嬰配乳粉中2′-巖藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖含量離子色譜法檢測(cè)

詹勝群 葛 城 周榮杰 周 鈞

（澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司， 長(zhǎng)沙 410200）

母乳低聚糖（HMOs）是一種多功能聚糖，是人乳中的第三大成分［1］，其結(jié)構(gòu)主要由5 種基本單糖組成： 葡萄糖（Glucose， Glc）、半乳糖（Galactose， Gal）、N-乙酰葡糖氨（Nacetylglucosamine， GlcNAc）、巖藻糖（Fucose， Fuc）和N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-Acetylneuraminic acid， NeuAc），通常由半乳糖和葡萄糖與其它一種或多種單糖聚合形成多種結(jié)構(gòu)［2］。HMOs 對(duì)于嬰幼兒的生長(zhǎng)健康有著重要的意義，除了可預(yù)防感染、過(guò)敏以外，還能促進(jìn)腸胃發(fā)育、增強(qiáng)自身免疫、預(yù)防糖尿病和心血管疾?。?-5］等。

作為嬰幼兒主要食物來(lái)源之一的嬰幼兒配方乳粉，早已朝著母乳化的方向發(fā)展，于2017 年歐盟委員會(huì)發(fā)布執(zhí)行決定（EU）2017/2201，授權(quán)批準(zhǔn)以大腸桿菌BL21 產(chǎn)生的2'-巖藻糖基乳糖（2′-FL）作為新型食品成分，授權(quán)2′-FL 粉和液體濃縮物在嬰兒配方奶粉和以及較大嬰兒配方奶粉中使用。我國(guó)在2022 年發(fā)布了國(guó)食評(píng)函［2022］234 號(hào)《國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心關(guān)于征求聚天冬氨酸鉀等11 種食品添加劑新品種相關(guān)意見的函》，其中就包括了HMOs 中含量豐富的2 種寡糖： 2′-FL 和乳糖-N-新四糖（LNnT）。但是截至今日，國(guó)內(nèi)暫時(shí)沒(méi)有規(guī)定針對(duì)嬰幼兒配方乳粉中2′-FL 和LNnT 的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，因此，為保障嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品質(zhì)量，針對(duì)嬰幼兒配方乳粉中這兩種HMOs 建立一種準(zhǔn)確、易復(fù)現(xiàn)的檢測(cè)方法十分必要。

目前，各國(guó)學(xué)者對(duì)于HMOs的測(cè)定均有研究，主要測(cè)定方法有： 高效液相色譜法［6-9］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10-14］和離子色譜法［15-17］等。高效液相色譜法一般搭配紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器，但由于母乳低聚糖紫外吸收能力弱、熒光性差，一般需要先進(jìn)行衍生反應(yīng)［18］才能進(jìn)行檢測(cè)，而且多數(shù)衍生劑存在一定毒害性，且衍生反應(yīng)過(guò)程步驟復(fù)雜。Christensen 等［6］便采用了這種方式對(duì)乳粉中的2′-FL 和3′-FL 進(jìn)行了測(cè)定。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也是分析低聚糖的方法之一，其快速測(cè)定、高靈敏度以及通過(guò)特征碎片進(jìn)行準(zhǔn)確定性使得該方法也是HMOs 的熱門方法之一，Mank 等［14］便采用了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了HMOs 和相關(guān)的人乳基團(tuán)。然而，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也有其不足之處，由于低聚糖不耐熱易碳化的特性，在質(zhì)譜離子源脫溶劑和離子傳輸過(guò)程中容易受熱裂解，導(dǎo)致響應(yīng)較差重復(fù)性欠佳。離子色譜法是檢測(cè)糖類常用的方法之一，例如聚葡萄糖、低聚果糖等的國(guó)標(biāo)方法便是采用離子色譜法，美國(guó)分析化學(xué)家族協(xié)會(huì)（AOAC）也收錄采用離子色譜法測(cè)定低聚半乳糖的資料文獻(xiàn)，如AOAC 官方方法2001.02 版：精選食品中反式低聚半乳糖含量的測(cè)定。離子色譜法通過(guò)搭載電化學(xué)檢測(cè)器，利用糖在電極表面的氧化還原反應(yīng)來(lái)從而可以直接對(duì)糖類做出響應(yīng)，避免對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理［19］，因此對(duì)于母乳低聚糖的研究，采用離子色譜法能夠減少操作步驟、降低不確定因素的影響，便于實(shí)驗(yàn)室后續(xù)使用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)嬰幼兒配方乳粉中2′-FL和LNnT的提取方式進(jìn)行比對(duì)探究，并不斷調(diào)整淋洗液比例，從而建立其能夠同時(shí)檢測(cè)2′-FL和LNnT的離子色譜法，方法簡(jiǎn)單便捷，能夠?yàn)閶胗變号浞饺榉壑?′-FL 和LNnT 含量的監(jiān)測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Dionex ICS-6000 型高效離子色譜儀（HPIC，美國(guó)Thermo-Fisher 公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；FE28 型pH 計(jì)、ME204E 型電子天平（美國(guó)METTLER TOLEDO 公司）；CarboPac? PA1 色譜柱（10.0 μm，4×250 mm）及其保護(hù)柱（10.0 μm，4×50 mm）、CarboPac ? PA200 色譜柱 （5.5 μm，3×250 mm）及其保護(hù)柱 （5.5 μm，3×50 mm） （美國(guó)Thermo-Fisher公司）。

