玉米野生種基因組研究進(jìn)展及應(yīng)用

胡伊娃 陳露

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院作物科學(xué)研究所，杭州 310058）

玉米（Zea mays ssp.mays）的野生近緣種，被統(tǒng)稱(chēng)為大芻草（teosinte）。大芻草主要包括5 個(gè)種，7 個(gè)亞分類(lèi)群，具體可以分為小穎大芻草（Zea mays ssp.parviglumis, 下述parviglumis； Zea mays ssp.hue?huetenangensis，下述huehuetenangensis），墨西哥大芻草（Zea mays ssp.mexicana，下述mexicana），多年生大芻草（Zea diploperennis，下述diploperennis），四倍體多年生大芻草（Zea perennis，下述perennis），繁茂大芻草（Zea luxurians，下述luxurians），尼加拉 瓜 大 芻 草（Zea nicaraguensis，下 述nicaraguen?sis）［1-4］。這7 種大芻草和栽培玉米一起，構(gòu)成了玉蜀黍?qū)伲╖ea genus）。據(jù)報(bào)道，目前僅有多年生大芻草perennis 是四倍體，其他的大芻草和栽培玉米都是二倍體，擁有10 對(duì)染色體［5-6］。雖然僅分布在墨西哥和中美洲這一狹小的地域，但大芻草擁有對(duì)多種環(huán)境的適應(yīng)能力，在炎熱潮濕的低地、溫暖干旱的山谷等地域都可以生存［7-8］。如nicaraguensis 和luxurains 可以適應(yīng)頻繁的降雨天氣，并進(jìn)化出了獨(dú)特的抗?jié)承誀钊绺低饨M織［9］。mexicana 可以生活在海拔2 500 米以上的高原地區(qū)，極端地耐寒冷和干旱。huehuetenangensis 高達(dá)5 米以上，生物量巨大。而多年生大芻草perennis 和diploperennis 則擁有玉蜀黍?qū)倨渌锓N不具備的抗性，如對(duì)獨(dú)角金屬植物（Striga ssp.）的抗性［10］。

自～9 000 年前，從來(lái)自墨西哥西南部巴爾薩斯河流域的parviglumis 中馴化之后，玉米一直被認(rèn)為是馴化得最為完全的作物［11-13］。在快速的馴化過(guò)程中，玉米不僅在形態(tài)和生殖器官上與大芻草發(fā)生了巨大的分化，在分子水平上也發(fā)生了明顯的變化［14-16］。由于馴化瓶頸的作用，現(xiàn)代玉米已經(jīng)丟失了大量的遺傳多樣性，包括大量對(duì)生物和非生物脅迫的抗性基因，缺乏應(yīng)對(duì)氣候變化的有利突變［8,17-18］。對(duì)大芻草的深入認(rèn)知，挖掘大芻草中的有益位點(diǎn)，是未來(lái)氣候變化下保證玉米穩(wěn)定生產(chǎn)的關(guān)鍵途徑之一。本文主要綜述了大芻草的基因組進(jìn)化、數(shù)量遺傳學(xué)、群體遺傳學(xué)等方面的研究進(jìn)展，同時(shí)對(duì)大芻草在未來(lái)玉米遺傳育種中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 玉蜀黍?qū)俚难莼瘹v史

1.1 栽培玉米的起源

作為重要的經(jīng)濟(jì)作物和遺傳學(xué)研究的模式物種之一，栽培玉米的起源一直是人們所關(guān)注的內(nèi)容［19-20］。由于獨(dú)特的形態(tài)特征，林奈最早在1753年將栽培玉米單獨(dú)分成一個(gè)屬。隨著對(duì)大芻草的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)觀察，以及與不同物種的雜交實(shí)驗(yàn)等，科學(xué)家們?cè)谏蟼€(gè)世紀(jì)的百年間對(duì)玉米起源于哪個(gè)地方、在何時(shí)、由哪種物種進(jìn)化等問(wèn)題提出了諸多的猜想。最具代表性的觀點(diǎn)是以Mangelsdorf 為代表的雜交起源和以Beadle 為代表的單組起源［11,21-28］。具體包括：大芻草來(lái)自玉米和摩擦禾的自然雜交事件；新類(lèi)型的玉米直接或間接來(lái)自于玉米和大芻草的雜交后代；栽培玉米起源于一種野生的爆裂玉米；玉米來(lái)自對(duì)野生大芻草mexicana 的逐漸選擇；玉米來(lái)源于大芻草的瞬間革命性的變化。

