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    基于指紋圖譜、量值傳遞及化學(xué)計(jì)量學(xué)的薏苡竹葉散質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2024-04-17 07:37:56王野諶邱智東張衍旭王儷穎王茂旭董雪蓮
    應(yīng)用化學(xué) 2024年3期
    關(guān)鍵詞:淡竹葉連翹飲片

    王野諶 邱智東 張衍旭 王儷穎 王茂旭 董雪蓮

    (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 長(zhǎng)春 130117)

    薏苡竹葉散(Yiyi-zhuye powder, YZP)出自清代吳鞠通所著《溫病條辯》,由薏苡仁、淡竹葉、飛滑石、豆蔻仁、連翹、茯苓和通草7 味藥材組成,具辛涼解表、淡滲利濕之功,是除溫濕之名方,吳鞠通稱(chēng)其為“雙解表里之妙法”[1]。現(xiàn)代臨床主要用于治療濕疹、蕁麻疹、手足口病和帶狀皰疹等疾病[2-4]。散劑指由藥材或藥材與適宜輔料粉碎后混勻得到的干燥粉末狀制劑,是中醫(yī)重要傳統(tǒng)劑型之一[5],《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有述: “散者散也,去急病用之”,具有起效快、效果顯著和制作方法簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)勢(shì),至今仍被廣泛應(yīng)用[6-7]。但由于散劑劑型原始、制劑工藝粗糙,加之研究基礎(chǔ)薄弱、研究進(jìn)展緩慢,散劑的現(xiàn)代發(fā)展與傳承舉步維艱[8-10]。

    目前,有關(guān)YZP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究相對(duì)較少且對(duì)其臨床應(yīng)用的研究占絕大多數(shù)[3],缺乏整體的指紋圖譜、含量測(cè)定以及制劑工藝研究,因此為了促進(jìn)YZP 復(fù)方的開(kāi)發(fā)應(yīng)用,通過(guò)查閱古籍文獻(xiàn)確定YZP 的處方劑量和制備工藝,采用高效液相色譜(HPLC)法開(kāi)展YZP指紋圖譜和含量測(cè)定研究,探究葒草苷、異葒草苷在淡竹葉飲片-YZP 復(fù)方的量值傳遞規(guī)律,并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)闡明15 批YZP 的整體質(zhì)量和差異性成分,初步建立YZP質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),以期為YZP后續(xù)制劑研究與開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器和試劑

    Agilent 1260 型高效液相色譜儀(HPLC,美國(guó)安捷倫科技有限公司);EL204 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);MS105型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-500B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);ZN-20L型小型粉碎機(jī)(北京中科耐馳技術(shù)有限公司)。

    連翹苷對(duì)照品(批號(hào): 110821-202117,純度94.9%)、連翹酯苷A 對(duì)照品(批號(hào): 111810-202108,純度96.2%)和異葒草苷對(duì)照品(批號(hào): 111974-201401,純度98%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;葒草苷對(duì)照品(批號(hào): G11N11L130730,純度98%)、牡荊素(批號(hào): M12GB14216,純度98%)和異牡荊素(批號(hào): 27GB165516,純度98%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher scientific公司);磷酸為分析純,購(gòu)自于天津市永大化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

    YZP 中所涉及到的飲片均購(gòu)自于各主產(chǎn)地,飲片的批號(hào)、產(chǎn)地等相關(guān)信息見(jiàn)表1。經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定: 薏苡仁為禾本科植物薏米Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen(Roman.)Stapf 的干燥成熟種仁; 淡竹葉為禾本科植物淡竹葉Lophatherum gracileBrongn 的干燥莖葉;飛滑石為硅酸鹽類(lèi)礦物滑石族滑石經(jīng)水飛法炮制后的粉末; 豆蔻仁為姜科植物白豆蔻Amomum kravanh Pierre exGagnep. 的干燥成熟果實(shí); 連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.) Vahl 的干燥果實(shí); 茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核;通草為五加科植物通脫木Tetrapanax papyrifer(Hook.) KKoch的干燥莖髓。