亞鐵氰化鉀（K4［Fe（CN）6］，分析純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸鋅（（CH3COO）2Zn，分析純）和氫氧化鈉（NaOH，分析純）購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉（CH3COONa，色譜純）和氫氧化鈉（NaOH，色譜純）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；半乳糖苷酶（8000 Units）、果聚糖酶混合物（20000 Units）購(gòu)自愛爾蘭Megezyme 公司；低聚半乳糖（純度59.8%）、低聚果糖（純度97.0%）購(gòu)自北京量子高科集團(tuán)有限公司；0.22 μm 尼龍濾膜和濾紙購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；25 mL 聚丙烯注射器購(gòu)自德國(guó)CNW公司；去離子水（Milli-Q超純水儀制備）。

標(biāo)準(zhǔn)品： 2′-FL（純度99.3%）、LNnT（純度89.5%）購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；嬰幼兒配方奶粉（市售）。

1.2 分析條件

色譜柱： CarobPac PA1 及其保護(hù)柱。流動(dòng)相： 流動(dòng)相A 為125 mmol/L NaOH 水溶液； 流動(dòng)相B 為250 mmol/L NaOH 水溶液； 流動(dòng)相C 為（150 mmol/L NaOH+500 mmol/L NaAc 水溶液）/%； 流動(dòng)相D 為純水。流速1.5 mL/min，進(jìn)樣量25 μL； 洗脫條件如表1所示； 柱溫為30 ℃。

表1 2種HMOs的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of two HMOs

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

1） 2′-FL（20 mg/mL）、LNnT（10 mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液： 分別稱取20 mg的2′-FL 和10 mg的LNnT 標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水定容至1 mL，避光于4 ℃下保存，有效期30 d。2）再分別吸取適量上述2′-FL 和LNnT的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用去離子水定容，配制成質(zhì)量濃度為： 2′-FL（200 μg/mL）、LNnT（100 μg/mL）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液-A和質(zhì)量濃度為： 2′-FL（20 μg/mL）、LNnT（10 μg/mL）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液-B，臨用現(xiàn)配。3）分別吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作液-B體積0.500、1.000、2.000和3.500 mL和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液-A體積0.500和0.750 mL于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容，配制成2′-FL 質(zhì)量濃度為： 1.0、2.0、4.0，7.0、10.0 和15.0 μg/mL以及LNnT質(zhì)量濃度為： 0.5、1.0、2.0、3.5、5.0和7.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。臨用現(xiàn)配。