隨后，基于考古學(xué)、染色質(zhì)結(jié)的組成、5S/45S rDNA 等比較結(jié)果，科學(xué)家們確認(rèn)了玉米起源于一年 生 大 芻 草parviglumis 或mexicana［29-31］。在 這 個(gè)時(shí)期，由于玉米和不同大芻草之間可以自由的雜交，且雜交后代在很多種情況下都是可育的，在玉米起源的具體大芻草類(lèi)型上仍然存在一定的爭(zhēng)論［25,28,32-34］。此外，墨西哥本地玉米主要與mexicana 生活在相同的地域，在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里，科學(xué)家們更傾向mexicana 是玉米的直系祖先，許多的比較分析實(shí)驗(yàn)也是以mexicana 作為對(duì)照。直到2002 年，Matsuoka 等［12］利用99 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)193 份廣泛分布的玉米、33 份mexicana、34 份parviglumis 和4 份huehuetenangensis（作為外群）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)分析，證實(shí)了現(xiàn)代玉米單一起源于parviglumis。隨著玉米考古學(xué)的進(jìn)展、分子標(biāo)記的增多，研究者發(fā)現(xiàn)玉米在沒(méi)有被完全馴化之前，半馴化的本地種就已經(jīng)引入了北美洲各地，再經(jīng)亞馬遜西南部的二次改良之后，逐漸擴(kuò)散到南美洲［35］。在這個(gè)擴(kuò)散的過(guò)程中，栽培玉米與mexicana 發(fā)生著持續(xù)的基因滲透［36-39］，二者可能在距今6 000 年前發(fā)生了一次雜交事件，進(jìn)一步豐富了玉米的遺傳多樣性，促進(jìn)了玉米向其他地域的傳播［40］，最終使得玉米遍布全球。

1.2 大芻草的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

大芻草的正式分類(lèi)始于1980 年，Iltis 和Doebely 根據(jù)大芻草的地理分布、形態(tài)特征、細(xì)胞學(xué)觀察等，將大芻草劃分成了兩組：繁茂組（Sect.Luxuriantes）和玉蜀黍組（Sect.Zea）。繁茂組中包括luxurians、perennis 和diploperennis，玉蜀黍組中包 括huehuetenangensis、mexicana、parviglumis 和 栽培玉米［1］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及其他大芻草（如nicaraguensis）的發(fā)現(xiàn)，研究者又利用同工酶、葉綠體DNA、微衛(wèi)星標(biāo)記、少量的SNPs 等，對(duì)大芻草的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)的推測(cè)［8,41-43］。例如，在基于93 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，237 份大芻草的研究中，Doebley 等［4］發(fā)現(xiàn)nicaraguensis 與luxurians 的距離最近，且luxurians 與多年生大芻草（diploperennis、perennis）是作為姐妹種存在的。而在利用1 000 個(gè)SNPs 標(biāo)記，對(duì)大芻草的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析時(shí)，則將多年生大芻草（perennis、diploperennis）與抗?jié)炒笃c草（nicaraguensis、luxurians）放置在了不同分枝上，并認(rèn)為抗?jié)炒笃c草最先與摩擦禾分化［2］。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展，通過(guò)對(duì)237 份大芻草（包括所有的已知亞群）的全基因組深度重測(cè)序（～20x），研究者確定了抗?jié)炒笃c草luxurians 最早分化出來(lái)，隨后才是多年生大芻草的分化。此外，對(duì)不同大芻草分化時(shí)間的推斷顯示，luxurians 和perennis 的分化時(shí)間非常近，這也解釋了為什么基于低密度標(biāo)記進(jìn)行大芻草系統(tǒng)發(fā)育的推斷時(shí)，不同的研究結(jié)果存在一定的差異［44］。