    表1 YZP中飲片產(chǎn)地來(lái)源及批號(hào)Table 1 Origin and batch number of YZP Chinese decoction pieces

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 YZP制備工藝考證

    《溫病調(diào)辯》[1]中記載薏苡竹葉散用法用量為: “薏苡五錢(qián),竹葉三錢(qián),飛滑石五錢(qián),白蔻仁一錢(qián)五分,連翹三錢(qián),茯苓塊五錢(qián),白通草一錢(qián)五分,共為細(xì)末,每服五錢(qián),日三服”。經(jīng)查閱《中國(guó)科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》[11]、《中國(guó)歷代度量衡單位量值表及說(shuō)明》[12]等書(shū)籍文獻(xiàn)后確定,清代一錢(qián)約為今之3.73 g,一分約合0.373 g。

    細(xì)末在古代口服散劑中應(yīng)用較多,張仲景《傷寒論》中五苓散原方粉碎粒度為“為細(xì)末”[13],2020 版《中國(guó)藥典》中粉末粒度被分為最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉、最細(xì)粉和極細(xì)粉6 個(gè)規(guī)格,其中五苓散制法為“粉碎成細(xì)粉,過(guò)篩,混勻,分裝”。因此,根據(jù)古今對(duì)照建議原方中“細(xì)末”采用2020 版《中國(guó)藥典》中細(xì)粉規(guī)格,即過(guò)六號(hào)篩(150 μm)。

    綜上所述,最終確認(rèn)YZP現(xiàn)代制備工藝為: 薏苡仁18.65 g,淡竹葉11.19 g,飛滑石18.65 g,豆蔻仁5.595 g,連翹11.19 g,茯苓18.65 g,通草5.595 g,粉碎后過(guò)六號(hào)篩(150 μm)篩,即得。

    1.2.2 指紋圖譜測(cè)定方法

    1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

    精密稱(chēng)取連翹苷、連翹酯苷A、葒草苷、異葒草苷、牡荊素和異牡荊素對(duì)照品適量,加入80 %甲醇溶液分別制成濃度為86.52、30.02、62.34、49.33、89.89和74.36 μg/mL的單一對(duì)照品溶液。

    1.2.2.2 供試品溶液的制備

    精密稱(chēng)取5.0 g YZP 樣品(S15),精密加入30 mL 80%甲醇,超聲處理30 min(500 W,40 kHz),冷卻至室溫后補(bǔ)足重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,過(guò)0.45 μm的微孔濾膜,即得。

    1.2.2.3 各單味飲片溶液的制備

    分別精密稱(chēng)取YZP樣品(S1)中各單味飲片,即薏苡仁18.65 g,淡竹葉11.19 g,飛滑石18.65 g,豆蔻仁5.595 g,連翹11.19 g,茯苓18.65 g,通草5.595 g,精密加入30 mL 80%甲醇,超聲處理30 min(500 W,40 kHz),冷卻至室溫后補(bǔ)足重量,搖勻,濾過(guò),濾液濃縮至5 mL,過(guò)0.45 μm的微孔濾膜,即得。

    1.2.2.4 色譜條件

    色譜柱為Agilent Eclipse SB-C18 色譜柱(4.6×250 mm,5 μm); 流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~20 min,5% A; 20~30 min,5%~10% A; 30~40 min,10%~13% A; 40~60 min,13%~15% A; 60~80 min,15%~16% A; 80~110 min,16%~28% A; 110~130 min,28%~8% A); 流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm; 柱溫為30 ℃; 對(duì)照品及供試品溶液進(jìn)樣量為10 μL。