1.4 前處理方法

準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.0001 g）試樣，用50 mL不超過(guò)70 ℃的溫水充分溶解，冷卻至室溫后，加入沉淀劑Ⅰ（亞鐵氰化鉀150 g/L）溶液1 mL，搖勻，再加入沉淀劑Ⅱ（乙酸鋅300 g/L）溶液1 mL，搖勻，再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液0.7 mL并搖勻，用純水定容至100 mL容量瓶，靜置20 min后，濾紙過(guò)濾，取濾液過(guò)0.22 μm聚醚砜水相針式濾器凈化，取凈化后的樣液用純水稀釋適當(dāng)倍數(shù)至進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.5 鑒別和測(cè)定

將試樣溶液注入離子色譜儀中，記錄色譜圖。根據(jù)保留時(shí)間定性，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中各組分的質(zhì)量濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

液相模塊控制、數(shù)據(jù)采集和定性定量分析為Chromeleon 7.2.10 ES 軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖形繪制和表格制作采用Excel 2019軟件和WPS Office 2022軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的影響

CarboPac? PA1 和CarboPac? PA200 色譜柱是兩種常用的糖分離柱，本文對(duì)該2 種色譜柱進(jìn)行了比較，分別對(duì)2′-FL 和LNnT 輔料樣液進(jìn)樣25 μL，結(jié)果如圖1 示，雖然PA200 的色譜柱粒徑更小，理應(yīng)靈敏度和分離度更好，但通過(guò)譜圖比較發(fā)現(xiàn)PA1色譜柱在峰形和響應(yīng)上均好于PA200（經(jīng)PA1色譜柱分離后2′-FL 和LNnT 均呈現(xiàn)瘦高狀的峰，而PA200 分離后的峰形峰高不及PA1色譜柱且存在明顯不對(duì)稱的情況），且PA1對(duì)2種低聚糖的保留更強(qiáng)，分離度也更好，除固定相組成差異外這可能也與PA1色譜柱更大的柱容量有關(guān)，故選擇PA1作為分離柱。

圖1 2種色譜柱對(duì)（A）2′-FL和（B）LNnT的分離效果圖Fig.1 The separation effect diagrams of two chromatographic columns for （A） 2′- FL and （B） LNnT

2.2 不同凈化處理的影響

樣液不同的凈化方式對(duì)色譜柱壽命、檢測(cè)器靈敏度以及譜圖基線、色譜峰的位置和響應(yīng)可能有不同程度的影響。本實(shí)驗(yàn)共對(duì)比了沉淀劑法、超濾離心法和pH調(diào)節(jié)法3種去除蛋白質(zhì)的方式。沉淀劑法具體處理過(guò)程為1.4節(jié)中所述，相較之下，超濾離心法主要區(qū)別在于樣品溶解冷卻后不用沉淀劑Ⅰ和沉淀劑Ⅱ沉淀，而是定容到100 mL 后取樣液用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1×104的超濾管在12000 r/min 條件下進(jìn)行30 min 離心處理； pH 調(diào)節(jié)法則是參照國(guó)標(biāo)方法GB 5009.89-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定》，即在溶解和冷卻后50 mL樣液中用鹽酸溶液將pH值先調(diào)節(jié)至1.7±0.1，靜置2 min后再用1 mol/L 的NaOH 溶液將pH 值調(diào)節(jié)至4.5±0.1，考慮到離子色譜淋洗液為堿性，樣液在靜止1 min 后，再繼續(xù)調(diào)至pH=7.0，定容后再在10 000 r/min條件下進(jìn)行10 min離心，該法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)離心后樣液渾濁，故后續(xù)未對(duì)該樣液進(jìn)行上機(jī)分析。通過(guò)對(duì)沉淀劑法和超濾離心法的譜圖對(duì)比，發(fā)現(xiàn)于譜圖2 min處超濾離心法有一響應(yīng)很高的雜峰，雖然對(duì)2′-FL 和LNnT 無(wú)影響，但這說(shuō)明沉淀劑法對(duì)樣液中蛋白質(zhì)的凈化更為徹底，故采用沉淀劑法對(duì)樣液進(jìn)行凈化。