2 大芻草與玉米的差異

2.1 大芻草與玉米的性狀差異

成熟大芻草和玉米之間的形態(tài)差異巨大，在側(cè)枝數(shù)、分蘗數(shù)、每株穗數(shù)、每穗粒數(shù)和籽粒大小等性狀方面都顯示出強(qiáng)烈的人工選擇效應(yīng)［45-47］。在地上部分，大芻草具有多個(gè)分枝且葉片較窄，而玉米則只有一個(gè)主枝。在雌性花序上，玉米擁有都會(huì)發(fā)育成功的成對(duì)小穗，而大芻草中的第二個(gè)小穗則不會(huì)發(fā)育。此外，大芻草的雌穗只有兩行，玉米則擁有多行排列的雌穗。在籽粒上，玉米的籽粒附著在粗壯的軸上，但是大芻草的籽粒則附著在脆弱的小梗上。而且，大芻草的每一個(gè)籽粒都由堅(jiān)硬的外層穎片所包裹，但是玉米的籽粒則裸露在苞葉之下［45］。這些性狀的變化也使得大芻草從野生的自我繁殖狀態(tài)變成了需要人類(lèi)維護(hù)的作物。除了對(duì)籽粒大小的改良，馴化也對(duì)籽粒的組成成分進(jìn)行了選擇。雖然大芻草的籽粒較小，但是其蛋白、油分含量都比玉米更高［17］。除了上述地上性狀之外，在對(duì)玉米和大芻草地下根系性狀（在水分、營(yíng)養(yǎng)元素的吸收上起著重要作用）進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，大芻草側(cè)根的分枝、種子根更少，中柱和維管束的面積更?。?8-49］，根系微生物成分也與玉米不同［50］。

作物的馴化過(guò)程不但改變了植物自身，也改變了作物與昆蟲(chóng)、病原菌等之間的互作關(guān)系。例如，對(duì)大芻草（parviglumis, mexicana）、墨西哥玉米、美洲玉米材料上的1 088 份Ustilago maydis（玉米黑穗病菌，一種玉米的專(zhuān)性真菌病原體）菌株個(gè)體進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，大芻草與玉米擁有不同的U.maydis 類(lèi)群［51］。對(duì)大芻草和玉米籽粒中的內(nèi)生菌（生活在植物體內(nèi)的非病原微生物）進(jìn)行分離也發(fā)現(xiàn)，兩者籽粒中內(nèi)生菌的類(lèi)型也不同［52］。此外，馴化過(guò)程也改變了玉米受到節(jié)肢食草動(dòng)物攻擊時(shí)候的響應(yīng)。研究顯示，歐洲玉米在受到Diabrotica virgifera 害蟲(chóng)（入侵歐洲的玉米害蟲(chóng)）幼蟲(chóng)捕食的時(shí)候，其地下部分會(huì)釋放一種植物信號(hào)E-β 石竹烯，該信號(hào)會(huì)吸引一種昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)，以此來(lái)抵御D.virgifera 的攻擊。這種信號(hào)在大芻草和歐洲玉米中都會(huì)釋放，但在美洲玉米中則不會(huì)被釋放［53］。

2.2 大芻草與玉米的基因組差異

理解物種間的差異對(duì)于作物改良具有重要意義。在植物中，存在多種導(dǎo)致遺傳多樣性的變異機(jī)制。如點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異、插入和缺失變異等［54］。此外，DNA 甲基化也會(huì)獨(dú)立于基因組突變，影響植物的性狀［55-56］。了解玉米與大芻草在基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組等多個(gè)方面的差異，對(duì)于形態(tài)學(xué)性狀、抗性、適應(yīng)性等位點(diǎn)的挖掘具有重要作用。轉(zhuǎn)座子是導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變異的重要因子，其可以插入到基因組的各個(gè)地方，影響基因表達(dá)和性狀的改變［57-58］。在玉米基因組上，85%以上的序列都是轉(zhuǎn)座子［59-60］，這些轉(zhuǎn)座子不但影響著玉米和大芻草的基因組大?。?1-62］，也貢獻(xiàn)于玉米的性狀變化［63-64］。早在20 世紀(jì)90 年代，研究者們就探索特定基因附近功能性轉(zhuǎn)座子在玉米和大芻草中的差異發(fā)現(xiàn)，LINE 轉(zhuǎn) 座 子［65］、Bg 轉(zhuǎn) 座 子［66］、Hbr?hm1 轉(zhuǎn) 座 子在玉米和大芻草上的拷貝數(shù)差不多，但是Mu 轉(zhuǎn)座子、LTR 轉(zhuǎn)座子在大芻草和玉米上的差別則十分大［67-68］。近期基于重測(cè)序的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，大芻草和現(xiàn)代玉米在不同轉(zhuǎn)座子的構(gòu)成上具有顯著差異。例如，Zea mays 中的T3 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子含量較其他玉蜀黍?qū)傥锓N顯著降低，多年生大芻草diploperennis 和perennis 中則DNA 轉(zhuǎn)座子升高［44］。除了轉(zhuǎn)座子序列本身的差異之外，玉米和大芻草轉(zhuǎn)座子的甲基化模式也存在明顯的差異［69］。

