍照并儲(chǔ)存。

1.2.5 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）測(cè)定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，OD600nm≈0.2，菌液濃度約為1×109CFU/mL 的宿主菌液，與已知滴度的噬菌體液（2×109CFU/mL）倍比稀釋，按照噬菌體滴度與宿主菌濃度的比值分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 的比例混勻，37℃，160 r/min培養(yǎng)4 h，取出后用0.45 μm 濾器過濾，濾液倍比稀釋后測(cè)定各體系下的噬菌體滴度，滴度最高的體系的比值即噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)，重復(fù)3 次。

1.2.6 噬菌體一步生長曲線及爆發(fā)量測(cè)定 取最佳MOI 對(duì)應(yīng)的宿主菌液和噬菌體液各500 μL，放入培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)10 min，將混合液8 000 r/min 離心30 s，吸棄上清液，然后加入1 mL NB 吹打使沉淀重懸，重復(fù)兩次。在錐形瓶中加入此懸液，再加19 mL 營養(yǎng)肉湯，放入搖床，37℃，160 r/min，開始每5 min 取樣1 mL，30 min 后，每10 min 取樣1 mL，至100 min 停止取樣。每次取樣都需用0.45 μm 濾器過濾，然后暫時(shí)放入4℃保存，待全部取樣完成后，統(tǒng)一取出進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定噬菌體滴度，重復(fù)3 次。

1.2.7 噬菌體的熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性試驗(yàn)

（1）噬菌體熱穩(wěn)定性。將噬菌體液分成4 組，每組6 mL，分別放入50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中，每隔10 min 取1 mL 噬菌體液稀釋10 倍，防止高溫影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，暫時(shí)放入4℃保存，待全部取樣完成后，統(tǒng)一取出進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定噬菌體滴度，重復(fù)3 次。

（2）噬菌體pH 穩(wěn)定性。取1 mL 的噬菌體液加入9 mL 不同pH（1-14）的營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫培養(yǎng)1 h，取出后進(jìn)行倍比稀釋，用上文的方法測(cè)定噬菌體滴度，重復(fù)3 次。

1.2.8 噬菌體宿主范圍測(cè)定 將實(shí)驗(yàn)室保存的其他大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌全部復(fù)蘇并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取500 μL 菌液加入小試管中，再加入5 mL 半固體培養(yǎng)基（50℃左右），混勻后使半固體培養(yǎng)基平鋪在瓊脂平板上，凝固后在中心處滴加2-3 滴噬菌體液，晾干后37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日觀察各個(gè)平板中心是否出現(xiàn)噬菌斑。

1.2.9 噬菌體DK?13 全基因組測(cè)序及分析 按1.2.4方法獲得的500 μL 噬菌體濃縮液，加入2.5 μL DNase I（1 mg/mL） 和0.5 μL RNase A（1 mg/mL），之 后 加 入25 μL EDTA，25 μL 蛋 白 酶K 和20 μL SDS，56℃水浴1 h,裂解噬菌體。隨后使用苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）提取噬菌體DNA，送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。使用在線軟件tRNAscan?SE 預(yù)測(cè)噬菌體中是否含有tRNA;CG view 展示序列中GC skew? 和GC skew+等特性情況的圓形基因圖。

使用ORFs Finder 預(yù)測(cè)噬菌體DK?13 的開放閱讀 框（ORF）；使 用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）預(yù)測(cè)并注釋每個(gè)開放閱讀框的功能；使用VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)噬菌體DK?13 是否含有毒力基因；使用CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)測(cè)噬菌體DK?13 是否含有耐藥基因。

選取噬菌體DK?13 的保守基因DNA 連接酶進(jìn)行BLASTP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），尋找同源性蛋白，再使用MEGA6（https://www.megasoftware.net/）軟件鄰域連接構(gòu)建噬菌體DNA 連接酶的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。

1.2.10 細(xì)菌污染豬肉模型制備及不同溫度下噬菌體DK?13 對(duì)污染豬肉的殺菌效果 參考Li 等［16］的實(shí)驗(yàn)方法，將從超市購買的豬里脊肉部分用無菌刀片切成邊長約為2 cm 的正方形薄片，用1 mL PBS 緩沖液沖洗，紫外滅菌2 h，使肉片充分滅菌。滴加100 μL 濃度為1×107CFU/mL 的宿主菌液滴在肉片表面，使其充分接觸，靜置10 min，得到濃度為1×106CFU/sample 的EIEC 污染的豬肉樣品，放入4℃冰箱保存。