    1.2.3 葒草苷、異葒草苷含量測(cè)定方法

    1.2.3.1 供試品溶液的制備

    1)淡竹葉飲片: 精密稱(chēng)取2.0 g淡竹葉飲片樣品(S1),置具塞錐形瓶中,精密加入20 mL 60%乙醇,超聲處理30 min(500 W,40 kHz),冷卻至室溫后用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),續(xù)濾液過(guò)0.45 μm的微孔濾膜,即得。

    2)YZP: 精密稱(chēng)取5.0 g YZP樣品(S15),置具塞錐形瓶中,精密加入40 mL 60%乙醇,超聲處理30 min(500 W,40 kHz),濾過(guò),容器洗滌3 次,合并溶液,蒸干,精密加入5 mL 60%乙醇溶解,過(guò)濾,續(xù)濾液過(guò)0.45 μm的微孔濾膜,即得。

    1.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)取葒草苷、異葒草苷對(duì)照品,加入60%乙醇定容至20 mL,分別制備質(zhì)量濃度為33.20 和64.17 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

    1.2.3.3 陰性樣品溶液的制備

    按處方比例稱(chēng)取各藥材,按照1.2.3.1小節(jié)步驟2)制備不含淡竹葉的陰性樣品溶液。

    1.2.3.4 色譜條件

    色譜柱: Agilent Eclipse SB-C18(4.6×250 mm,5 μm); 流動(dòng)相: 乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~7 min,8% A;7~17 min,8%~13% A; 17~30 min,13%~15% A; 30~45 min,15%~18% A; 45~50 min,18%~8% A; 50~56 min,8% A); 流速: 0.8 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng): 360 nm; 柱溫: 30 ℃; 進(jìn)樣量: 10 μL。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 15 批YZP指紋圖譜建立

    2.1.1 相似度評(píng)價(jià)及色譜峰歸屬

    取15批YZP樣品(S1-S15)以及各單味飲片按照1.2.2.2小節(jié)和1.2.2.3小節(jié)方法制備供試品溶液,按照1.2.2.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》軟件進(jìn)行分析,以S1 為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法,經(jīng)多點(diǎn)校正后匹配生成YZP 指紋圖譜,結(jié)果見(jiàn)圖1。21 個(gè)共有峰相似度為0.956~0.995,結(jié)果見(jiàn)表2 和表3,符合指紋圖譜要求,認(rèn)為15 批YZP 化學(xué)構(gòu)成相似。所得薏苡仁、淡竹葉、連翹、豆蔻仁、飛滑石、茯苓和通草各單味飲片圖譜見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,全方中21 個(gè)共有峰多數(shù)來(lái)自于淡竹葉、連翹、豆蔻仁和薏苡仁,而通草、滑石和茯苓3 味飲片色譜峰較少,這可能與飲片成分檢測(cè)特殊性關(guān)有。

    圖1 15批YZP HPLC指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints and control fingerprints of 15 batches of YZP

    圖2 YZP中單味飲片測(cè)定結(jié)果Fig.2 Results of single decoction pieces in YZP

    表2 YZP指紋圖譜相似度值Table 2 Similarity value of YZP fingerprint

    表3 15批YZP指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Similarity evaluation results of 15 batches of YZP fingerprint

    將YZP 指紋圖譜與各對(duì)照品色譜圖比對(duì),以保留時(shí)間是否相近為主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)結(jié)合色譜圖中其它信息,最終指認(rèn)出6 個(gè)成分,分別為9 號(hào)峰(異葒草苷)、10 號(hào)峰(葒草苷)、13 號(hào)峰(牡荊素)、14 號(hào)峰(異牡荊素)、15 號(hào)峰(連翹酯苷A)和20 號(hào)峰(連翹苷)。由于16 號(hào)峰分離度良好且峰面積適宜,因此選擇16號(hào)色譜峰為參照峰,計(jì)算出各共有峰的相對(duì)峰面積值,結(jié)果RSD值在12.2%~133.3%之間,反映不同批次YZP中各成分含量相差較大,質(zhì)量有明顯區(qū)別,具體結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 15批YZP共有峰相對(duì)峰面積Table 4 Common peak-peak area of 15 batches of YZP