除了轉(zhuǎn)座子之外，其他類(lèi)型的變異也在大芻草的環(huán)境適應(yīng)性中起著重要作用。在結(jié)構(gòu)變異上，對(duì)大芻草（mexicana）和玉米F1雜交后代的重組比例進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，有些染色體上的重組比例非常低［32］，如9 號(hào)染色體的末端，Beadle 猜測(cè)這個(gè)區(qū)域可能是倒位［26］。后續(xù)的細(xì)胞學(xué)觀察［70-72］、群體標(biāo)記的分析研究也表明，mexicana 和現(xiàn)代玉米相比確實(shí)在9 號(hào)染色體上存在超過(guò)20 Mb 的倒位。且這個(gè)倒位在mexicana 的開(kāi)花、高原土壤等的適應(yīng)上都起著重要作用［44,72-74］。在基因上，雖然大芻草和玉米95%左右的基因都是保守存在的［75］，但是馴化過(guò)程影響了基因之間表達(dá)及互作關(guān)系［14］、改變了其長(zhǎng)鏈非編碼RNA［76］和miRNA 的演化模式［77］，減少了玉米基因組中的調(diào)控元件［78］、使得玉米在面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)的可塑性更低［79］。

3 大芻草在玉米遺傳學(xué)上的應(yīng)用

3.1 玉米表型變異數(shù)量性狀位點(diǎn)的鑒定

玉米從其野生祖先的馴化是進(jìn)行作物馴化、基因組進(jìn)化、對(duì)選擇響應(yīng)研究的模式系統(tǒng)。Beadle 和Doebley 等也基于雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玉米在馴化過(guò)程中主要有5（6）個(gè)基因作用［80-82］。具體包括1 號(hào)染色體長(zhǎng)臂上與植株形態(tài)相關(guān)的數(shù)量性狀控制位點(diǎn)（quantitative trait loci, QTL; tb1），2 號(hào)染色體短臂上與雌穗的行數(shù)相關(guān)的QTL（zfl2），4 號(hào)染色體上與穎殼相關(guān)的QTL（tga1），1 號(hào)染色體短臂、3 號(hào)長(zhǎng)臂、5 號(hào)長(zhǎng)臂上與多種性狀相關(guān)的QTLs［46］。為了探索玉米馴化及表型變異的遺傳調(diào)控機(jī)制，Doebley 和Stec 在1991 年將玉米農(nóng)家種與mexicana 進(jìn)行雜交，通過(guò)調(diào)查F2群體的12 種形態(tài)學(xué)相關(guān)性狀（如落粒性、分枝數(shù)、穎殼硬度等），獲得了64 個(gè)控制這些性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)［83］。隨后的30 年間，研究者也通過(guò)雜交不同的玉米自交系與大芻草（主要是parviglumis），構(gòu)建F2群體或回交（back cross, BC）群體，對(duì)植株形態(tài)、雌穗形態(tài)、雄穗形態(tài)、籽粒組成成分、籽粒形態(tài)、開(kāi)花期、根系數(shù)目與解剖結(jié)構(gòu)、抗?jié)?、多年生、病害等相關(guān)性狀等進(jìn)行了QTL 定位（表1），獲得了超過(guò)1 600 個(gè)QTL 位點(diǎn)，為玉米性狀變異分子基礎(chǔ)的解析打下了良好的基礎(chǔ)。

除了使用傳統(tǒng)的QTL 定位方法，即自上而下方法（top?down approach），從表型出發(fā)，通過(guò)構(gòu)建分離群體鑒定調(diào)控表型變異的關(guān)鍵基因之外。近年來(lái)也有很多研究，采用了自下而上的策略（bottom?up approach），利用大芻草野生群體的多樣性，通過(guò)群體基因組掃描鑒定具有選擇信號(hào)的區(qū)域，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因與功能注釋的方法，挖掘大芻草中與馴化、適應(yīng)性等表型相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)［36-38,44,111-113］。