圖2 添加（A）半乳糖苷酶和（B）果聚糖酶的影響Fig.2 Effects of added （A） galactosidase and （B） fructosidase

2.3 酶解的影響

2.3.1 半乳糖苷酶的影響

半乳糖苷酶是一類能水解含半乳糖苷鍵物質(zhì)的酶類，主要包括α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，在前處理過(guò)程中引入半乳糖苷酶酶解可能有助于消除基質(zhì)中乳糖、低聚半乳糖（GOS）等的干擾。選擇一款含有2′-FL 和LNnT 的奶粉樣品，通過(guò)設(shè)置半乳糖苷酶的對(duì)照試驗(yàn)以進(jìn)行考察。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組條件為： 移取充分溶解后的質(zhì)量濃度為0.1 g/mL 的奶液0.2 mL 于10 mL 刻度試管，并添加50 μL 半乳糖苷酶以及1.8 mL 去離子水，60 ℃酶解2 h后，再用去離子水定容至10 mL并稀釋10倍，同時(shí)過(guò)C18固相萃取小柱和0.22 μm 聚醚砜針式濾器（對(duì)照組以等量的去離子水替代半乳糖苷酶）。試驗(yàn)結(jié)果表明： 半乳糖苷酶可酶解2′-FL 峰左側(cè)的乳糖，而對(duì)2′-FL 無(wú)明顯酶解作用。這使得2′-FL 保留時(shí)間處基線高度明顯降低，但對(duì)于LNnT，半乳糖苷酶已將其完全酶解。故對(duì)于同時(shí)測(cè)定乳粉中的2′-FL和LNnT的方法而言，在前處理過(guò)程中用添加半乳糖苷酶的方式消除干擾并不適用，該方式僅對(duì)單獨(dú)測(cè)定乳粉中的2′-FL有效。

2.3.2 果聚糖酶的影響

針對(duì)由β-D-果糖組成的果聚糖，果聚糖酶能特異性催化水解其分子中的β-2，1 或β-2，6 糖苷鍵，此外，還可水解菊糖、蔗糖等。故在前處理過(guò)程中引入果聚糖酶酶解可能有助于消除基質(zhì)中菊粉、低聚果糖（FOS）等的干擾。對(duì)照實(shí)驗(yàn)參照1.4小節(jié)進(jìn)行。區(qū)別之處在于酶解過(guò)程需加入硼氫化鈉和乙酸，且酶解溫度和時(shí)間分別為40 ℃和30 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，果聚糖酶對(duì)2′-FL和LNnT均無(wú)酶解作用，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)LNnT 右側(cè)的23.4 min 處的峰消失，推測(cè)其為果聚糖。故色譜條件優(yōu)化過(guò)程中如發(fā)現(xiàn)果聚糖對(duì)LNnT峰有干擾，則可以在前處理過(guò)程中引入果聚糖酶酶解的方式消除干擾。添加半乳糖苷酶和果聚糖酶的效果見圖2所示。

2.4 稀釋倍數(shù)的影響

奶粉樣液前處理和凈化后雖然能去除大部分蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，但是樣液中可溶性的單糖、雙糖等其他化合物濃度往往較高，離子強(qiáng)度較大，易導(dǎo)致色譜柱過(guò)載，出現(xiàn)基線偏高、分離度較差的情況，故需要對(duì)凈化后的樣液稀釋合適的倍數(shù)以消除影響，同時(shí)保證2′-FL和LNnT有合適的響應(yīng)。對(duì)同一處理后的樣液用去離子水稀釋不同的倍數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果表明稀釋倍數(shù)主要對(duì)2′-FL 峰和其左側(cè)的干擾峰產(chǎn)生影響，在稀釋5和10倍時(shí)，2′-FL 與基線未能完全分離，且峰的基線很高； 稀釋20倍后基線明顯降低，分離度基本可接受； 稀釋50倍時(shí)，基線水平平穩(wěn)，2′-FL峰與基線完全分離，但此時(shí)LNnT響應(yīng)很低，可能已經(jīng)不適合定量，故在兼顧2′-FL的分離度和LNnT的響應(yīng)上，最終樣液的稀釋倍數(shù)在20～50倍內(nèi)較為合適。