    2.1.2 方法學(xué)考察

    2.1.2.1 專(zhuān)屬性考察

    取1.2.2.1 和1.2.2.2 小節(jié)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各10 μL,按1.2.2.4 小節(jié)色譜條件注入高效液相色譜儀測(cè)定,結(jié)果顯示各對(duì)照品峰形良好,分離度較高(R>1.5),理論塔板數(shù)按連翹苷計(jì)不低于5000,表明該方法具有較強(qiáng)的專(zhuān)屬性,結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 YZP指紋圖譜專(zhuān)屬性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of YZP fingerprint

    2.1.2.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取1.2.2.2小節(jié)供試品溶液10 μL,按照1.2.2.4小節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,將22號(hào)峰(連翹酯苷A)作為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值。結(jié)果顯示,RSD值均小于2%(n=6),表明儀器精密度良好。

    重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取1.2.2.2 小節(jié)供試品溶液6 份,精密吸取10 μL 并按照1.2.2.4 小節(jié)色譜條件分別測(cè)定6 次,將22 號(hào)峰(連翹酯苷A)作為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值。結(jié)果顯示,RSD值均小于2%(n=6),表明方法重現(xiàn)性良好。

    穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將1.2.2.2小節(jié)供試品溶液于室溫下放置0、2、4、6、8、12和24 h后,精密吸取10 μL,按照1.2.2.4小節(jié)色譜條件測(cè)定6 次,將22 號(hào)峰(連翹酯苷A)作為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值。結(jié)果顯示,RSD值均小于2%(n=6),表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2 飲片-YZP中葒草苷、異葒草苷含量測(cè)定

    2.2.1 淡竹葉飲片-YZP樣品葒草苷、異葒草苷含量對(duì)應(yīng)關(guān)系

    將15批飲片按照表1排序依次搭配成15批YZP(S1-S15),按1.2.3.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定淡竹葉飲片和YZP樣品的異葒草苷含量,考察淡竹葉飲片-方的質(zhì)量傳遞關(guān)系如公式(1)[14-15]所示:

    結(jié)果見(jiàn)表5 和表6。15 批淡竹葉飲片中葒草苷、異葒草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2156%~0.9923%、0.530%~2.052%,15批YZP中葒草苷、異葒草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.022%~0.112%、0.065%~0.312%,飲片-YZP中葒草苷、異葒草苷轉(zhuǎn)移率為78.41%~119.54%、74.57%~127.96%,葒草苷、異葒草苷從飲片到處方的轉(zhuǎn)移率在平均值±30%范圍內(nèi),未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù),符合相關(guān)規(guī)定,表明樣品的制備工藝穩(wěn)定可靠。

    表5 飲片-YZP樣品葒草苷質(zhì)量傳遞結(jié)果Table 5 The mass transfer results of orientin between decoction pieces and YZP sample

    表6 飲片-YZP樣品異葒草苷質(zhì)量傳遞結(jié)果Table 6 The mass transfer results of isoorientin between decoction pieces and YZP sample

    2.2.2 方法學(xué)考察

    2.2.2.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

    取1.2.3.2 小節(jié)2 種對(duì)照品溶液各10 μL,按照1.2.3.4 小節(jié)色譜條件分別進(jìn)行HPLC 測(cè)定,結(jié)果顯示葒草苷、異葒草苷峰形良好,分離度高(R>1.5),理論塔板數(shù)不低于5000。

    2.2.2.2 線性關(guān)系考察

    1)淡竹葉飲片: 精密吸取濃度為0.5001 和0.4990 mg/mL 的葒草苷、異葒草苷對(duì)照品溶液,加甲醇制成一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,按照1.2.3.4 小節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定峰面積,以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見(jiàn)表7。