取最佳感染復(fù)數(shù)的宿主菌液的噬菌體液滴在豬肉樣品表面，使其與樣品充分接觸進(jìn)行殺菌，對(duì)照組則滴加等體積的PBS 緩沖液，分別放入4℃冰箱和37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。每隔1 h 取樣一次，加入裝有PBS 緩沖液的離心管中，充分震蕩后在相應(yīng)溫度下，5 000 r/min 離心1 min，吸棄上清后再加1 mL PBS 緩沖液，重懸后在相應(yīng)溫度下5 000 r/min 離心1 min，重復(fù)兩次。將最后一次懸液梯度稀釋，取100 μL 菌液均勻涂布在平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日對(duì)平板上菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離及其滴度測(cè)定

從醫(yī)院未經(jīng)處理的污水中分離出了一株烈性噬菌體，命名為DK?13，采用雙層平板法純化后，得到了純化后的單一噬菌體，噬菌體DK?13 的噬菌斑為圓形，透明且無暈環(huán)，直徑約為1-2 mm。結(jié)果如圖1?A 所示。

圖1 噬菌體DK-13 的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of phage DK-13

通過計(jì)算可以得出噬菌體DK?13 的滴度約為2×109PFU/mL。

2.2 噬菌體形態(tài)學(xué)觀察

如圖1?B 所示，噬菌體DK?13 呈典型的蝌蚪狀外形，包含一個(gè)直徑約為100 nm 的正二十面體的頭部和一個(gè)可收縮的螺旋對(duì)稱的尾部，根據(jù)ICTVdb 數(shù)據(jù)庫的規(guī)則分類，噬菌體DK?13 屬于有尾噬菌體目（Caudovirales）肌尾噬菌體科（Myoviridae）T4 噬菌體亞科（Tevenvirinae）噬菌體。

2.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

噬菌體DK?13 與宿主菌EIEC 的感染復(fù)數(shù)為0.01時(shí)，產(chǎn)生子代噬菌體的數(shù)量最多，效價(jià)為2.8×1010PFU/mL, 說明噬菌體DK?13 的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01（圖2?A）。

圖2 噬菌體DK-13 的生物學(xué)特性Fig.2 Biological characters of phage DK-13

2.4 噬菌體一步生長曲線及爆發(fā)量的測(cè)定

取最佳感染復(fù)數(shù)0.01 對(duì)應(yīng)的宿主菌液和噬菌體液各500 μL，測(cè)定不同時(shí)間噬菌體的滴度。以時(shí)間為橫軸，噬菌體滴度的對(duì)數(shù)為縱軸，繪制一部生長曲線。結(jié)果如圖2?B 所示，噬菌體DK?13 的潛伏期約為10 min，裂解期約為70 min，平均爆發(fā)量為164 PFU/cell。

2.5 噬菌體穩(wěn)定性的測(cè)定

2.5.1 噬菌體在不同溫度下的穩(wěn)定性 本試驗(yàn)測(cè)試了噬菌體DK?13 在50℃、60℃、70℃和80℃的條件下，1 h 之內(nèi)的活性情況。結(jié)果如圖3?A 所示，在50℃和60℃時(shí)，噬菌體的活性幾乎不發(fā)生變化；70℃下噬菌體活性下降，20 min 后完全失活；溫度升高至80℃，噬菌體10 min 后完全失活。結(jié)果表明噬菌體DK?13 受溫度影響較小。

圖3 噬菌體DK-13 的生物學(xué)特性Fig.3 Biological characteristics of phage DK-13

2.5.2 噬菌體在不同pH 下的穩(wěn)定性 噬菌體DK?13在pH 1-14 的環(huán)境下，1 h 之內(nèi)的存活情況測(cè)試結(jié)果如圖3?B 所示：在pH 5-10 的條件下，對(duì)噬菌體DK?13 的活性并沒有很大的影響，噬菌體均體現(xiàn)了較高的活性；在pH 4 或pH 11 的條件下，噬菌體的活性略有下降，但依然有大量噬菌體存活；在pH＜4或pH＞11 的條件下，幾乎檢測(cè)不到存活的噬菌體。

2.6 噬菌體宿主范圍的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)室保存的其他15 株大腸埃希菌，2 株蠟樣芽孢桿菌，3 株金黃色葡萄球菌全部復(fù)蘇并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用噬菌體DK?13 進(jìn)行裂解測(cè)定，結(jié)果顯示噬菌體DK?13 不能裂解以上任何細(xì)菌，只能裂解宿主菌EIEC。說明噬菌體DK?13 的特異性非常強(qiáng)。詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 噬菌體DK-13 宿主范圍Table 1 Host range of DK-13 phage

2.7 噬菌體全基因組分析

測(cè)序結(jié)果顯示：噬菌體DK?13 基因組全長172 275 bp，GC 含量為40.18%。tRNAscan?SE 分析結(jié)果顯示：噬菌體DK?13 基因組中含有tRNAMet、tRNAArg。噬菌體DK?13 的全基因組信息已上傳至GenBank，登錄號(hào)為MT611523。