2.5 梯度洗脫條件的優(yōu)化

合適的梯度條件是色譜分離和定量準(zhǔn)確的關(guān)鍵。在前述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，未優(yōu)化的洗脫條件下樣品中LNnT的峰并不對(duì)稱，有前伸趨勢(shì)，故推測(cè)LNnT峰中有未分離雜質(zhì)。通過(guò)逐步降低堿的比例對(duì)同一樣液進(jìn)行分離，結(jié)果如圖3 所示，可知降低流動(dòng)相中堿液的比例增加了LNnT 的保留，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了LNnT 峰中確實(shí)有隱藏的雜質(zhì)峰未能完全分離。故在此結(jié)論基礎(chǔ)上繼續(xù)降低堿相的比例，并調(diào)整梯度洗脫時(shí)間和流速等參數(shù)，最終得到表1中的洗脫條件，此條件下的色譜圖如圖4所示，可見優(yōu)化后的梯度洗脫條件下2′-FL 和LNnT 都得到了很好的分離，且LNnT 峰形對(duì)稱，此前在LNnT 右側(cè)緊鄰的某未知果聚糖峰也提前流出至左側(cè)，這也將減小干擾峰對(duì)LNnT的影響。

圖3 降低流動(dòng)相中堿液的比例對(duì)LNnT分離的影響Fig.3 Reducing the effect of the proportion of lye in the mobile phase on LNnT separation

圖4 優(yōu)化后2′-FL和LNnT的分離效果Fig.4 Separation effect of 2′- FL and LNnT after optimization

2.6 線性范圍

合理、合適的工作曲線范圍設(shè)置是準(zhǔn)確定量的前提。本實(shí)驗(yàn)對(duì)2′-FL 和LNnT 分別設(shè)置了7 個(gè)曲線點(diǎn)以考察質(zhì)量濃度與峰面積之間的關(guān)系，并以每次減少一個(gè)范圍上限點(diǎn)的方式考察的線性范圍對(duì)工作曲線斜率、相關(guān)系數(shù)的影響，結(jié)果見圖5，可知，對(duì)于2′-FL，在質(zhì)量濃度范圍0.788～157.5 μg/mL（曲線范圍1）至范圍0.788～36.0838 μg/mL（曲線范圍4）過(guò)程中最小二乘法擬合出的斜率、決定系數(shù)呈增加趨勢(shì)和截距呈減小趨勢(shì)，這說(shuō)明至少在曲線范圍3的質(zhì)量濃度設(shè)置上是偏高的，而曲線范圍4的質(zhì)量濃度設(shè)置是否合理還需進(jìn)行考察； 對(duì)于LNnT，在質(zhì)量濃度范圍0.579～115.8 μg/mL（曲線范圍1）至范圍0.579～11.58 μg/mL（曲線范圍4）過(guò)程中，斜率、決定系數(shù)（R2）和截距與2′-FL 同樣的規(guī)律。故在曲線范圍4 的基礎(chǔ)上，在各自范圍內(nèi)增加了更多的點(diǎn)，最終確定2′-FL 和LNnT 的線性范圍分別為1.0～15.0 和0.5～7.5 μg/mL，此時(shí)線性方程斜率、截距穩(wěn)定，R2＞0.999，工作曲線見圖6。