    表7 淡竹葉飲片與YZP中異葒草苷線性關(guān)系考察結(jié)果Table 7 Results of isoorientin linear relationship investigation between Lophatheri Herba and YZP

    2)YZP: 精密吸取濃度為0.1227 和0.2466 mg/mL 的葒草苷、異葒草苷對(duì)照品溶液,加甲醇制成一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,按照1.2.3.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定峰面積,以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見(jiàn)表7。

    2.2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

    精密吸取1.2.3.2 小節(jié)對(duì)照品溶液各10 μL,按照1.2.3.4 小節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。飲片和處方中葒草苷、異葒草苷RSD 值分別為0.46%、0.26%(n=6)和0.77%、1.49%(n=6),表明儀器精密度良好。

    2.2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    精密稱(chēng)取淡竹葉飲片和YZP樣品各6份,按1.2.3.1小節(jié)方法制備,依1.2.3.4小節(jié)色譜條件測(cè)定,計(jì)算平均含量及RSD 值。淡竹葉飲片、YZP中葒草苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5971%為0.0720%,RSD 值為0.43%、2.59%; 異葒草苷平均含量分別為1.201%、0.1885%,RSD 值為0.25%、2.94%, 表明該方法重復(fù)性良好。

    2.2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    按1.2.3.1 小節(jié)方法制備溶液,分別在0、2、4、8、12 和24 h 進(jìn)樣,依法測(cè)定,考察樣品穩(wěn)定性。淡竹葉飲片、YZP 中葒草苷峰面積RSD 值為3.06%、2.69%,異葒草苷峰面積RSD 值為3.20%、1.14%,表明供試品溶液在制備24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.2.6 加樣回收率

    1)淡竹葉飲片: 精密稱(chēng)取淡竹葉飲片樣品(S1)樣品0.5 g,共6 份,按1∶1 質(zhì)量比精密加入對(duì)照品,按1.2.3.1小節(jié)方法制備溶液,按1.2.3.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表8和表9。葒草苷平均加樣回收率為99.43%,RSD為1.53%; 異葒草苷平均加樣回收率為96.84%,RSD為0.69%,表明方法準(zhǔn)確性較好。

    表8 葒草苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 8 Spike-and-recovery experiment of orientin

    表9 異葒草苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 9 Spike-and-recovery experiment of orientin

    2)YZP: 精密稱(chēng)取YZP(S15)樣品2.5 g,共6份,按1∶1質(zhì)量比精密加入對(duì)照品,按1.2.3.1小節(jié)方法制備溶液,按1.2.3.4小節(jié)色譜條件測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表8和表9。葒草苷平均加樣回收率為100.53%,RSD為1.60%; 異葒草苷平均加樣回收率為100.68%,RSD為1.16%,表明方法準(zhǔn)確性較好。

    2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

    2.3.1 CA

    將15 批YZP 樣品21個(gè)共有峰峰面積作為15×21階原始數(shù)據(jù)矩陣輸入到Origin 2019b(64 Bit)中,聚類(lèi)方法選擇系統(tǒng)聚類(lèi)分析法,度量標(biāo)準(zhǔn)選擇Euclidean 距離進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明,15 批YZP 被分為A 類(lèi)(1、3-6、9、11、13、14 批)和B 類(lèi)(2、7、12、15 批),說(shuō)明不同批次之間的YZP 間存在質(zhì)量差異。所采購(gòu)的飲片多數(shù)有2 種以上的主產(chǎn)區(qū),因此,由于氣候、土壤、水質(zhì)和采收時(shí)間等因素的不同,藥材的質(zhì)量也良莠不齊[16]。YZP屬B類(lèi)的第2、7、12和15批次中相比于A類(lèi)飲片來(lái)自道地產(chǎn)地的較多,與其它來(lái)源的藥材相比,其質(zhì)量更好,因此推測(cè)道地藥材的種類(lèi)在方劑中所占的比例與復(fù)方整體質(zhì)量密切相關(guān)。