2.8 噬菌體功能注釋

目前在VFDB 中尚未檢索到噬菌體DK?13 存在毒力基因；在CRAD 數(shù)據(jù)庫中也尚未檢索到噬菌體DK?13 存在耐藥基因。使用ORFs Finder 和BLAST預(yù)測(cè)噬菌體DK?13 的開放閱讀框并注釋其功能，預(yù)測(cè)其共有293 個(gè)開放閱讀框（ORF），其中已知功能的ORFs 共有125 個(gè)，可分為6 個(gè)模塊：復(fù)制/重組模塊、包裝基因模塊、結(jié)構(gòu)基因模塊、核苷酸代謝基因模塊、轉(zhuǎn)錄/翻譯模塊和其他功能模塊，使用DNAMAN 繪制噬菌體DK?13 的基因組注釋圖譜（圖4）。具體包括：（1）復(fù)制/重組模塊：DNA 聚合酶（ORF73）在催化合成DNA 中有著重要作用，相關(guān)基因還有DNA 連接酶（ORF47）、DNA 解旋酶（ORF92、140、167）。（2）包裝基因模塊：末端酶小亞基（ORF3）和末端酶大亞基（ORF13）。在噬菌體復(fù)制過程中，需要對(duì)DNA 進(jìn)行包裝這需要ATP 引導(dǎo)的末端酶蛋白負(fù)責(zé)將DNA 切成大小序列。T holin 溶解介體（ORF101）是DK?13 參與裂解宿主菌的相關(guān)基因，在裂解宿主菌的過程中起著重要作用。（3）結(jié)構(gòu)基因模塊：與結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白編碼基因包括主要頭部蛋白（ORF22）、小外衣殼蛋白（ORF152）及短尾纖維蛋白（ORF7），它們?cè)谑删w吸附或感染起到重要作用。（4）核苷酸代謝基因模塊：包括還原酶小亞基（ORF76），核苷三磷酸焦磷酸水解酶（ORF155）等核苷酸代謝所需的相關(guān)酶類。（5）轉(zhuǎn)錄/翻譯模塊：與噬菌體的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的基因有轉(zhuǎn)錄修飾子（ORF135）和翻譯阻遏蛋白（ORF175）等7 個(gè)噬菌體基因在噬菌體合成相關(guān)蛋白過程中發(fā)揮作用。（6）其他功能基因：這一模塊主要是一些目前對(duì)其在噬菌體內(nèi)的功能尚不可知的蛋白。

圖4 噬菌體DK-13 基因組注釋圖譜Fig.4 Annotation diagram of the genome of DK-13 phage

2.9 噬菌體進(jìn)化分析

基于噬菌體DK?13 的DNA 連接酶序列，使用MEGA6 軟件，對(duì)噬菌體DK?13 做進(jìn)化關(guān)系分析。在GenBank 中BLAST 同源蛋白建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖5 所示，噬菌體DK?13 與大腸埃希菌噬菌體vB_EcoM_VR20 具有較近的親緣關(guān)系。

圖5 噬菌體DK-13 的進(jìn)化關(guān)系分析Fig.5 Phylogenetic analysis of phage DK-13

2.10 噬菌體DK?13在不同溫度下對(duì)污染豬肉殺菌效果的評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)在4℃和37℃的條件下使用噬菌體DK?13處理被EIEC 污染的豬肉樣品。結(jié)果如圖6 所示，在4℃條件下，對(duì)照組的EIEC 數(shù)量在6 h 內(nèi)幾乎沒有變化，實(shí)驗(yàn)組在噬菌體DK?13 的作用下，EIEC 數(shù)量第1 小時(shí)后減少了約1.5 個(gè)數(shù)量級(jí)，隨后保持穩(wěn)定；在37℃條件下，對(duì)照組的EIEC 數(shù)量在6 h 內(nèi)不斷增加，共增長了約2 個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)驗(yàn)組在噬菌體DK?13 的作用下，EIEC 數(shù)量第1 小時(shí)后減少了約1.5個(gè)數(shù)量級(jí)，6 h 后增長了0.5 個(gè)數(shù)量級(jí)。從結(jié)果中可以看出，噬菌體DK?13 在處理被EIEC 污染的豬肉樣品時(shí)，4℃的殺菌效果好于37℃。

圖6 不同溫度下噬菌體DK-13 對(duì)污染豬肉的殺菌效果Fig.6 Sterilization effect of phage DK-13 at different temperatures on contaminated pork