圖5 （A） 2′-FL和（B） LNnT線性范圍設(shè)置對(duì)工作曲線的影響Fig.5 The effect of setting the linear range of （A） 2'-FL and （B） LNnT on the working curve

圖6 2′-FL和LNnT最終的線性范圍以及線性方程Fig.6 The final linear range of 2'-FL and LNnT and the linear equation

2.7 干擾實(shí)驗(yàn)

GOS是一類由乳糖經(jīng)β-1，4或β-1，6糖苷鍵形成的一般由3～8個(gè)半乳糖分子和1個(gè)葡萄糖殘基組成的低聚糖，F(xiàn)OS 是一類由果糖以β-2，1或β-2，6糖苷鍵連接而成的末端有連接一個(gè)葡萄糖殘基的果糖聚合物，一般聚合度為2～7，GOS和FOS均是多種聚合度不同、含量不一和結(jié)構(gòu)各異的低聚糖混合物，而高效陰離子交換色譜安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD）的分離和測(cè)定是基于這些低聚糖之間羥基解離度的細(xì)微差異和糖分子結(jié)構(gòu)中的羥基在金電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的電流實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，而嬰幼兒配方奶粉中通常都有添加GOS和FOS，并期望達(dá)到具有類似于 HMOs 的益生元功效，故在處理前的樣品中主動(dòng)添加GOS和FOS輔料對(duì)2′-FL和LNnT的分離進(jìn)行干擾，考察色譜方法的穩(wěn)定性和適用性很有必要。如圖7A 所示，通過(guò)3個(gè)不同水平添加GOS，發(fā)現(xiàn)GOS 主要有3 處色譜峰，GOS2和GOS3處在2′-FL 和LNnT峰之間，其中GOS3 的峰雖然未分離且緊鄰LNnT，但是在優(yōu)化后的色譜條件下與LNnT 依舊達(dá)到了基線分離，且在20 μg/mL的質(zhì)量濃度下（相當(dāng)于樣品中含量2.0 g/100 g）響應(yīng)較小，而大多數(shù)樣品中GOS的添加量并不會(huì)超過(guò)該水平，故并不會(huì)對(duì)LNnT的積分定量造成影響。再由圖7B所示，在3個(gè)不同水平添加FOS，發(fā)現(xiàn)FOS主要有2處色譜峰，F(xiàn)OS1出峰較早，F(xiàn)OS2則處于2′-FL和LNnT峰之間，雖然FOS2響應(yīng)較大，但FOS2與2′-FL和LNnT相距較遠(yuǎn)，達(dá)到了完全基線分離，故也不會(huì)對(duì)積分定量過(guò)程造成影響。

圖7 GOS（A）和FOS（B）對(duì)2′-FL和LNnT的分離影響Fig.7 Effect of GOS （A） and FOS （B） on the separation of 2'-FL and LNnT

2.8 方法驗(yàn)證

2.8.1 線性和精密度

線性結(jié)果見圖6。對(duì)同一奶粉樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定以驗(yàn)證方法精密度，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定以驗(yàn)證儀器精密度，根據(jù)GB/T 27417-2017《化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》要求，除2'-FL質(zhì)量分?jǐn)?shù)方法精密度變異系數(shù)（CV）需＜2.0%外，其它項(xiàng)變異系數(shù)需滿足＜2.7%，而由表2 精密度數(shù)據(jù)可知，變異系數(shù)均未超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)要求。

表2 儀器精密度和方法精密度Table 2 Instrument precision and method precision

2.8.2 正確度

正確度采用加標(biāo)回收方式進(jìn)行驗(yàn)證。在奶粉樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，并混合均勻，然后按照本文所建立的分析方法進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，其中2′-FL 的3 個(gè)加標(biāo)水平分別為1.2、0.8 和0.4 g/100 g，LNnT 的3 個(gè)加標(biāo)水平分別為0.6、0.4 和0.2 g/100 g，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表3，可知2′-FL 回收率范圍為95.97%～103.38%，平均回收率為99.60%； LNnT回收率范圍為100.09%～104.01%，平均回收率為102.06%； 結(jié)果均滿足GB/T 27417-2017《化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》對(duì)回收率95%～105%的要求。