    圖4 15批YZP聚類(lèi)分析(CA)結(jié)果Fig.4 Results of 15 batches of YZP CA

    2.3.2 PCA

    以YZP指紋圖譜21個(gè)共有峰峰面積的15 × 21階原始數(shù)據(jù)矩陣,導(dǎo)入SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析,共得到3 個(gè)主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率82.4%,表明這3 個(gè)主成分能夠體現(xiàn)出大部分信息; 15 批YZP 被劃分為兩類(lèi),印證了聚類(lèi)分析結(jié)論。此外,解釋能力參數(shù)R2x和預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2兩個(gè)值分別為0.885 和0.61,均大于0.5,說(shuō)明模型的穩(wěn)定性高、預(yù)測(cè)能力好[17]。PCA得分圖見(jiàn)圖5。

    圖5 YZP主成分分析(PCA)得分圖Fig.5 PCA score chart of YZP

    2.3.3 OPLS-DA

    將15×21階原始數(shù)據(jù)矩陣輸入SIMCA 14.1中進(jìn)行OPLS-DA,其相關(guān)分析所得圖見(jiàn)圖6。其中,R2x、R2y和Q2值分別為0.629、0.997、0.994,均大于0.5,反應(yīng)模型本身具有較好的預(yù)測(cè)性、穩(wěn)定性[18]。圖6A進(jìn)一步印證了CA 和PCA 的結(jié)論; VIP 值(變量投影重要性值)反應(yīng)每一指標(biāo)對(duì)整體的貢獻(xiàn)度,一般認(rèn)為VIP 值≥1時(shí)具有參考意義[19],另外VIP 值越大,其貢獻(xiàn)率越大,圖6B 中貢獻(xiàn)率由大致小分別為17、5、1、8、9(異葒草苷)、18、16、20(連翹苷)、21和13(牡荊素)號(hào)峰,貢獻(xiàn)率均具有參考意義; 另外,還考察了模型擬合程度,隨機(jī)排列200 次Y矩陣變量進(jìn)行permutation 實(shí)驗(yàn),所得圖見(jiàn)圖6C,結(jié)果顯示R2截距0.358(一般R2<0.4),Q2截距-0.705(一般Q2<0.05),無(wú)過(guò)度擬合的情況[20],適用于YZP 批次間質(zhì)量差異的判別與分析。

    圖6 15批YZP OPLS-DA分析結(jié)果Fig.6 OPLS-DA analysis results of 15 batches of YZP

    OPLS-DA中獲得了貢獻(xiàn)率較大10個(gè)差異性成分,其中包含了連翹苷、連翹酯苷A、異葒草苷和牡荊素等,與其能治療皮膚炎癥性疾病有密切關(guān)系,楊本軍等[21]認(rèn)為連翹苷能夠?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的炎癥具有調(diào)控作用; Sung等[22]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連翹中的連翹酯苷A、連翹苷、松脂醇二葡萄糖苷和連翹脂素4個(gè)成分通過(guò)抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞TARC、MDC和RANTES的產(chǎn)生進(jìn)而改善過(guò)敏性皮炎; Shi等[23]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)直接靜脈注射異葒草苷能夠有更好的提高生物利用度和維持更長(zhǎng)時(shí)間的有效濃度,從而達(dá)到抗炎抗氧化的作用; Zhang等[24]認(rèn)為牡荊素能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞的凋亡,使炎癥因子水平正常化,對(duì)于炎癥治療有很好的療效。