3 討論

食源性疾病是常見的全球公共衛(wèi)生問題，引起腹瀉，腹痛等癥狀，主要因烹飪時(shí)生熟不分，食品保存不當(dāng)或廚師不注意衛(wèi)生所致［17］。EIEC 很容易通過污染的水源和食物進(jìn)行傳播。研究發(fā)現(xiàn)，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌在動(dòng)物源、零售肉制品源及人源等3 種樣本中傳播，且大腸埃希菌耐藥率最高［18］。由于病原體對(duì)食品的污染，食品類行業(yè)每年都遭受巨大損失［19］。噬菌體類生物制劑的出現(xiàn)對(duì)于食品安全的防治起到了重要作用。

噬菌體是地球上最豐富的生物體，約是全球細(xì)菌數(shù)量的10 倍［20］，噬菌體是所有新鮮食物中正常微生物中的一部分，已從各種食物中分離出來并且數(shù)量通常很多［21］。由于常見的食品滅菌法，如巴氏殺菌法和食品高壓加工法等會(huì)影響食品的外觀及營養(yǎng)價(jià)值［22］，且因此噬菌體可被用作食品安全的生物防治劑，且噬菌體具有高度安全性，能夠特異性針對(duì)某些細(xì)菌的感染，并且保留一些食品原有特性和營養(yǎng)價(jià)值［23-25］。Perera 等［26］的研究表明，使用ListShieldTM——一種專門針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的市售噬菌體混合物，處理污染的生菜和煙熏鮭魚等食物后細(xì)菌數(shù)量顯著降低的同時(shí)沒有改變食物的感官特性（包括味覺、視覺和嗅覺）。

本研究從污水中分離一株EIEC 噬菌體DK?13，根據(jù)其透射電鏡形態(tài)及進(jìn)化分析表明是一株新的噬菌體，國際病毒分類委員會(huì)將其歸類為有尾噬菌體目（Caudovirales）肌尾噬菌體科（Myoviridae）T4噬菌體亞科（Tevenvirinae）噬菌體。噬菌體DK?13潛伏期很短（10 min）,暴發(fā)期較短（30 min），暴發(fā)量適中（164 PFU/cell）,表明DK?13 在短時(shí)間內(nèi)就可以開始繁殖，在較短時(shí)間內(nèi)就可完成裂解細(xì)菌的過程，因此在未來的應(yīng)用實(shí)踐中可較快地發(fā)揮作用；DK?13 屬于窄譜噬菌體，與Yuan 等［27］的大腸桿菌噬菌體DY1 同樣特異性較高。一方面專門針對(duì)宿主菌，對(duì)微生物群影響較小，然而另一方面卻限制了噬菌體的治療范圍［28］。因此，未來使用“雞尾酒療法”噬菌體組合可以更廣泛地覆蓋不同種屬的細(xì)菌［29］；DK?13 酸堿耐受性和溫度穩(wěn)定性較強(qiáng)，具有較寬的工作范圍，對(duì)環(huán)境要求低。通過生物信息學(xué)對(duì)DK?13 進(jìn)行全基因組及進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)噬菌體DK?13 與大腸埃希菌vB_EcoM_VR20 進(jìn)化關(guān)系較為相近，同屬T4 樣噬菌體［30］，有功能的編碼區(qū)具有一定程度上的一致性，但沒有明顯的重排。噬菌體DK?13 在4℃下6 h 內(nèi)對(duì)于污染豬肉的EIEC 的殺菌效果比37℃較好。噬菌體可能具有不同的生理特性，在低溫下比高溫更有效，同時(shí)也證明噬菌體能夠顯著降低肉制品中大腸埃希菌的污染［31］。噬菌體DK?13 基因組不存在毒力基因與耐藥基因，用于污染肉制品的防治是安全有效的，未來作為生物防治劑,具有應(yīng)用前景。

當(dāng)前在食品衛(wèi)生防治領(lǐng)域，針對(duì)幾種主要的食源性致病菌，目前已生產(chǎn)出了相對(duì)應(yīng)的噬菌體制劑：一種針對(duì)李斯特的商用單噬菌體制劑可以有效降低切片火腿中李斯特菌的水平，且效果優(yōu)于乳酸鏈球菌素和乳酸鈉［32］；另一種針對(duì)志賀氏菌的噬菌體雞尾酒制劑ShigaShieldTM可以將生菜、雞胸肉和鮭魚等食物中志賀氏菌的水平顯著降低［33］。然而，仍需確定噬菌體對(duì)人體的作用及影響，對(duì)其生物學(xué)特性，免疫特性及基因分析進(jìn)行更深層次的探究。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在未來噬菌體將很快被用于食品安全的防治［34］。

4 結(jié)論

從醫(yī)院污水中新分離的EIEC 噬菌體DK?13，裂解性強(qiáng)，特異性強(qiáng)，對(duì)溫度及酸堿穩(wěn)定性良好，在污染的豬肉樣品中具有較好的殺菌效果。