表3 加標(biāo)回收結(jié)果Table 3 The result of spiked recovery

2.8.3 檢出限和定量限

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的驗(yàn)證采用“信噪比法”進(jìn)行。即選擇一空白樣品，在前處理過(guò)程中加入接近于LOD和LOQ水平的2'-FL和LNnT參考物質(zhì)，以目標(biāo)分析物峰高為信號(hào)值，與一段噪音的平均高度值之比進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)比值為3時(shí)，該目標(biāo)分析物信號(hào)值對(duì)應(yīng)的添加量為檢出限； 當(dāng)比值為10時(shí)，對(duì)應(yīng)添加量為定量限。結(jié)果表明，2'-FL的LOD為1.5 mg/100 g、LOQ為5 mg/100 g，LNnT的LOD為3 mg/100 g、LOQ為10 mg/100 g。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了嬰幼兒配方奶粉中2′-FL和LNnT這2種母乳低聚糖的HPAEC-PAD，在方法建立過(guò)程中對(duì)諸多影響方法正確性、穩(wěn)定性等的條件進(jìn)行了考察。

在色譜柱對(duì)比中，雖然PA200 的色譜柱粒徑更小，理論上靈敏度和分離度應(yīng)更好，但實(shí)際發(fā)現(xiàn)PA1 色譜柱在峰形和響應(yīng)上均好于PA200。在樣液處理方式上對(duì)比了沉淀劑法、超濾離心法和pH 調(diào)節(jié)法3 種凈化方式，結(jié)果為沉淀劑法對(duì)樣液凈化更為徹底，這對(duì)色譜柱、儀器的維護(hù)均是有利的。在酶解試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)半乳糖苷酶對(duì)乳糖、LNnT 等有酶解作用，而乳糖的酶解反而有利于2′-FL 的測(cè)定，故該酶解方式僅對(duì)有需要單獨(dú)測(cè)定乳粉中的2′-FL 時(shí)有效；而果糖苷酶對(duì)2′-FL 和LNnT 均無(wú)酶解作用，但是對(duì)LNnT 有一定的干擾，如色譜分離時(shí)發(fā)現(xiàn)果聚糖對(duì)LNnT 峰有干擾且優(yōu)化色譜條件又難以分開時(shí)，則可以在前處理過(guò)程中引入果糖苷酶酶解的方式消除干擾。在梯度洗脫條件優(yōu)化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)不斷減低流動(dòng)相中堿液的條件有利于保留和分離，故通過(guò)大量試驗(yàn)得到了一種相對(duì)較優(yōu)的梯度條件，且該條件下2′-FL 和LNnT 分離度良好，在有低聚半乳糖和低聚果糖存在的樣品中也不會(huì)干擾測(cè)定，故前處理中無(wú)需引入果糖苷酶進(jìn)行酶解； 而線性范圍考察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)工作曲線點(diǎn)濃度設(shè)置范圍較高時(shí)線性會(huì)變差、斜率也下降，反復(fù)試驗(yàn)后確定2′-FL 和LNnT 的最佳線性范圍分別為1.0～15.0 和0.5～7.5 μg/mL。

2'-FL 和LNnT 是HMOs 中含量豐富的2 種寡糖，大約占總 HMOs 的35%，目前已有不少機(jī)構(gòu)可以工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)，我國(guó)也已于2022 年發(fā)布了2'-FL 和LNnT 作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種的征求意見函，不少乳企將會(huì)在奶粉配方上迅速跟進(jìn)，而本實(shí)驗(yàn)建立的HPAEC-PAD 將有助于嬰配乳粉企業(yè)對(duì)2′-FL 和LNnT進(jìn)行新產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)以及準(zhǔn)確檢測(cè)，也可為相關(guān)機(jī)構(gòu)起草相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。