3.2 玉米表型變異關(guān)鍵基因鑒定

為了利用玉米-大芻草群體挖掘調(diào)控玉米表型變異的關(guān)鍵基因，研究者還對(duì)具體性狀所在的QTL進(jìn)行了進(jìn)一步的精細(xì)定位（表2）。基于這種策略，Doebley 等［114］在1995 年成功定位到了可以抑制側(cè)枝生長(zhǎng)的tb1（teosinte branched1）基因，并在之后發(fā)現(xiàn)tb1 的功能位點(diǎn)是位于該基因上游58.7-69.5 kb范圍內(nèi)的 Hopscotch 轉(zhuǎn)座子［63］。由于Hopscotch 的插入，玉米得以從大芻草的多分枝變成只有一個(gè)主枝。針對(duì)玉米和大芻草的形態(tài)學(xué)差異，后續(xù)Doebley團(tuán)隊(duì)又克隆到了控制籽粒裸露的tga1（teosinte glume architecture）［115］，控制繁殖率的gt1（grassy tillers1）［116］以及控制開(kāi)花的zgal1（Zea Agamous?like）［117］、ZmCCT10［118］。同時(shí)，田豐團(tuán)隊(duì)克隆到了控制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的gl15（glossy15）［119］以及控制葉夾角的UPA1（Upright Plant Architecture1）和UPA2［120］，楊小紅團(tuán)隊(duì)克隆到了控制穗行數(shù)的KRN2（kernel row number2）［121］。針對(duì)開(kāi)花期相關(guān)性狀，田豐團(tuán)隊(duì)也克隆了控制開(kāi)花期的ZCN8（Zea mays CENTRORADIALIS8）［122］、ZmMADS69（MADS?box transcription factor69）［123］和ZmCCT9［64］。另外，越來(lái)越多的研究也發(fā)現(xiàn)了可用于現(xiàn)代玉米遺傳改良的、大芻草中的優(yōu)異等位基因，如控制籽粒中蛋白質(zhì)含量的TPH9［124］、醇溶蛋白的pbf1（prolamin?box binding factor1）［125］、控制類(lèi)胡蘿卜素的DXS2［126］，控制K+穩(wěn)態(tài)的ZmHKT2［127］，具有廣譜抗病性的ZmMM1［128］。

表2 玉米-大芻草群體精細(xì)定位到的關(guān)鍵基因Table 2 Fine-mapped key genes in maize-teosinte population

4 展望

栽培玉米狹窄的遺傳基礎(chǔ)是制約高產(chǎn)、抗性玉米新品種選育的重要因素［129］。大芻草可以作為重要的遺傳資源，使得育種家能通過(guò)引入近緣物種的等位基因來(lái)改良現(xiàn)代玉米［130］。然而，當(dāng)前對(duì)大芻草遺傳多樣性的挖掘，主要集中在玉米直系祖先parviglumis 及其姐妹種mexicana 上的幾個(gè)有限單株上，對(duì)大芻草全部遺傳多樣性的利用還非常滯后。隨著一些大芻草親本定位群體的開(kāi)發(fā)，這個(gè)問(wèn)題可能會(huì)有一定的改善［88］。此外，目前對(duì)其他大芻草特性的認(rèn)知仍然非常少，極大地忽略了其他大芻草在玉米遺傳學(xué)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐上的潛在應(yīng)用價(jià)值。例如，diploperennis 具有超強(qiáng)的體細(xì)胞再生能力［131］，luxurians 可以作為良好的青貯飼料［132］。更重要的是，進(jìn)一步的野外考察又報(bào)道了一些新的、形態(tài)和分布上與上述7 個(gè)大芻草具有顯著差異的物種。例如2011 年于墨西哥的Nayarit、Michoacan、Oaxaca發(fā)現(xiàn)的3 種大芻草［133］，2013 年于哥斯達(dá)黎加的Murcielago 群島上發(fā)現(xiàn)的Zea vespertilio［134］。值得注意的是，這些物種的群體非常小，并且棲息地還受到人類(lèi)活動(dòng)的威脅。未來(lái)作物的遺傳資源的保護(hù)應(yīng)該不局限于作物本身，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)已有野生資源的保護(hù)及未知野生種質(zhì)資源的考察與鑒定。隨著高通量組學(xué)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在多個(gè)水平解析植物基因組的特征也變得越來(lái)越容易。伴隨著越來(lái)越多大芻草基因組的發(fā)表［124,135］，基因功能驗(yàn)證方法飛速發(fā)展［136］，大芻草轉(zhuǎn)基因平臺(tái)的建立［137］，大芻草中有利位點(diǎn)的快速發(fā)掘?qū)⒏鼮楹?jiǎn)單。野生種質(zhì)資源的解析，馴化前優(yōu)異等位基因的發(fā)掘與利用，將加速適應(yīng)性玉米新品種的培育進(jìn)程。