    2.4 供試品溶液制備方法考察

    供試品溶液制備主要考察了不同提取溶劑(60%、80%、100%甲醇和乙醇)、不同提取時(shí)間和不同提取方法(回流30、60 和90 min; 超聲15、30 和45 min)3 個(gè)方面,通過(guò)比對(duì)色譜峰峰形、數(shù)量、峰面積和分離度等,最終認(rèn)為80%甲醇超聲提取30 min不僅提取時(shí)長(zhǎng)適宜、提取方法易操作,而且色譜圖的整體效果最佳。除此之外,還考察了不同供試品溶液濃度,確定加入溶劑量為30 mL,分別稱(chēng)取YZP樣品3.00、5.00 和8.00 g,觀察后確認(rèn)在取樣量為5.00 g時(shí)其峰面積大小與強(qiáng)度適中。

    2.5 色譜條件考察

    通過(guò)DAD檢測(cè)器對(duì)YZP供試品溶液進(jìn)行全波段掃描,在210 nm條件下指紋圖譜信息的完整性和基線平穩(wěn)程度較高,能夠使指紋圖譜信息最大化,同時(shí)也有適宜的色譜峰數(shù)量、峰形和分離度??疾炝瞬煌鲃?dòng)相對(duì)色譜圖的影響,分別為有機(jī)相(甲醇、乙腈)和無(wú)機(jī)相(水、0.05%及0.1%的甲酸水溶液、磷酸水溶液),梯度洗脫后確定流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液。另外,還對(duì)不同流速(0.8 和1.0 mL/min),不同柱溫(30、35和40 ℃),不同進(jìn)樣量(2、5和10 μL)進(jìn)行考察,確定最終條件為“流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣10 μL”。以上研究進(jìn)一步確定了YZP 指紋圖譜分析方法,方法學(xué)驗(yàn)證的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性RSD均小于2%,表明該方法穩(wěn)定可靠。

    2.6 指紋圖譜建立

    本研究建立了YZP 的指紋圖譜,但對(duì)于處方中的礦物藥滑石粉和特殊質(zhì)地藥材通草無(wú)法檢測(cè)到相關(guān)色譜峰,后續(xù)應(yīng)采用液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)探究二者化學(xué)組成及檢測(cè)指標(biāo)。

    滑石粉為硅酸鹽類(lèi)礦物,主要成分為含水硅酸鎂,2020 版中國(guó)藥典中采用了滴定法對(duì)其中的可溶性鈣鎂進(jìn)行含量測(cè)定,除此之外有少量文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)滑石粉的質(zhì)量控制方法,多采用了粉末X射線衍射技術(shù)[25-26],因此YZP中滑石粉的質(zhì)量控制方法需要后續(xù)單獨(dú)建立。

    通草為五加科植物通脫木Tetrapanax papyrifer(Hook.) KKoch 的干燥莖髓,其本身質(zhì)地疏松輕盈,在稱(chēng)量提取過(guò)程中存在體積大、易飛絮、吸水性強(qiáng)等問(wèn)題,導(dǎo)致了含量測(cè)定困難。而2020版中國(guó)藥典中并未建立通草的含量測(cè)定方法,有文獻(xiàn)建立了通草水提液-三氯甲烷萃取部位的超高效液相色譜(UPLC)指紋圖譜[27],因此對(duì)通草的提取方法和測(cè)定方法應(yīng)重新進(jìn)行考察。

    3 結(jié) 論

    采用HPLC 法建立YZP指紋圖譜測(cè)定方法和YZP中葒草苷、異葒草苷含量測(cè)定方法,輔以化學(xué)計(jì)量學(xué)分析篩選出導(dǎo)致組間差異的主要成分,實(shí)現(xiàn)了YZP 的外部質(zhì)量控制及內(nèi)部影響質(zhì)量因素探究,同時(shí)通過(guò)對(duì)淡竹葉飲片-YZP復(fù)方的量值傳遞規(guī)律的把握,進(jìn)一步確定了YZP “外部質(zhì)量控制-內(nèi)部質(zhì)量探究-制備工藝確認(rèn)”的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系,為后續(xù)YZP的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

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